藏系绵羊KRT26基因的克隆测序和组织表达分析

为了克隆藏系绵羊KRT26基因序列,并研究其组织表达谱,试验从藏系绵羊皮肤中提取总RNA,用RT-PCR技术克隆KRT26基因,并进行了氨基酸序列测定和荧光定量PCR分析。结果表明:获得了1 407 bp的编码区序列,该序列与绵羊KRT26基因的预测序列仅有1个碱基差异,推导的氨基酸序列相同,与牛、人、小鼠KRT26的氨基酸序列相似性依次为94.44%、79.44%和73.32%。KRT26基因在藏系绵羊的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、脂肪、皮肤中均有不同程度表达,但在皮肤的表达量远远高于其他组织,表现出极高的组织特异性。     

欧拉型藏绵羊GHRHR基因部分片段的克隆及多态性研究

对欧拉型藏绵羊生长激素释放激素受体(GHRHR)基因部分片段进行PCR扩增和克隆测序(GenBank Accession No:EU289218),利用BioEdit7.0.9.0、DnaSP 4.10.9和MEGA4.0等生物信息学软件对该部分序列与GenBank中普通牛、瘤牛、水牛相应序列进行比对分析,并对58只欧拉型藏绵羊该基因片段进行SmaI-RFLP研究。结果表明:欧拉型藏绵羊与普通牛、瘤牛、水牛3个物种基因序列间同源性大小依次为92.5%、92.0%、91.5%;4个物种间共发现41处序列间碱基差异(9.65/100 bp),其中藏绵羊与普通牛、瘤牛、水牛3个牛亚科物种均存在差异碱基29处。碱基变异类型主要表现为碱基转换和颠换,少数为碱基插入和缺失。推导的部分氨基酸序列间同源性大小依次为88.8%、88.8%、94.4%。58只欧拉型藏绵羊该基因片段SmaI-RFLP分析均为单态,表现为AA基因型。     

藏绵羊生长激素释放激素基因内含子Ⅱ部分序列的分析

对藏绵羊生长激素释放激素(GHRH)基因内含子Ⅱ部分序列进行了PCR扩增和测序,用Genbank中的Blastn方法与普通牛相应基因序列进行了比对分析。结果表明,藏绵羊与普通牛GHRH基因内含子Ⅱ部分序列间同源性为92%;2个物种该基因内含子Ⅱ部分序列间的碱基变异类型主要表现为碱基转换和颠换,亦存在碱基插入和缺失。     

三个类群藏系绵羊线粒体细胞色素b基因序列多态性及其系统进化的研究

为研究藏系绵羊红原、贾洛、欧拉3个类群的亲缘关系、遗传多样性以及其系统进化,测定该3个类群藏系绵羊的41个个体的细胞色素b基因的全序列。结果表明,41个藏系绵羊的细胞色素b基因的全序列长度均为1 140bp,有27个多态位点,其中单一多态位点16个,简约信息位点11个,共定义13种单倍型,单倍型多样性为0.672±0.078,核苷酸多样性为0.331%。藏系绵羊贾洛类群与欧拉类群遗传距离最远,为0.003 9,红原类群与欧拉类群遗传距离较近,为0.002 64。说明红原类群与欧拉类群亲缘关系较近,藏系绵羊有一个共同祖先,同时存在第2个母系起源。     

草地藏系绵羊心脏脂肪酸结合蛋白基因第二内含子的克隆和测序

采用PCR技术对草地藏系绵羊心脏脂肪酸结合蛋白基因第2内含子进行了扩增，扩增产物经克隆和测序显示，其长度为1893bp，该基因片段与GenBank中普通绵羊和猪的H—FABP基因第2内含子分别有99％和66．4％的同源性。实验还对22只草地藏系绵羊H—FABP基因第2内含子中174bp的序列进行了PCR—SSCP分析，结果未检测到多态性。     

草地藏系绵羊心脏脂肪酸结合蛋白基因第二内含子的克隆和测序

采用PCR技术对草地藏系绵羊心脏脂肪酸结合蛋白基因第2内含子进行了扩增,扩增产物经克隆和测序显示,其长度为1 893bp,该基因片段与GenBank中普通绵羊和猪的H-FABP基因第2内含子分别有99%和66.4%的同源性。实验还对22只草地藏系绵羊H-FABP基因第2内含子中174 bp的序列进行了PCR-SSCP分析,结果未检测到多态性。     

草地藏系绵羊mtDNA D-Loop区多态性分析

文章研究了草地藏系绵羊mtDNA D-Loop区多态性,获得了草地藏系绵羊mtDNA D-Loop区全长序列信息,这一区段的DNA长度为1 179～1 183 bp(A型)和1106 bp(B型),其长度存在明显差异,这主要是由于该区内串联重复序列数目的不同造成的,因此草地藏系绵羊可分为A型(3个重复)和B型(4个重复)两种类型.     

藏绵羊乳腺乳铁蛋白的克隆及序列分析

本研究以四川若尔盖县藏系绵羊为材料,利用RT-PCR方法扩增并克隆了藏绵羊乳铁蛋白(lactoferrin,LF)序列,运用生物信息学软件对其核苷酸序列和编码蛋白质的结构进行预测和分析。结果表明,克隆的LF基因全长2127 bp,共编码708个氨基酸,N端有19个氨基酸组成的信号肽,该蛋白质等电点为8.4,预测分子质量为77.2 ku;半定量RT-PCR分析结果表明,LF在乳腺、气管、淋巴、肝脏、泪腺和脾脏中都有表达,在肺脏中不表达。本试验克隆了藏绵羊LF cDNA全序列,并对LF和乳铁蛋白肽(lfcin,Lfc)核苷酸和蛋白质进行了分析,为进一步研究其生物学活性奠定基础。     

藏系绵羊KAP3.2基因多态性及其对部分经济性状的影响

采用PCR-SSCP和DNA测序技术,对高原型、欧拉型和乔科型3个类型共254只藏绵羊KAP3.2基因的部分序列进行多态性分析,并利用最小二乘线性模型研究了其多态性与体质量、毛长和产毛量性状的关联性。结果,3个群体藏绵羊在KAP3.2基因座上均检测到AA、AB和BB 3种基因型,高原型以A等位基因为主,欧拉型和乔科型以B等位基因为主。3个群体基因型频率均处于Hardy-Weinberg非平衡状态,高原型和欧拉型达中度多态,乔科型为低度多态。测序表明KAP3.2基因271 bp处存在1个C→T的突变,属同义突变。体质量性状上,3类藏绵羊各基因型间均差异不显著;毛长性状上,3类藏绵羊AA基因型均显著高于BB型(P<0.05或P<0.01),而与AB型间无显著差异;产毛量性状上,3类藏绵羊AA基因型均显著高于BB和AB型(P<0.05)。结果表明,KAP3.2基因可作为影响藏系绵羊毛长和产毛量性状的分子标记。     

青海藏系绵羊BMP2基因的克隆及其序列分析

从青海藏系绵羊的皮肤中提取总RNA,根据其他物种BMP2基因的保守序列设计特异性引物,采用RT-PCR技术首次扩增出藏系绵羊BMP2DNA序列,提交至GenBank,并已取得序列号HM066200.将此片段克隆到pMD18-T载体中,经菌落PCR鉴定和DNA序列测定分析验证.结果显示,该DNA序列为356 bp的部分CDS区,编码118个氨基酸.证实所克隆序列为BMP2,符合BMP2基因的特征.     

PCR Amplification and Bioinformatics Analysis of IL-7 Gene in Tibetan Sheep

In order to get the interleukin-7 (IL-7) gene sequence of Tibetan sheep, and research the characteristics of this sequence and structure and function of encoding protein, IL-7 gene was amplified from Tibetan sheep by RT-PCR. The nucleotide sequence,amino acid sequence, homology and phylogenetic tree were analyzed by the DNAStar software. The secondary and tertiary structures, hydrophilicity, signal peptide and post-translational modification site of the encoding protein were predicted by DNAStar software and online servers. The results showed that the length of IL-7 gene was 531 bp (contained termination codon), and encoded 176 amino acids. Compared with IL-7 gene of Ovis aries, Capra hircus, Pantholops hodgsonii, Bubalus bubalis, Bos indicus, Bison bison bison, Bos taurus and Bos mutus, IL-7 gene of Tibetan sheep showed a great similarity from 97.2% to 99.8%, the amino acid sequence homology varied from 94.9% to 99.4%, and the relationship was the closest between Tibetan sheep and Ovis aries. Result from protein structure prediction indicated that the IL-7 protein was mainly composed of α-helix, it was a hydrophilic and secretory protein. Furthermore, it had six kinds of post translational modification sites, including one N-myristoylation site, one amidation site, one cAMP-and cGMP-dependent protein kinase phosphorylation site, three N-glycosylation sites, four protein kinase C phosphorylation sites and six casein kinase Ⅱ phosphorylation sites. These results might provide references for further study and clinical application of IL-7 gene in Tibetan sheep.     

藏羊白细胞介素-7基因的PCR扩增及生物信息学分析

为了获得藏羊白细胞介素-7（interleukin-7,IL-7）基因序列,并研究其序列特征及编码蛋白的结构和功能,本试验采用RT-PCR方法,从藏羊脾脏中扩增了IL-7基因,应用DNAStar软件分析该基因的核苷酸和氨基酸序列,与经BLAST比对后的参考序列进行同源性比对,并构建系统进化树,同时利用DNAStar软件和在线服务器预测该基因编码蛋白的二级结构、三级结构、亲水性、信号肽和蛋白翻译后修饰位点。结果表明,藏羊IL-7基因长度为531 bp（含终止密码子）,编码176个氨基酸。藏羊IL-7基因与绵羊、山羊、藏羚羊、水牛、瘤牛、美洲草原野牛、黄牛和牦牛的IL-7基因核苷酸序列同源性在97.2%~99.8%之间,氨基酸序列同源性在94.9%~99.4%之间,藏羊与绵羊的亲缘关系最近。蛋白结构预测结果表明,IL-7蛋白主要由α螺旋组成,是一种亲水性和分泌型蛋白。该蛋白含有6种蛋白质翻译后修饰位点,包括1个N-豆蔻酰化位点、1个酰胺化位点、1个cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点、3个N-糖基化位点、4个蛋白激酶C磷酸化位点、6个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。本研究结果可为藏羊IL-7基因的进一步研究与临床应用提供参考。     

MyoG和A—FABP基因多态性与鹅肉品质性状的相关性研究

为了检测MyoG基因和A-FABP基因单核苷酸多态性（SNP）与鹅肉品质性状的相关性,以太湖鹅为研究对象,测定肌内脂肪含量和相关组织学指标特性,利用PCR—SSCP和测序技术研究MyoG基因外显子1和A—FABP基因内含子2SNPs,并进行相关分析。研究结果表明：（1）MyoG基因外显子1扩增序列大小为420bp,共有1个突变,突变位点在64bp处,为C—T突变,不同基因型之间肌纤维密度、直径差异显著（P〈0．05）;（2）A—FABP基因扩增序列大小为482bp,共发现3个突变位点,在第187bp处发生C—T突变,在第235bp处发生C—A突变,在第372bp处发生A—C突变;（3）A—FABP基因内含子2扩增产物经SSCP分析后发现两种基因型,不同基因型之间脂肪含量有一定差异。比对发现其与家鸭同源性达91％,与家鸡的同源性为85％。本研究结果为进一步分析MyoG和A—FABP基因的遗传变异及其与肉质性状的相关性以及将该分子标记应用于育种计划奠定一定的理论基础。     

藏系绵羊VEGF基因的克隆、同源性分析及其表达水平的实时荧光定量PCR检测

采用PCR技术从藏系绵羊皮肤组织细胞中扩增出了血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因,长度为573 bp,共编码190个氨基酸;序列比对发现,VEGF基因在所选择的多个物种之间具有高度同源性,相似性在100%～74.5%之间,其中藏系绵羊与普通绵羊的VEGF基因序列完全相同,其次为牛和猪,相似性分别为99.1%和96.2%,而与鸡的同源性最低,相似性为74.5%。采用实时荧光定量PCR SYBR Green I荧光染料法,对藏系绵羊皮肤组织细胞中VEGF基因的表达水平进行了相对定量分析,建立了快速检测VEGF基因表达量的方法。检测结果表明:给妊娠后期藏系母羊补饲自制的营养舔砖和颗粒饲料后,所产羔羊体内VEGF基因的表达水平分别为对照组的11.5倍和0.85倍。为提高羔羊皮肤组织中VEGF基因mRNA的表达水平,对妊娠后期藏系母羊补饲自制的营养舔砖,效果优于补饲颗粒饲料。     

藏羊脂联素基因多态性及其与产肉性能的相关性分析

利用高分辨率熔解曲线技术对176头2周岁的甘肃藏羊（欧拉型、甘加型、乔科型）脂联素基因SNPs位点进行检测,运用GLM模型将检测到的SNPs位点与部分胴体及肉质性状的相关性进行了分析.结果表明：在脂联素第2外显子发现＋67G＞C突变使编码氨基酸由谷氨酸突变为谷氨酰胺;GG、GC基因型个体的宰前活重、胴体重均显著高于CC型（P＜0.05）.说明脂联素基因该位点可能是影响藏羊胴体及肉质性状的主效QTL或与之紧密连锁,可作为藏羊高档羊肉生产的候选分子标记.     

藏羊MSTN基因克隆、生物信息学及组织表达分析

【目的】对藏羊肌肉生长抑制素(myostatin, MSTN)基因进行克隆和生物信息学分析,检测其在藏羊不同组织中的表达,为探究MSTN基因在藏羊中的生物学功能提供参考。【方法】以藏羊背最长肌组织cDNA为模板,克隆藏羊MSTN基因完整CDS区序列并测序,用SeqMan程序对测序结果进行拼接,并用BLAST在线程序对组装后的序列进行分析鉴定。用生物信息学软件进行相似性比对、系统进化树构建及生物信息学分析,用实时荧光定量PCR检测MSTN基因在藏羊不同组织中的表达量。【结果】藏羊MSTN基因CDS全长为1 128 bp,编码375个氨基酸。藏羊MSTN基因氨基酸序列与绵羊、牦牛、牛、猪、恒河猴、人、黑猩猩、犬、鸡及斑马的相似性依次为100.0%、93.4%、93.4%、95.2%、94.4%、94.2%、94.4%、93.1%、87.8%和87.5%;系统进化树分析结果表明,藏羊与绵羊的亲缘关系最近,与斑马和鸡的亲缘关系最远。藏羊MSTN蛋白属于亲水性分泌蛋白,且具有不稳定性,不含跨膜结构,含1个信号肽,存在31个潜在的磷酸化位点、2个N-糖基化修饰位点,主要分布在线粒体和细胞质中;MS...     

UCP3基因在巴马猪和藏猪脂肪组织中的表达和甲基化分析

为探究解偶联蛋白3（uncoupling protein 3,UCP3）基因在巴马猪和藏猪皮下脂肪组织中的表达和甲基化水平,试验采用实时荧光定量PCR技术检测UCP3基因在巴马猪和藏猪皮下脂肪组织中的mRNA表达水平;针对猪UCP3基因启动子区域（-3 580~+920 bp）,利用在线软件MethPrimer对该区域进行CpG岛预测,并采用亚硫酸氢盐测序法（bisulfite sequencing PCR,BSP）检测其甲基化水平,探究UCP3基因甲基化水平在巴马猪和藏猪中的差异。结果显示,巴马猪皮下脂肪组织UCP3基因表达量显著高于藏猪（P<0.05）;在UCP3基因启动子区预测到3个CpG甲基化岛,分别是CpG island1（-3 171~-2 928 bp）、CpG island2（-154~-2 bp）和CpG island3（+648~+806 bp）,其中CpG island1和CpG island3的甲基化水平在巴马猪和藏猪中差异较小,而藏猪CpG island2的甲基化水平（42.61%）高于巴马猪（24.49%）。本研究绘制了2个猪种CpG island2甲基化水平的黑白点图,其中CpG位点为4、8、9、10、11、12、15,藏猪甲基化频率分别比巴马猪高28.26%、17.39%、26.09%、26.09%、26.09%、23.91%和34.78%。在CpG island2处预测到3个转录因子结合位点（SP2、PPARγ和EGR1）。结果表明,巴马猪和藏猪皮下脂肪组织中UCP3基因mRNA水平的表达差异可能是由于CpG island2的甲基化水平不同所导致,藏猪DNA甲基化水平在一定程度上阻碍了转录因子与启动子调控区域的结合,从而抑制了UCP3基因的表达。     

牦牛FSHR基因5’端部分序列克隆及生物信息学分析

利用PCR和T—A克隆技术,测定了麦洼牦牛和杂种犏牛的FsHR基因5’端侧翼区和第1外显子的核苷酸序列,并运用BLAST、DNAMAN、Clustal等生物信息学软件与其他物种的相应序列进行了同源性比对分析,为牦牛FSHR基因结构、犏牛雄性不育、牦牛遗传多样性,以及FSHR基因与牦牛的繁殖、产肉、产奶性状相关分析提供了理论基础。结果表明：牦牛和犏牛FSHR基因5’端侧翼区长度为970bp,普通牛、羊和猪的该序列长度分别为970、973和981bp,序列长度差异较小;序列突变以碱基替换为主,牦牛与犏牛、普通牛、羊及猪的核苷酸序列一致性分别为99．4％、99．3％、98．2％、96．9％,一致性较高,为同源基因。聚类分析中牦牛与犏牛首先相聚,再依次与普通牛、羊、猪聚在一起。根据核苷酸序列推测,氨基酸组成分析显示,牦牛和犏牛的该蛋白疏水性,蛋白的亲水性和稳定性较差,为不稳定的脂溶性蛋白;二级结构主要以α螺旋和随机卷曲为主。