慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobiurm japonicurm)USDA110菌株3-羟丁酸脱氢酶基因(bdhA)的克隆、序列及特性

通过功能互补试验，从慢性型大豆根瘤菌USDA110菌株基因文库中筛选到能互补广宿主根瘤菌NGR234的bdhA突变体菌株NGRPA2和苜蓿根瘤菌的bdhA突变体菌株Rm11107，使之恢复Hbu^ 表型的克隆；经酶活测定的Southern杂交证明该克隆含有bdhA基因。测定了bdhA基因全序列，并在GenBank登记（登记号为：AY077581）。该基因由789个碱基对组成，编码分子量为27.59ku，含262个氨基酸残基的3-羟基丁酸脱氢酶，在该基因的开放阅读框内插入interposonΩKm，并通过同源重组构建了Bradyrhizobium japonicum bdhA突变体（bdhA::ΩKm)。植株试验未显示bdhA基因的突变对结瘤，固痰有明显影响。     

水稻白叶枯病菌avrBs3/PthA家族基因的随机缺失及突变体PXO99Δavr功能的研究

利用来源于水稻白叶枯菌株JXOⅢ的无毒基因avrXa3构建的同源序列突变转化单元,同源重组得到PXO99~A菌株的1个缺失突变体PXO99△avr。PXO99~A及其突变体基因组DNA以内切酶BamHⅠ完全消化后进行同源检测,发现突变体PXO99△avr中有3条杂交带消失,有2条带信号减弱。进一步以相同探针检测PXO99~A的基因文库,限制性酶切分析和Southern杂交归类,共获得13个不同的阳性克隆。众多avrBs3/PthA基因在基因组中单独存在,或2个和2个以上串联排列。经比对,克隆p5所含条带与突变体缺失的5条带大小相同。因此认为随机交换产生的突变体中有5个基因被敲除。将此文库克隆(p5)分别导入PXO99~A和突变体PXO99△avr中,苗期接种试验表明:p5互补突变体能使其毒性恢复接近PXO99~A的致病表型,推测此克隆正是突变体缺失的基因。同时也表明:缺失的5个串联基因的综合作用主要表现为毒性功能。     

水稻白叶枯病菌avrBs3/PthA家族基因的随机缺失及突变体PX099△avr功能的研究

利用来源于水稻白叶枯菌株JXOⅢ的无毒基因avrXa3构建的同源序列突变转化单元,同源重组得到PXO99A菌株的1个缺失突变体PXO99△avr.PXO99A及其突变体基因组DNA以内切酶BamH Ⅰ完全消化后进行同源检测,发现突变体PXO99△avr中有3条杂交带消失,有2条带信号减弱.进一步以相同探针检测PXO99A的基因文库,限制性酶切分析和Southern杂交归类,共获得13个不同的阳性克隆.众多avrBs3/PthA基因在基因组中单独存在,或2个和2个以上串联排列.经比对,克隆p5所含条带与突变体缺失的5条带大小相同.因此认为随机交换产生的突变体中有5个基因被敲除.将此文库克隆(p5)分别导入PXO99A和突变体PXO99△avr中,苗期接种试验表明:p5互补突变体能使其毒性恢复接近PXO99A的致病表型,推测此克隆正是突变体缺失的基因.同时也表明:缺失的5个串联基因的综合作用主要表现为毒性功能.     

西瓜噬酸菌pilN基因功能分析

为了分析菌毛组装蛋白家族基因对瓜类细菌性果斑病菌致病性的影响,以xjl12菌株为背景构建转座子(Tn5)插入的突变体文库,通过浸种处理和子叶注射接种方法筛选致病性相关突变体,通过两亲交配获得突变株,并对所得的突变体、野生型及互补等多个菌株进行致病性、过敏性反应、游动性等相关表型进行测定,用反转录PCR(qRT-PCR)方法验证xjl12和突变体中hrpG、hrcV、celA表达量的差异。结果表明:突变体文库中筛选得到1株致病力明显下降的突变体Δxj-7,经亚克隆鉴定为pilN基因,其功能主要与菌毛(pili)生物合成相关。两亲交配后所得突变菌株ΔpilNac相较于野生型,其致病性、游动性、胞外纤维素酶活性降低,同时丧失烟草过敏性反应。qRT-PCR试验结果显示,Ⅲ型分泌系统的主要调控基因以及纤维素酶生物合成基因在ΔpilNac中的转录水平明显下调。证明菌毛生物合成相关基因pilN对致病性有重要的调控作用。     

大丽轮枝菌VdLac基因克隆与功能分析

为探讨漆酶基因VdLac在大丽轮枝菌中的功能,克隆该基因并利用农杆菌介导的遗传转化方法和PEG介导的原生质体转化方法对VdLac进行敲除和功能回复,获得敲除和互补突变体。以野生型JY为对照,对敲除突变体和互补突变体进行生物学功能测定。结果显示,VdLac基因全长1 978bp,cDNA序列全长1 713bp,编码570个氨基酸组成的蛋白质;VdLac基因缺失突变体(△VdLac)对硝化压力更敏感,其在CM培养基上仍可产生漆酶,但产生漆酶的能力降低;表明大丽轮枝菌漆酶基因VdLac不影响菌株的营养生长、产孢、致病力以及黑色素合成。     

豌豆根瘤菌透性酶基因突变体的构建及其功能研究

为研究豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)3841透性酶基因rl1568的作用,通过同源重组构建了豌豆根瘤菌透性酶基因rl1568突变体。结果表明,rl1568基因突变不影响菌株在自生培养条件下生长,但该基因突变株对低浓度的氧化物十分敏感且生长较差。荧光定量RT-PCR结果表明,H2O2不能诱导rl1568基因表达。植物盆栽试验发现rl1568基因突变对根瘤菌共生固氮能力无影响。     

水稻条斑病细菌dsp基因的克隆

用硫酸二乙酯(DES)化学诱变水稻条斑病细菌RS105菌株，获得一株dsp基因突变体AM11。该突变体的菌落形态、颜色、胞外多糖产生能力以及胞外酶(淀粉酶、蛋白酶、果胶酶和纤维素酶)的活性与野生型菌株RS105无明显差异。将水稻条斑病细菌RS105基因库1200个克隆逐个导入dsp基因突变体AM11中，致病性测定结果表明，dsp基因阳性克隆pC101可以恢复AM11在水稻上的致病性。酶切分析显示，克隆pC101携44．92kb的dsp基因片段。亚克隆和功能互补结果显示，克隆pE46和pE47均具有恢复dsp突变体AM11致病性的能力，这表明决定水稻条斑病细菌dsp表型的基因位点至少有2个。     

香蕉枯萎病4号小种T-DNA 插入突变体 Focr4-1453表型特征及致病性分析

尖孢镰刀菌古巴转化型是引起香蕉枯萎病的主要病原菌,呈世界多态性分布,其致病机理尚不清楚。 Focr4-1453 为T-DNA 插入突变体库中筛选出的一株与致病性相关的突变体。在克隆出其失活基因之后,将“生型 菌株中的相同基因进行敲除和互补,得到敲除突变体驻Foc4-1453 和互补突变体驻Foc4-1453-cp-1。对获得的3 株 突变体进行生物学表型研究发现,这些菌株的菌落生长速度、产孢能力以及孢子萌发率较“生型菌株明显降低,且 无法透过玻璃纸进行生长。致病性测定试验表明,该基因失活会导致病原菌侵染能力显著减弱。     

花生3-磷酸甘油酰基转移酶基因的功能鉴定

花生(Arachis hypogaea)是我国的主要油料作物,花生油脂的合成受3-磷酸甘油酰基转移酶(GPAT)调控,但其调控机制尚不清楚。从花生中克隆了13个GPAT基因,编码含有4个酰基转移酶保守结构域的蛋白;同时,运用酵母遗传互补体系对基因功能进行了鉴定。在该体系中,酵母双突变体菌株ZAFU1(Δgat1/Δgat2)因缺少GPAT而不能在特定的葡萄糖培养基上生长。结果表明,AhGPAT1/2/3/6/9与空白载体一样,其导入并不能恢复酵母双突变体ZAFU1在葡萄糖中的生长缺陷,而AhGPAT5B、AhGPAT7A/B的导入能恢复酵母双突变体ZAFU1在葡萄糖中的生长缺陷,说明上述3个基因具有酰基转移酶活性,从而为进一步研究花生油脂的合成代谢调控提供了参考。     

成团泛菌对玉米自交系PS056致病性基因yhfK的克隆

 【目的】通过克隆和鉴定成团泛菌(Pantoea agglomerans)的致病相关基因,阐明该种土壤习居细菌在玉米自交系PS056上引起细菌性干茎腐病的原因。【方法】利用转座子Tn5的随机插入突变特点,构建致病性菌株P. agglomerans XJ1突变体库;经对Tn5插入位点的侧翼扩增,确认突变体PA121的致病力相关基因;通过基因互补试验,证明yhfK与致病力的关系。【结果】通过对突变菌株的接种筛选,获得11个致病力丧失的突变体。Southern杂交和PCR扩增结果表明,Tn5在突变体PA121中为单拷贝插入,插入位点为细菌编码内膜蛋白的yhfK(Tn5 插入在yhfK的1 082 bp处)。将yhfK克隆到质粒pBBR1MCS上,并导入突变体PA121中进行互补,生物测定结果显示转化子完全恢复了正常的细菌生理功能,并能够在玉米自交系PS056上恢复致病力。RT-PCR试验证明,yhfK调控hrpA的转录。【结论】 成团泛菌XJ1中yhfK是调控其对植物致病性的基因之一,具有在玉米自交系PS056上引起细菌性干茎腐病的功能。     

组氨酸激酶基因barA在水生拉恩菌中的生防调控功能

为探究水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)HX2的生防性状表现机制,利用转座子mini-Tn5对HX2菌株进行随机突变,筛选获得1个对葡萄根癌菌K308(Agrobacterium vitis K308)拮抗活性减弱的突变体,并确定该插入位点的基因为双组分调控系统中的组氨酸激酶基因barA。该基因编码的蛋白含有组氨酸激酶结构域HAMP(histidine kinases,adenylyl cyclases,methyl binding proteins,phosphatases)、组氨酸磷酸传递结构域HisKA(histidine kinase acceptor)、C-端催化ATP结合结构域HATPase_C(histidine associated ATPase C terminal)、磷酸接受结构域REC(receiver domain)和含组氨酸的磷酸转移结构域HPT(histidine phosphotransferase domain),是一种跨膜的杂合组氨酸激酶蛋白。通过双交换突变,获得了barA缺失突变体并构建了互补菌株。通过比较分析发现,barA基因缺失后,细菌HX2生物膜形成能力显著提高,但细菌游动和涌动能力降低,以及对葡萄根癌病的生防效果从野生型的86.2%降低至26.7%,构建的互补菌株能够恢复突变菌株在该研究中的所有测定性状。由此推测,组氨酸激酶基因barA是细菌HX2表现生防性状的一个重要调控基因,为生防细菌HX2在植物病害防治上提供理论基础。     

葱蝇ADH基因的克隆及序列分析(英文)

[目的]对葱蝇(Delia antiqua)ADH基因进行克隆,并对其进行序列分析。[方法]通过RACE的方法克隆葱蝇ADH基因的cDNA序列,同时对该序列进行同源性分析、氨基酸序列比对和系统发育分析。[结果]试验获得的cDNA全长1088bp,其中ORF771bp,编码256个氨基酸,推测其相对分子质量为30.80kDa,等电点为8.22;通过该基因推导的氨基酸序列与其他物种的ADH进行相似性比较和系统发育分析,发现葱蝇与刺舌蝇(Glossina morsitans morsitans)氨基酸序列的同源性最高。[结论]该研究为ADH基因的进一步研究提供了基础。     

棉花黄萎病菌VdHP1的克隆及功能分析

【目的】明确棉花黄萎病菌(大丽轮枝菌Verticillium dahliae)中一个新基因(VdHP1)的功能,为解析棉花黄萎病菌的致病机制以及棉花黄萎病的防治提供依据。【方法】以大丽轮枝菌野生型菌株V592的基因组DNA和cDNA为模板,对VdHP1全长进行克隆并测序;利用逆转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分别对棉花根系诱导不同时间VdHP1的表达量及V592菌株不同组织中VdHP1的表达量进行测定;构建针对VdHP1的敲除载体、互补载体和过表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化筛选VdHP1基因敲除突变体、互补菌株和过表达菌株;以野生型菌株V592为对照,对VdHP1基因敲除突变体及互补菌株的菌落及菌丝形态进行观察,并对微菌核量、产孢量及致病力进行测定;通过RT-qPCR测定其他致病力相关的基因在VdHP1基因敲除突变体及过表达体菌株中的表达情况。【结果】VdHP1全长为862 bp,预测编码蛋白含268个氨基酸,与GenBank中已注释的基因没有任何的序列相似性。野生型菌株V592受棉花根系诱导6—12 h时VdHP1表达水平显著上调,表明VdHP1在大丽轮枝菌侵染早期发挥作用。VdHP1在分生孢子中的表达量显著高于在菌丝和微菌核中的表达量,表明VdHP1在大丽轮枝菌不同组织中的表达具有差异性。与野生型菌株V592相比,VdHP1基因敲除突变体产孢量和产孢梗显著减少,菌丝分支呈螺旋状,对棉花的致病力明显下降。与侵染钉形成相关基因(VdCrz1、VdNoxB、VdPls1)、分泌蛋白释放相关基因(VdSep5)及分生孢子产生相关基因(Vdpf、VdSge1、VGB、VdPLP、VdCYC8、VdNLP1、VdNLP2)在VdHP1基因敲除体中的相对表达量显著下调,在过表达菌株中上调;而与黑色素合成相关基因(VdCmr1、VdSho1、VdLAC、VdPKS1)在VdHP1基因敲除突变体中则显著上调,在过表达菌株中下调。【结论】VdHP1与大丽轮枝菌分生孢子和产孢梗的产生有关,参与大丽轮枝菌致病;VdHP1对与侵染钉形成、分泌蛋白释放及分生孢子产生相关基因的表达具有正调控作用,对黑色素合成相关基因的表达具有负调控作用。     

山豆根根瘤菌的生物学特性及其不同菌株对山豆根幼苗药用有效成分的影响

对采自广西不同地点的山豆根根瘤菌进行生物学特性研究,并将其分别接种在盆栽山豆根幼苗上,室内培养180 d后,测定植株药用有效成分苦参碱、氧化苦参碱含量。结果表明,山豆根根瘤菌为快生型根瘤菌,在YMA培养基上代谢产酸,大部分菌株的生长温度范围为25~35℃,酸碱耐受范围为pH值6.0~10.0,对抗生素卡那霉素(Km)、庆大霉素(Gm)敏感;不同来源的根瘤菌对山豆根药用有效成分积累的影响不同,与其他菌株相比,来自靖西县的2株菌JX2、JX3对苦参碱、氧化苦参碱的影响达到了显著水平。     

枯草芽胞杆菌Bs916突变体库的构建和抑制水稻 细菌性条斑病菌相关基因的克隆

【目的】采用转座子标签技术构建枯草芽胞杆菌Bs916突变体库,从突变体库中筛选对水稻细菌性条斑病菌抑菌效果发生显著变化的菌株并克隆插入位点的基因,获得生防菌Bs916中与抑制细菌活性可能相关的基因。【方法】携带转座子TnYLB-1的穿梭载体pMarA通过化学转化方法转化至枯草芽胞杆菌Bs916菌株,构建随机插入突变体库。通过平板抑菌试验从突变体库中筛选对水稻细菌性条斑病菌抑菌效果得到显著提高和下降的突变体;并采用PCR和Southern Blot验证转座子是否成功插入到Bs916染色体基因组上,利用反向PCR技术克隆转座子插入位点基因、测序并进行生物信息学分析。【结果】成功构建了枯草芽胞杆菌Bs916的转座子随机插入的突变体库;PCR和Southern Blot结果表明转座子成功的插入到染色体基因组上,约85%突变体以单拷贝形式插入;筛选出30株对水稻细菌性条斑病菌抑制效果发生显著变化的菌株,克隆到21个突变体插入位点的基因序列并测序。生物信息学分析结果表明这些基因与感受态形成、生物膜形成和次生产物代谢相关。【结论】成功构建了Bs916突变体库,克隆到该库中对水稻细菌性条斑病菌抑菌效果显著变化菌株的突变位点基因,这些基因推测可能与枯草芽胞杆菌Bs916中的抑制细菌化合物的合成代谢及调控相关。     

水稻温度敏感型黄叶突变体yl2(t)的表型分析和基因定位

[目的]本试验旨在对水稻温度敏感型黄叶突变体yl2(t)进行表型分析和基因定位,为图位克隆该基因奠定基础。[方法]在连续20℃温度处理下测定突变体yl2(t)叶绿素含量和观察其叶绿体结构;构建yl2(t)与籼稻品种‘南京11’的杂交F2群体,借助SSR和In Del分子标记,选取隐性极端个体进行基因定位;利用qRT-PCR测定叶绿素合成相关基因表达水平。[结果]20℃持续处理15 d,yl2(t)幼苗表现黄叶;若处理时间延长至20 d,yl2(t)幼苗则不能继续生长最后死亡,处理15 d后转移至30℃或在30℃连续生长时叶色正常。田间生长条件下,yl2(t)的农艺性状与野生型相比,没有显著差异。叶绿素含量测定结果表明,20℃时yl2(t)叶绿素含量较野生型显著降低,而30℃时yl2(t)中仅叶绿素b的含量显著降低。叶绿体超微结构观察显示,yl2(t)幼苗中叶绿体发育正常。遗传分析表明,yl2(t)突变表型受一对隐性核基因控制,利用图位克隆的方法将该突变基因定位在第8染色体长臂末端标记N8-36与P16之间,物理距离为647 kb。qRT-PCR结果表明,20℃和30℃两种温度条件下,与野生型相比,yl2(t)幼苗中叶绿素合成相关基因的表达出现不同的变化。[结论]水稻温敏型黄叶突变体yl2(t)突变表型受一对隐性核基因控制,该基因被定位在第8染色体长臂末端,是一个控制水稻叶色的新基因。本研究结果为YL2(T)基因的克隆及在水稻育种中的应用提供了依据。     

利用EMS筛选豆科模式植物百脉根的根瘤突变体及突变部位

豆科植物百脉根是研究共生固氮体系的模式植物之一,被根瘤菌感染后形成根瘤,根瘤菌固定氮素变换成铵态氮,植物利用铵态氮进行营养生长,而根瘤菌利用植物供给的碳酸同化产物为能源。为获得根瘤的成熟、维持的基因,本研究利用化学诱变试剂EMS处理百脉根MG-20得到多种突变体,筛选根瘤成熟、维持有异常的突变植株,利用SSR标记和dCAPS标记进行基因定位。结果表明:约10万M2百脉根植株中获得nup85突变体2株,nup133突变体4株,pollux突变体6株,ccamk、symrk、castor、nin、nfr1、nfr5突变体各1株等不结瘤突变体(Nod~-)18株;结无效根瘤突变体(Fix~-)6株并确定了突变体的突变部位。     

费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)质粒复制基因repC序列多样性的研究

采用质粒快速检测法从供试33株费氏中华根瘤菌中分别检测出2～4个内源大质粒。用根据豌豆根瘤菌的repC基因设计1对引物RCI和RC3,从供试菌株及3株华癸中生根瘤菌和1株大豆慢生根瘤菌中扩增得到repC基因片段,证明在费氏中华根瘤菌中广泛存在repC基因。通过对扩增产物的测序,并与已报道的repC基因序列进行聚类分析,发现供试菌株可分为2个群,群a和群b,群内十分保守,但群间差异明显;其中群b的序列与已知类型的差异明显。     

水稻卷叶突变体rl15(t)的生理学分析及基因定位

【目的】对环境诱导卷叶突变体开展生理学特性分析,并对候选的突变基因开展初步定位,为下一步的基因克隆与功能分析提供研究基础。【方法】用60Coγ射线诱变粳稻品种日本晴（Nipponbare）种子,发现了一份叶片在晴朗天的正午时分高度内卷的突变体,命名为rl15(t)（rolled leaf 15）。通过田间种植鉴定,对该突变体进行表型观察及主要农艺性状调查。采用不同温度和相对湿度处理rl15(t)和野生型,以揭示影响突变体叶片卷曲的环境因素。试验设置3个处理温度（24℃、29℃、34℃）和2个相对湿度（RH=60%或95%）,在人工气候箱处理抽穗期的rl15(t)和野生型,以处理1.5 h后的剑叶测定叶片卷曲度（RLI）。自清晨6:00时至下午18:00时,每隔2 h用便携式气体交换系统Li-6400测定rl15(t)和野生型剑叶的净光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）和气孔导度（Gs）等指标,同时用WP4露点水势仪测定剑叶的叶片水势,分析并比较突变体和野生型的上述生理表现的异同。将rl15(t)与野生型日本晴杂交,观察F1植株和F2群体的叶片表型,对F2表型分离进行χ2测验,分析突变体的遗传行为。以rl15(t)×珍汕97B的F2群体为材料,利用BSA法对候选基因进行定位。【结果】与野生型亲本日本晴相比,rl15(t)突变体植株变矮、分蘖减少、穗长变短、籽粒变小、生育期延迟;rl15(t)突变体叶片短窄且在阴雨天气或晴天的清晨和黄昏时表现为正常的平展或轻微内卷,但在晴朗天的正午时分表现高度内卷。温度和湿度梯度处理试验表明,rl15(t)突变体叶片卷曲行为受环境诱导,湿度是诱导突变体叶片卷曲的主要因素,高温可促进该表型的表现。rl15(t)突变体剑叶的净光合速率、蒸腾速率和气孔导度等光合参数以及叶片水势在清晨和黄昏同野生型亲本较接近,但在正午时分均显著低于野生型;而rl15(t)突变体剑叶的水分利用效率（WUE）在清晨、正午时分和黄昏与野生型接近,但在其他时段显著高于野生型。rl15(t)与野生型亲本日本晴的F1表现叶片正常的平展,F2群体中平展叶与卷叶表型株符合3﹕1分离比,表明rl15(t)突变体的卷叶突变性状受1对隐性核基因控制。RL15(t)初步定位于水稻第10染色体长臂端SSR标记RM25302和RM25343之间,与两标记的遗传距离分别为0.8和2.0 cM。【结论】突变体rl15(t)的卷叶表型是受环境诱导的,候选基因定位于SSR标记RM25302和RM25343之间,该区段内未见同类表型基因的报道,推测RL15(t)可能是一个新的卷叶调控基因。     

脉胞菌lca-1基因调控无性产孢及类胡萝卜素的合成(英文)

[目的]为了深入了解粗糙脉胞菌类胡萝卜素合成调控机制。[方法]该研究通过对粗糙脉胞菌基因突变体库中6087株突变体进行筛选,并对突变体类胡萝卜素与无性孢子的产量进行测定;最后采用实时荧光定量RT-PCR技术对无性产孢及类胡萝卜素合成相关基因进行转录分析。[结果]新发现6个基因敲除突变体营养生长正常,但类胡萝卜素的合成降低,其中表型较好的1个突变体,其无性产孢量与类胡萝卜素合成量均明显降低。该突变体所缺失的基因编码一种依赖ATP的染色体重建复合体的ATP酶链ISW1,我们将该基因命名为lca-1。进一步测定发现lca-1基因的突变导致无性产孢及类胡萝卜素的合成量较野生菌株分别降低了88%和81%。[结论]lca-1对脉胞菌的无性产孢和类胡萝卜素合成具有重要的正调控作用。