枸杞LbMYB1基因的克隆与表达分析

在前期的枸杞花药蛋白质组学研究鉴定差异表达蛋白的基础上,采用RT-PCR技术,从宁夏枸杞"宁杞1号"花药中克隆了一个花药发育差异表达MYB类蛋白基因。生物信息学分析表明,该基因编码R2R3类MYB转录因子的典型结构域,与其他物种MYB蛋白的氨基酸的相似性达72%以上,属于R2R3类MYB蛋白基因家族。将该基因命名为Lb MYB1,Lb MYB1包含一个975 bp的开放阅读框,编码324个氨基酸残基,分子量79.2 kv,等电点为4.95。实时定量RT-PCR检测表明,Lb MYB1基因在花药四分体形成时期高丰度表达,在花中的表达量也较高,果实中表达量较低,在根、茎及叶中未检测到表达,推测Lb MYB1基因可能与花药发育中有关。本研究为后继进一步探讨Lb MYB1蛋白在枸杞花药发育过程中可能发挥的调控功能及其分子机理提供参考。     

枸杞甜菜碱醛脱氢酶基因全长cDNA的克隆与表达分析

根据GenBank中的植物甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因的同源保守区设计简并引物,采用RT-PCR技术从枸杞中扩增出BADH基因的部分保守序列,并利用巢式PCR、5′-RACE和3′-RACE获得BADH基因的全长cDNA。测序结果表明:BADH全长为1 869 bp,包含1 512 bp长的开放读码框(ORF),编码1个含503个氨基酸残基、分子质量为55.12 ku、等电点(PI)为5.19,包括醛脱氢酶高度保守序列VTLELGGKSP和其后287 bp处与酶功能有关的Cys的假定蛋白质。mRNA分析表明:BADH基因在枸杞幼苗组织中受高盐胁迫和低温胁迫的上调诱导表达,表明该基因可能在植物抵御非生物胁迫中发挥重要作用。     

枸杞胆碱合成关键酶基因PEAMT的克隆及生物信息学分析

利用RT-PCR和RACE结合的方法,获得了枸杞磷酸乙醇胺N-甲基转移酶PEAMT基因cDNA全序列(命名为LbPEAMT).LbPEAMT cDNA全长1 863 bp,开放读码框1 497 bp,编码一个由498个氨基酸构成的多肽,理论分子量为56.53 kDa,等电点pⅠ为5.50.通过多种序列比对,该基因编码的氨基酸序列与番茄PEAMT氨基酸的相似性为93％.二级结构预测LbPEAMT蛋白由44.98％的α-螺旋、17.67％的延伸链、6.63％的β-转角和30.72％的不规则卷曲组成.LbPEAMT是一个亲水蛋白.含有2个S-腺苷甲硫氨酸依赖催化活性结构域,分别位于N端65-164 aa和C端290-392aa.每个活性区都包含有4个部分基序,分别为Ⅰ、post Ⅰ、post Ⅱ和post Ⅲ.LbPEAMT的这2个活性区在蛋白、磷脂和小分子甲基转移酶中都是相对保守的.     

枸杞苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与表达分析

为研究枸杞苯丙氨酸解氨酶基因LcPAL在干旱和盐逆境中的作用,采用RT-PCR和RACE方法克隆了LcPAL基因(Genbank No.KX781247)。该基因cDNA长度为2 544bp,含有2 163bp的完整开放阅读框,编码720个氨基酸。蛋白序列分析表明,其包含典型的PAL酶活性中心序列(GTITASGDLVPLSYIA),与其他植物的PAL蛋白有很高的同源性。系统进化树表明,枸杞LcPAL与茄科植物的PAL蛋白聚为一类,说明两者的亲缘关系较近。利用实时荧光定量PCR方法检测发现,LcPAL基因在枸杞的叶中表达量最高,果实中表达量最少。其在聚乙二醇(PEG)、氯化钠(NaCl)胁迫下诱导表达,但表达模式不同。研究结果推测从枸杞中克隆获得苯丙氨酸解氨酶(LcPAL),是典型的PAL家族成员,在枸杞各组织发育过程中具有重要功能,且在枸杞抗干旱和抗盐逆境过程也起一定作用。     

枸杞抗坏血酸过氧化物酶基因的克隆与表达分析

为探索青海枸杞抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因信息,并对枸杞APX基因进行生物信息学分析以及基因表达研究,通过RT-PCR和RACE方法克隆枸杞APX基因,利用生物信息学软件预测基因结构,采用实时荧光定量PCR方法分析基因表达的变化。结果显示:枸杞APX基因的全长cDNA序列为1 047bp(Genbank No.KX981601),命名为LcAPX基因。该基因含有1个753bp的完整开放阅读框(ORF),编码250个氨基酸,包含亚铁血红素结合位点、底物结合位点和K~+结合位点。枸杞LcAPX与茄科植物的APX蛋白聚为一类,说明两者的亲缘关系较近。LcAPX基因在枸杞的成熟叶中表达量最高,花中表达量最少。其在聚乙二醇(PEG)、氯化钠(NaCl)胁迫下诱导表达,显示LcAPX在枸杞抗干旱和抗盐逆境过程起一定作用。     

枸杞查耳酮异构酶LcCHI1基因的克隆与表达分析

为探究枸杞查耳酮异构酶CHI1基因在不同组织中的表达模式和功能,利用同源克隆的方法获得1个枸杞（Lycium chinense）LcCHI1基因（Genbank No. OR026273）,通过生物信息学方法分析其理化性质、结构及进化关系,利用荧光定量PCR（qRT-PCR）技术对其组织表达的特异性进行分析,并进行原核表达分析。结果表明：1）枸杞查耳酮异构酶LcCHI1基因的cDNA序列全长695 bp,开放阅读框为633 bp,编码210个氨基酸,含有１个保守的Chalcone_3 family结构域。2）氨基酸序列比对显示,LcCHI1蛋白符合Chalcone蛋白结构特征且与其他物种Chalcone蛋白具有高度的相似性。聚类分析表明,LcCHI1蛋白与茄科的CHI蛋白单独聚成一支。3）LcCHI1在枸杞花、嫩叶与嫩枝中表达量较高,在根中表达量较低。随着枸杞果实的发育,LcCHI1表达呈先升高后降低趋势,在变色果中表达量最高。4）在原核表达载体中构建LcCHI1重组蛋白,经SDS-PAGE电泳分析在63 ku处出现表达蛋白。综上,LcCHI1基因在枸杞花和变色果中表达较高,并能进行原核蛋白表达,研究结果为枸杞类黄酮合成途径中CHI基因的功能验证奠定基础。     

长春花黄素单加氧酶基因的克隆与组织表达分析

利用RACE方法克隆到长春花中编码黄素单加氧酶的基因(YUCCA),YUCCA(YUC)是植物生长素吲哚乙酸(IAA)合成通路上的关键酶。长春花YUC(CrYUC,GeneBank登陆号KF827426)cDNA序列全长1 863bp,包括编码405个氨基酸的1 218bp开放阅读框、5’非编码区、3’非编码区和poly A尾巴;其相应的DNA中有3个内含子。生物信息学分析结果显示:预测CrYUC的分子量为45.3kDa,等电点为9.01;有16个磷酸化活性位点;与其他物种的YUC有较高相似度。初步表达分析发现:YUC在长春花的叶片、花、根及茎中均有表达,且茎及叶片中表达量高于花及根中表达量。     

万寿菊类胡萝卜素裂解双加氧酶基因CCD4b的克隆与表达分析

为探讨万寿菊类胡萝卜素降解过程中CCD4b的功能,以万寿菊(Tagetes erecta L.)‘Scarletade’品种舌状花为试材,利用同源基因克隆获得CCD4b,命名为TeCCD4b (GenBank:KY450708)。序列分析表明TeCCD4b cDNA全长为1 725bp,编码区长度1 392bp,所编码的产物含463个氨基酸,主要定位于质体膜,属RPE65超家族,包含CCD家族保守的结构域;同源分析表明TeCCD4b与向日葵HaCCD4-L、案头菊CmCCD4b同源性最高;系统进化树分析显示TeCCD4b与HaCCD4-L和CmCCD4b亲缘关系最近,与其他物种的CCD4和CCD4a存在差异,表明TeCCD4b在进化过程中保守性不强,不同种属之间具有明显差异,基本符合植物的进化规律;荧光定量PCR结果显示TeCCD4b在舌状花发育过程中均有表达,且与万寿菊花色变化基本一致,表明万寿菊舌状花颜色变化可能与TeCCD4b表达量高低相关。     

枸杞果胶酯酶基因LbPME克隆及表达分析

以宁夏枸杞(Lycium barbarum L.)'宁杞1号'果实为材料,利用RT-PCR技术,克隆出LbPME的全长序列为1152 bp,包含完整的开放阅读框(ORF),编码有384个氨基酸,蛋白质分子量为42.63 ku,理论等电点9.20;LbPME编码的蛋白包含2个可能的N-糖基化结合位点(Asn46和Asn1...     

菠菜胆碱单氧化酶(CMO)基因的克隆及在大肠杆菌中的诱导表达

甘氨酸甜菜碱是一种非毒性的渗透调节物质 ,在植物体内是以胆碱为底物 ,经两步氧化而合成的 .菠菜中 ,催化第一步反应的酶为胆碱单氧化酶 (CholineMonooxygenase ,CMO) .为了研究胆碱单氧化酶基因的功能以及转基因植物的抗逆能力 ,在 30 0mmol L高盐浓度 (n(NaCl)∶n(CaCl2 ) =5 7∶1)的条件下 ,作者分离纯化了菠菜mRNA ,经RT PCR得到全长 (1.3kb)胆碱单氧化酶 (CMO)cDNA ,与已经报道的基因序列相比较 ,同源性为 99% .根据其核苷酸序列推导得到了氨基酸序列 .将PCR纯化产物与pET 30a+ 连接 ,构建了重组表达载体pETCMO ,并转化到大肠杆菌BL2 1(DE3) ,经IPTG诱导获得高效表达 .     

茶树胆碱单加氧酶CsCMO的克隆及甜菜碱合成关键基因的表达分析

【目的】从茶树中克隆甜菜碱（GB）合成途径中的关键酶——胆碱单加氧酶CsCMO,研究不同逆境胁迫和不同抗寒茶树品种间GB合成中关键基因的表达模式,并分析茶树体内GB的含量,为茶树抗性育种奠定基础。【方法】采用反转录PCR结合RACE技术,从茶树中克隆CsCMO的全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析,结合前期克隆得到的茶树甜菜碱醛脱氢酶CsBADH,用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法分析这2个基因的表达模式,紫外分光光度计测定GB含量。【结果】克隆得到茶树CsCMO（GenBank登录号：JX050146）的cDNA全长1 558 bp,包含1 305 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码434个氨基酸,并被定位在叶绿体上。氨基酸序列分析表明,CsCMO含有CMO中保守的Rieske型2Fe-2S结构域和单分子非血红素Fe结合位点,与其它植物CMO序列相似性在50%以上;进化树分析显示,它与枸杞的关系最近。qRT-PCR分析表明,4℃低温、NaCl盐和ABA处理均能诱导CsCMO和CsBADH表达,96 h内随着处理时间的增加,表达量呈增加趋势,但2个基因的表达模式有差异,盐胁迫诱导基因表达更显著;在不同抗寒品种中,2个基因的表达在抗性强的品种中表达量总体要高于抗性弱的品种,且CsBADH的变化比CsCMO的显著。3种胁迫处理48 h后,叶片中的GB含量均增加;低温处理后抗寒性强的品种中GB含量比抗寒性弱的高。【结论】克隆了茶树CsCMO,在低温、NaCl盐以及ABA处理下,GB积累,CsBADH和CsCMO上调表达,且盐胁迫下的表达更明显,表明GB与茶树抵御这3种胁迫关系密切。     

宁夏枸杞甜菜碱乙醛脱氢酶（LbBADH2）的克隆与序列分析

以宁夏枸杞为试验材料,利用同源克隆技术,设计简并引物,克隆得到一个新的甜菜碱醛脱氢酶基因.该基因全长cDNA为1 527个碱基,编码508个氨基酸,编码区两侧翼分别具有5＇UTR （47 bp）和3＇UTR（129 bp）.在推导的氨基酸序列中,含有醛脱氢酶所具有的高度保守的十肽（VrlElGGKSP）以及与酶功能有关的半胱氨酸残基（C）.进化分析表明,它与番茄甜菜碱醛脱氢酶亲缘关系最近,与其他藜科植物亲缘关系较远.该基因的获得有助于理解枸杞这一盐生植物耐盐机理,为培育新的耐盐枸杞奠定理论基础.     

梭梭胆碱单氧化物酶基因(CMO)的cDNA克隆

甜菜碱被认为是在细胞中起着无毒渗透保护作用的细胞相溶性物质,广泛存在于植物、动物细胞中,高等植物中的甜菜碱生物合成是以胆碱为底物催化合成,即:胆碱→甜菜碱醛→甜菜碱,其中第一步是甜菜碱合成的限速反应,由胆碱单氧化物酶(CMO)催化.以梭梭为材料,提取总RNA,用RT-PCR法合成梭梭CMO的cDNA,约为821 bp,测序结果表明,该克隆包含一个完整的开放读码框,编码一个由262个氨基酸构成的多肽,通过BLAST进行同源性比较,发现此基因与菠菜和山菠菜中同源基因CMO的同源性为75%和82%,证明此基因为梭梭的CMO同源基因.     

桑树谷氨酸脱氢酶基因MaGDHs的克隆及表达分析

【目的】克隆桑树的谷氨酸脱氢酶基因GDH,了解其结构、组织特异性表达以及调控特点,并获得桑树谷氨酸脱氢酶蛋白,为进一步研究谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase,GDH）在桑树氮代谢过程中的功能奠定基础,也为多年生木本植物的GDH研究提供参考。【方法】根据川桑基因组数据库搜索GDH同源序列设计引物,以杂交桑品种桂桑优62号（M. atropurpurea Roxb.）cDNA为模板,通过RT-PCR克隆获得MaGDHs。利用NCBI上BLAST和CDD进行氨基酸序列比对和保守结构域分析;利用Expasy在线软件对MaGDH氨基酸组成、分子量、等电点进行分析;采用MEGA 5.0软件构建系统进化树;通过qRT-PCR检测试管苗在不同浓度的蔗糖、铵盐、激素（6-BA）状态下MaGDHs的表达量,用StepOne Software V2.1软件根据2^-△△Ct法进行基因相对表达量分析。以pET-28a(+)、pET-32a(+)、pCold-TF为载体构建MaGDH的融合蛋白重组质粒并转入到大肠杆菌中进行表达。【结果】成功获得2个MaGDHs,序列全长均为1 236 bp,编码411个氨基酸,含一个开放阅读框,分别命名为MaGDH1和MaGDH2。MaGDH1蛋白质的分子量为44.1 kD,理论等电点为5.84,MaGDH2蛋白质的分子量为44.2 kD,理论等电点为6.68。MaGDHs氨基酸序列含有9个外显子,8个内含子,具有线粒体转移肽、Glu/a-KG结合域和NAD(P)结合域,与川桑同源性均为99%,与双子叶植物同源性为90%左右,与单子叶植物的同源性为85%左右。重组蛋白MaGDHs以包涵体的形式在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,经过纯化和复性后获得了具有活性的酶蛋白,酶活性以pET-28a(+)-MaGDH1重组蛋白最高,为10.07 nmol·min^-1·mL^-1。MaGDHs的表达具有组织特异性,在桑花中表达量最高,其次是嫩叶,在果实中几乎不表达。MaGDHs的表达受到蔗糖、NH₄⁺和6-BA的调控。随着蔗糖浓度的增加,MaGDHs表达量增加;过量的NH₄⁺促进MaGDH1的表达,而没有NH₄⁺的情况下,MaGDHs也有表达;细胞分裂素对MaGDHs的表达是先抑制后促进,MaGDH1在24 h后表达增强,MaGDH2在48 h后表达增强。【结论】从桂桑优62号中获得了两个MaGDHs,分别编码β和α亚基。不同载体的重组蛋白酶活性存在差异。MaGDHs的表达具有组织特异性,在桑树生长旺盛的组织中表达量较高。过量NH₄⁺促进MaGDH1表达;MaGDH1响应激素促进表达比MaGDH2早。     

水稻组蛋白H2B.7基因的分离和表达模式研究

选取水稻组蛋白H2B的H2B.7基因进行了表达模式分析,发现其在水稻根、茎、叶和穗等组织中为组成型表达,但在激素和胁迫处理时表达模式发生变化,如在2,4-D、α-萘乙酸(NAA)、乙烯以及热激处理时表达水平上调,在激动素(KT)和多效唑处理时表达水平下调,说明水稻组蛋白H2B.7基因的表达在植物内外环境变化时也会相应发...     

新疆枸杞及枸杞三七复方有效成分的抗衰老作用

探讨新疆枸杞水浸液及其与三七浸提成分复方后的抗衰老作用.采用D-半乳糖皮下注射法建立衰老实验动物模型,以黄嘌呤氧化酶法测定对照组和给药后小鼠血清总超氧化物歧化酶(SOD)的活力并以硫代巴比妥酸(TBA)法测定小鼠血清丙二醛(MDA)的含量.同时进行了实验动物抗疲劳实验检测并观察了肾脏形态学变化.结果表明,新疆枸杞单味及其与三七复方给药后小鼠血清SOD,MDA及抗疲劳等指标均与衰老模型组不同(P<0.05或P<0.01).给药组与衰老模型组小鼠肾小球形态大小、基底膜厚度、内皮细胞窗口分布均有显著差异,新疆枸杞与三七复方后抗衰老作用更为显著.