多粘芽孢杆菌β-葡聚糖酶特性及其基因克隆

对多粘芽孢杆菌所产的β-葡聚糖酶特性进行了分析.结果表明:该酶的最适温度为50 ℃,在60℃以下酶相对稳定.通过PCR方法扩增和克隆了该酶基因的全长DNA序列,长度为734 bp,其中开放阅读框架长714 bp,编码238个氨基酸.经Blast分析,该序列与已登陆的多粘芽孢杆菌和浸麻芽孢杆菌的同源性较高,分别为99%和82%.     

地衣芽孢杆菌β-1,3-1,4葡聚糖酶基因的克隆及序列分析

β-葡聚糖是以β-1,3和β-1,4混合糖苷键连接形成的D-葡萄糖聚合物,主要存在于单子叶禾本科谷实中.有些微生物会产生降解β-葡聚糖的β-1,3-1,4-葡聚糖酶.将β-葡聚糖酶基因在食品级宿主菌中表达对动物饲料工业具有十分重要的应用价值.实验以地衣芽孢杆菌为材料,提取其总DNA,扩增其β-1,3-1,4葡聚糖酶基因序列,将该片段克隆到pMD 19-T载体进行测序,并将测序结果进行BLAST比对.发现其与GenBank中的两段基因序列具有较高的同源性.     

芽孢杆菌SP A3β-葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达

将含β-葡聚糖酶基因的重组克隆载体进行亚克隆,用BamHⅠ和 XhoⅠ双酶切后,与相同酶切的表达载体pET-30a相连接,构建重组表达载体,在大肠杆菌BL21中表达,蛋白质电泳结果表明在25.0 KD处有表达带,酶活力达85.9U/mL,为出发菌的31多倍.     

浸麻芽孢杆菌-葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达

将含浸麻芽孢杆菌β-葡聚糖酶基因的重组克隆质粒进行亚克隆,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,与相同酶切的表达载体pET-30a相连接,构建重组表达质粒,在大肠杆菌BL21中表达.蛋白质电泳结果表明在25.0 kD处有表达带,酶活力达60.4 U/mL,为出发菌的30多倍.酶特性研究表明:该酶的最适温度为50℃,最适pH为5.0~7.0;在50℃以下及在不同的pH下(pH 3.0~9.0)处理后较稳定.     

多粘类芽孢杆菌CP7β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆、表达及应用

【目的】克隆多粘类芽孢杆菌(Paenibaccillus polymyxa)CP7的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因,构建高效表达工程菌株,为CP7菌的抗菌活性组分研究和开发利用以及葡聚糖酶在农业生产中的应用提供理论依据。【方法】通过CP7菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆及原核表达构建工程菌株,采用平板对峙培养和生长速率测定法研究重组酶对供试真菌的生长抑制活性,同时采用体外消化法研究该酶对麦类饲料消化率的影响。【结果】成功克隆目的基因并在原核系统获得高效表达。重组酶蛋白对4种供试真菌菌丝生长具有明显抑制作用,平均抑制率高达40%以上;添加了重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的处理组样品,经体外消化后黏度降低了4.69%(P﹥0.05)。【结论】β-1,3-1,4-葡聚糖酶是CP7菌发酵液中抗真菌活性组分或其中之一,对真菌生长抑制的活性作用提示其可作为农业抗病虫害新型药物进行开发研究;该酶能够有效降低麦类饲料黏度,表明其作为饲料添加剂的开发利用同样具有良好前景。     

产酶溶杆菌OH11菌株β-1,3-葡聚糖酶基因的克隆与表达

利用PCR方法从OH11菌株中克隆到β-1,3-葡聚糖酶基因,通过同源性比较发现其推测产物与产酶溶杆菌C3菌株和N4-7菌株的β-1,3-葡聚糖酶有90%以上的同源性。该基因经NdeⅠ、XhoⅡ或HindⅢ酶切后连接到含T7启动子的高表达载体pET21a( )和载体pET30a( )上构建重组质粒,并分别转化宿主菌BL21(AI)和BL21(DE3)产生表达菌株。表达菌株BLGluA和BLGluC经IPTG诱导后分别产生相对分子量约为29 000(GluA蛋白)和44 000(GluC蛋白)的蛋白。酶活性和抑菌活性测定结果表明,GluA蛋白和GluC蛋白能将海带多糖水解,在海带多糖培养基上产生透明的水解圈,并对立枯丝核菌菌丝的生长有抑制作用,具有一定的生物防治作用。     

几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因克隆微生物表达和抑菌效果研究

采用PCR扩增的方法,扩增获得几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的基因,分别将其基因克隆到原核表达载体pET28a(+)上,构建了原核表达载体pETChi和pETGlu。经IPTG诱导后几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因在大肠杆菌BL21中得到高效表达。通过对连孢(Alternaria alternate)的抑菌实验表明,这两基因的表达产物对此真菌有较强的抵抗能力。     

浸麻芽孢杆菌β-葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达

将含浸麻芽孢杆菌β-葡聚糖酶基因的重组克隆质粒进行亚克隆,用Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切后,与相同酶切的表达载体pET-30a相连接,构建重组表达质粒,在大肠杆菌BL21中表达.蛋白质电泳结果表明在25.0 kD处有表达带,酶活力达60.4 U/mL,为出发菌的30多倍.酶特性研究表明:该酶的最适温度为50℃,最适pH为5.0～7.0;在50℃以下及在不同的pH下(pH 3.0～9.0)处理后较稳定.     

茶树β-1,3葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的优化表达

从茶树中获得β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-glucanase , β-1,3-glu )基因cDNA,发现其中存在着一些序列,它们与核糖体竞争性地结合pET32a载体上的RBS位点, 造成该基因cDNA在原核生物中很难表达.作者对其中的两处基因序列进行了突变,通过设计PCR引物,利用密码子的简并性,保证了突变后蛋白质的一级结构不变.使葡聚糖酶基因在大肠杆菌中明显表达.通过SDS-PAGE分析,证明表达产物分子量约75.8 kD,与预计大小一致,并通过水杨酸法对其进行酶活测定,证明其有活性.     

短小芽孢杆菌XZG33耐高温酸性β-甘露聚糖酶酶学性质研究

[目的]从短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）XZG33发酵液中分离纯化甘露聚糖酶,并对其酶学性质进行研究。[方法]利用硫酸铵分级盐析、DEAE-cellulose DE52阴离子交换层析和Sephadex G-100分子筛凝胶过滤层析等方法,分离纯化到了均一的蛋白酶,酶纯度提高了39.7倍,回收率20.2%。通过SDS-PAGE电泳和SephadexG-75分子筛凝胶电泳测得酶蛋白分子量是40.0 kDa,为单亚基蛋白。酶最适作用pH值5.0,最适作用温度60℃,在pH值2.0～8.0范围内酶活性及稳定性较高。在80℃以下保温1 h,残余酶活还在80.0%以上。二价金属离子Mg2＋、Ca2＋、Co2＋及Mn2＋对酶有明显激活作用。酶对槐豆胶有强的底物水解特异性,而对淀粉、羧甲基纤维素钠以及桦树木聚糖水解活性极低。在最适作用条件下,以槐豆胶为底物测定Km为4.6 mg/ml。[结论]鉴于短小芽孢杆菌XZG33甘露聚糖酶具有以上优良的酶特性,它在食品原料及功能性低聚糖的开发方面有着潜在的应用价值。     

毕赤酵母产β-1,3-1,4-葡聚糖酶发酵优化及酶学性质研究

对毕赤酵母表达β-1,3-1,4-葡聚糖酶条件进行优化,在摇瓶水平上研究了温度、pH、甲醇流加量、诱导时间,油酸等因素对重组葡聚糖酶的影响;得优化条件为:最适温度30℃、pH6.0,最佳甲醇诱导浓度为0.5%,最佳诱导时间为84h,酶活力达27.4U/mL,比初始酶活力提高了1.9倍。酶反应的最适pH为6.0,最适温度为50℃。在pH3.5～8.0的范围内和温度55℃以下保存时具有较好的稳定性;其中,CaCl2对重组酶的激活效果显著,使酶活力提高达92%。     

青花菜β-1,3葡聚糖酶基因的克隆、表达分析及其植物表达载体的构建

根据其他植物的β-1,3-葡聚糖酶基因保守域序列设计简并引物,扩增出青花菜β-1,3-葡聚糖酶基因的中心区段,结合5′RACE和3′RACE技术获得该基因的5′端序列和3′端序列,经序列拼接获得1个1 277 bp 的cDNA,在GenBank 中登录号为EF484879,定名为BObg.序列分析结果表明,该cDNA 包含1个1 056 bp的开放阅读框,编码352个氨基酸,其理论上的等电点PI=7.314,相对分子质量为3.892×104,聚类分析显示该序列与已报道的其他植物的β-1,3-葡聚糖酶基因具有较高氨基酸序列同源性.利用未接种和接种霜霉病后不同时期的青花菜植株细胞进行半定量RT-PCR分析,结果表明,该基因在霜霉病接种后48 h优势转录表达,未接种和接种后其他时期都呈低水平转录表达.利用pBI121质粒构建含35S启动子的正义表达载体,酶切图谱和PCR分析结果证明该表达载体构建成功.     

条锈菌诱导的小麦β-1,3-葡聚糖酶基因编码区的克隆及原核表达

为研究小麦与条锈菌互作过程中β-1,3-葡聚糖酶基因的功能,根据小麦β-1,3-葡聚糖酶cDNA全长序列设计合成引物,通过RT-PCR方法获得小麦β-1,3-葡聚糖酶基因编码区,将其克隆至pGEM T-easy Vector,经HindⅢ和BamHⅠ双酶切回收目的片断,并将其定向克隆到pET-32a(+)Vector中构建表达载体GLU-pET-32a(+),转化E.coliBL21(DE3),用IPTG进行诱导表达。结果表明,小麦β-1,3-葡聚糖酶基因在大肠杆菌中得到了高效表达,获得了分子量约为49 ku的融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白的19%。最佳诱导条件为:0.3 mmol/LIPTG,37℃诱导4 h。     

Bacillus subtilis LC-9产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶学性质与催化特性研究

[目的]系统研究Bacillus subtilis LC-9所产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶学性质,探讨其在催化应用上的可行性。[方法]采用两步阴离子交换层析法对B.subtilis LC-9发酵液中的β-1,3-1,4-葡聚糖酶进行纯化,用SDS-PAGE检测其纯度,研究纯酶的酶学性质及该酶对β-葡聚糖和地衣多糖的降解特性,并采用TLC法检测其水解液中糖的成分。[结果]从自行筛选的糖苷酶产生菌B.subtilis LC-9的发酵液中经两步纯化,得到电泳纯的β-1,3-1,4-葡聚糖酶,其比活力达3 502 U/mg,表观分子量为28 kDa;酶的最适反应pH和温度分别为6.5和45℃,且在45℃下稳定;该酶催化地衣多糖的Km值和Vmax分别为4.13 mg/ml和1 238μmol/min/mg,催化大麦β-葡聚糖的Km值和Vmax分别为3.84 mg/ml和1 427μmol/min/mg;该酶降解大麦β-葡聚糖产生寡聚糖,最终产物主要为三糖和四糖,而降解地衣多糖终产物主要为三糖。[结论]从Bacillus subtilis LC-9发酵液中纯化获得了电泳纯的β-1,3-1,4-葡聚糖酶,性质研究表明该酶是专一性的β-1,3-1,4-葡聚糖酶,有望用于啤酒、饲料等领域。     

重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的纯化及部分酶学性质研究

[目的]研究重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的性质。[方法]由重组大肠杆菌制备重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶发酵液,经乙醇分级沉淀和DEAE-650M离子交换层析分离纯化后进行SDS-PAGE纯度鉴定,最后分析纯化后重组酶的酶学性质。[结果]SDS-PAGE分析表明纯化后得到了较纯的重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶,比活力达13 437 U/mg,纯化倍数为19.85倍,回收率为20.60%,分子量约30 kDa。纯化后重组酶的最适pH值为6.0,pH值4.5~6.0较稳定;最适温度为50℃,40~50℃较稳定;Cu2+和Fe2+对其活力有显著的抑制作用,Mg2+、Zn2+和Mn2+对其活力有抑制作用,比较适合在啤酒酿造上使用。[结论]该研究为重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的工业化应用奠定了基础。     

β-1,3-葡聚糖酶产生菌的筛选及其产酶条件

为了制备β-1,3-葡聚糖酶,从土样中筛选出一株产β-1,3-葡聚糖酶活力较高的菌株LE02,经形态学观察,初步鉴定为木霉菌．木霉LE02在以2％的酵母粉为主的液体产酶培养基（起始pH7．0）中,于32℃,150r／min摇瓶培养60h达到产酶高峰,酶活力可达71．09U／mL．     

植物β-1,3-葡聚糖酶的研究进展

植物β-1，3-葡聚糖酶（β-1，3-D-葡聚糖-3-葡萄糖苷水解酶，EC3．2．1．39）属PR2（Pathogensis—relatedpmteins，PR）类蛋白，作为植物抗真菌基因工程的热点之一，近年来的研究进展较为迅速。文章就β-1，3-葡聚糖酶的生物特性、分类、诱导、抗性和发育进行了竦合性介绍。     

烟草β-1,3-葡聚糖酶的特性和结构分析

[目的]对烟草β-1,3-葡聚糖酶的特性和结构进行分析。[方法]以烟草为材料,采用PROTSCALE、Target P 1.1、NPSA-PRABI和SWISS-MODEL工具分别测定烟草葡聚糖酶的疏/亲水性、亚细胞定位、二级结构和三级结构。[结果]NtBGl属于亲水性蛋白,NtBGl-1和NtBGl-2的疏/亲水性较为相似,N端和中部区域的疏水性较强,NtBGl-3以N端的疏水性较强;NtBGl均含有信号肽,且其切割位点分别位于第21、32和29位氨基酸处,NtBGl-1和NtBGl-2定位于液泡,NtBGl-3定位于细胞外;NtBGl的二级结构均以α-螺旋比例最大,依次为36.21%、35.14%、35.28%,三级结构呈现C型。[结论]该研究可为有效发挥烟草葡聚糖酶的功能特性奠定基础。     

烟草β-1,3-葡聚糖酶的生物学分析

[目的]以烟草β-1,3-葡聚糖酶的氨基酸序列为材料,对其特性进行深度挖掘。[方法]采用NCBI-PROTEIN筛选蛋白序列,依次运用Prot Param、Signal P 4.1和TMHMM 2.0工具进行预测并分析烟草葡聚糖酶的理化特性、信号肽和跨膜结构的组成成分。[结果]NtBGl-2的分子量最大(40 390.76 Dk),NtBGl-3的分子量最小(37 722.64 Dk);NtBGl-1和NtBGl-2的等电点小于7.0,而NtBGl-3的等电点大于7.0;NtBGl-1和NtBGl-2属于不稳定蛋白,NtBGl-3属于稳定性蛋白,且耐热性大于NtBGl-1和NtBGl-2;NtBGl-1和NtBGl-2的优势氨基酸为甘氨酸和丝氨酸,NtBGl-3的为天冬酰氨和丙氨酸;NtBGl均含有信号肽,属于分泌蛋白;NtBGl-1无跨膜区,而NtBGl-2(13~35)和NtBGl-3(7~29)含有跨膜结构区域,属于跨膜蛋白。[结论]该研究为深入研究烟草葡聚糖酶奠定基础。