利用RNA沉默抑制子HC-Pro提高基因表达的策略

利用植物生物反应器生产药用蛋白具有独特的发展优势,但外源基因在受体内会发生基因沉默现象而影响基因的表达。由于基因沉默抑制子能有效抑制外源基因的沉默反应,本研究利用沉默抑制子蚜传辅助因子(helper component-proteinase,HC-Pro)转基因烟草有效提高了外源基因的表达。采用叶片注射法将携带表达载体p35S-30B-GFP的农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)重悬液分别侵染野生型烟草(Nicotiana bentamiana)和HC-Pro转基因烟草(N.bentamiana),通过蛋白电泳检测和Western blot检测技术对绿色荧光蛋白(GFP)表达进行比较。研究结果表明,与野生型烟草Nb相比,HC-Pro转基因烟草中GFP的表达水平显著增加。本研究为基因沉默抑制子在植物生物反应器中的应用提供了理论依据。     

叶绿体转化及其用于疫苗表达研究的最新进展

随着植物转基因研究的不断深入,核基因组转化的转基因沉默现象严重影响了基因工程的应用效果.植物叶绿体遗传转化以叶绿体基因组为平台对植物进行遗传操作,外源基因定点整合及母性遗传特性能较好地解决＂顺式失活＂和＂位置效应＂等类的基因沉默问题和转基因逃逸等安全问题,成为植物基因工程发展的新方向,在工业、农业及医药生物领域发挥了重要作用,也为生产廉价、安全的植物疫苗提供了新思路.本文在简要介绍叶绿体转化的原理、转化方法与优势的基础上,重点综述了近年来通过该技术表达的一些重要的病毒抗原和细菌抗原.最后,对叶绿体转化技术在表达外源基因方面存在的问题进行分析.未来随着叶绿体基因表达、调控机制研究的逐渐深入及相关技术体系的日臻完善,叶绿体转化有望成为疫苗生产的生力军.     

转基因植物中T-DNA整合的分子特征及表达

植物中不同转基因方法转化外源基因的T-DNA整合特征既具有共性,又具有特性,使得转基因的遗传在各独立转化体间呈现多样性,另外多种遗传因子和限制因素使受体植物中外源基因的表达存在下降,甚至出现基因沉默等复杂现象。本文主要对农杆菌介导及裸露DNA直接转化转基因植物中T-DNA的分子特征和转基因表达的影响因子进行了介绍和概述。转化体中转基因的遗传稳定性和表达主要取决于转基因在植物基因组中的整合位置、拷贝数及组成结构。因而,通过对具有表达水平各异的转化体进行深入的遗传分析和分子生物学研究以及转化体之间进行的比较研究,将对转基因技术自身的完善、定点整合以及更有效的利用转基因技术都具有十分重要的意义。     

ipt基因促进矮牵牛遗传转化效率及热激启动子驱动基因删除

本研究主要探讨ipt基因对矮牵牛遗传转化不定芽诱导影响及拟南芥热激启动子hsp18.2驱动重组酶基因flp的热诱导外源基因删除表达载体在矮牵牛中的基因删除效果。本研究中将植物表达载体pBin-hsp18.2：flp-35S：ipt及对照载体pBin-hsp18.2：flp遗传转化矮牵牛,以获得转基因植株,分析比较不定芽的诱导和转基因植株进行的热激基因删除。研究结果表明,ipt基因可促进矮牵牛遗传转化过程中不定芽的诱导,其不定芽诱导率为21.5%,显著高于对照的8.7%。在44℃,6h,热激6次的条件下,转基因矮牵牛植株表型恢复正常,经GUS蛋白表达分析及PCR、RT-PCR检测,证明外源基因已经被删除。转基因矮牵牛基因删除效率最高可达43.8%。本研究为ipt基因在一些遗传转化困难植物转基因中的应用奠定了基础。     

同位素示踪技术与转基因植物生态风险性评价研究

综述了外源基因及其表达产物在农业生态环境中的行为与归宿以及T DNA在土壤中的持留及其向土壤细菌水平转移的可能性等方面的国内外研究进展 ,探讨了同位素示踪技术应用于转基因表达产物的环境行为与归趋、转基因植物中T DNA向土壤细菌水平转移的可能性、转基因植物根系分泌物的组成和根际土壤养分循环规律以及转基因植物对有毒重金属和农药等典型污染物超积累的可能性等研究的优势所在。     

动物转基因技术研究新进展

动物转基因的关键限制因素是制备效率和基因表达的精确调控.综述了近年发展的提高转基因效率的非定点整合转基因方法,如睾丸转基因法和卵巢转基因法;提高转基因精确性的定点整合转基因的基因打靶法;调控外源基因表达的时空表达和可控表达转基因策略;通过转基因对特定基因的进行表达时空和可逆的RNA干扰灵活精细调控.对这些新的转基因方法的优缺点进行了讨论,并探讨如何利用这些方法进行转基因动物的制备.     

不同转化方法获得的转基因棉花外源基因拷贝数分析

转基因植物中外源基因拷贝数是影响其自身表达水平与遗传稳定性的重要因素.本研究旨在比较农杆菌介导法、基因枪轰击法和花粉管通道法等3种常用方法转化同一植物表达载体的转基因棉花(Gossypium hirsutum)中外源基因拷贝数的差异.本文主要采用实时定量PCR技术及相应的PfaffI分析法检测转基因棉花单株拷贝数,并与Southern杂交做了相互验证.实时定量PCR研究结果显示,农杆菌介导法、基因枪轰击和花粉管通道注射法获得的T0代转化体中,外源基因拷贝数为1～2的单株占群体总数的百分比分别为26.2%、60%和42.8%.外源基因拷贝数为3～5的单株比例分别为47.5%、40%和57.1%.另外,农杆菌介导获得的转基因群体中有高达27.3%的单株整合有5拷贝以上的外源基因,而基因枪轰击和花粉管通道注射法获得的转基因群体中没有发现5拷贝以上的转基因单株.研究结果表明,基因枪轰击和花粉管通道注射法均能获得较高比例低拷贝(1～3拷贝)的转化体.本研究结果对棉花转基因育种中转化方法的选择有一定的理论指导意义.     

毛白杨杂种外源基因稳定性及其对土壤微生物的影响

转基因植物外源基因的稳定性、对土壤微生物种群数量的影响以及外源基因是否水平转移到土壤微生物中,是评估转基因植物生态安全性的重要组成部分.本研究利用PCR技术,分析了种植于山东省东营市试验林达3年的转AhDREB1基因毛白杨杂种(毛新杨×毛白杨)的外源基因稳定性.表明AhDREB1基因仍然存在于转基因植株中.采用平板稀释法对转基因与非转基因植株的根系土壤微生物进行种群数量分析,计数结果表明转基因植株与非转基因植株间根系土壤3大类微生物(细菌、放线菌和真菌)数量无显著差异.利用AhDREB1基因特异引物对土壤总DNA以及菌株DNA进行PCR扩增,均未检测到外源基因扩增产物.研究结果表明该转基因毛白杨杂种对土壤微生物系统尚无明显的影响.     

转基因阿尔巴斯白绒山羊外源DsRed基因拷贝数与外源基因表达的关系

转基因动物的外源基因通过使用体细胞克隆与胚胎移植的方法将表达载体转入细胞后获得,大多以随机整合的形式存在于受体动物的基因组中,而转基因动物中外源基因的整合拷贝数是影响外源基因表达水平及遗传稳定性的重要因素之一,作为转基因动物遗传稳定性的鉴定指标,获得存活的转基因动物后便有必要对其外源基因拷贝数进行检测.为了研究转基因阿尔巴斯白绒山羊(Capra hircus)基因组内外源海葵红色荧光蛋白(red fluorescence protein from Discosoma sp.,DsRed)基因的拷贝数与其表达量之间是否存在一定的联系,本研究采用较鉴定外源基因拷贝数的传统方法DNA印迹杂交(Southern blot)更为高效率、高灵敏度、高准确性的绝对定量qRT-PCR法检测了6只转基因白绒山羊外源DsRed基因表达框中3个不同片段的拷贝数.结果表明,外源基因3个片段的拷贝数分别为巨细胞病毒(Cytomealovirus,CMV)启动子:2.80±0.38～13.68±0.16;DsRed基因:1.34±0.04～11.84±0.02;CMV启动子与DsRed连接处:1.58±0.04～19.22±0.38.通过qRT-PCR中相对定量的方法检测了6只转基因白绒山羊外源DsRed基因mRNA表达量,将其与外源基因中3个不同片段的拷贝数数据分别使用SPSS软件进行相关性分析后,相关性系数P值的结果为:CMV启动子为P=0.763;DsRed基因为P=0.665;CMV启动子与DsRed连接处为P=0.803,3组P值均大于0.05,无显著性相关.上述结果表明,在所检测的6只转基因阿尔巴斯白绒山羊中外源CMV启动子启动的DsRed基因的表达量与其在转基因白绒山羊基因组内的拷贝数在0.05的水平没有显著相关性.另外验证了绝对定量qRT-PCR法在大型转基因家畜的外源基因拷贝数的研究中的可靠性:其重复性良好,误差可控,可以成为检测转基因动物外源基因拷贝数的首选方法.     

转基因植物疫苗的研究进展

随着基因工程技术、免疫学和分子生物学技术的飞速发展,疫苗的种类不断增多、生产方式不断建立和优化。利用转基因技术将植物作为生物反应器,生产出转基因植物疫苗已成为研究热点之一。转基因植物疫苗的制备主要通过目标抗原的确定、受体植物的选择、植物表达载体的构建、转化、表达及检测等步骤组成。目前,转基因植物疫苗按照功能可大体分为细菌疫苗、病毒疫苗、寄生虫疫苗、避孕疫苗及糖尿病疫苗等,并已成功在植物中陆续表达了抗原基因。经一系列生物或临床试验后,在机体中均产生了明显的免疫应答,在试验范围内分别起到了抵抗病原微生物、防治寄生虫、避孕、预防治疗糖尿病等作用。通过优化启动子、选取高表达量受体植物、采用外源蛋白叶绿体表达、敲除转基因植物抗性基因等手段,将不断弥补转基因植物疫苗应用方面的不足。本文主要综述了转基因植物疫苗创制的基本流程、研究进展等,以期为今后转基因植物疫苗的开发和应用提供参考与思路。     

利用植物悬浮培养细胞进行蛋白质快速定位分析的方法

稳定遗传表达分析是一种植物中常用的整体解析基因的方式。有多种转化方式可供选择,也可根据所需要的获得的转基因植物材料选择受体材料。但是由于稳定遗传转化周期较长且大部分材料不适合于进行荧光观察,所以在一些基因的研究中逐渐被瞬时表达分析系统。虽然瞬时表达分析用时短,但是转化效率受到多方面的限制,转化材料无法保存。目前由于植物悬浮培养细胞材料均一,增殖迅速并且可以满足大批量研究需求逐渐成为植物研究中的热点材料。以此同时,在亚细胞定位方面,悬浮培养细胞还是良好的应用材料。采用农杆菌介导法进行植物悬浮培养细胞的转化中方法较为成熟,但是获得纯净的转基因细胞系的转化周期较长。在本研究中针对上述问题我们建立了一种转化时间短,转化效率高的植物悬浮培养细胞稳定遗传转化体系。同时将这个体系应用到基因的亚细胞定位当中进行蛋白质快速定位分析。     

遗传转化KN1基因促进毛果杨外植体再生

已有研究表明玉米同源异形盒（homeobox）基因Knotted1（KN1）超量表达会导致转基因烟草、拟南芥和番茄等植物中细胞分裂素含量增加,提高转化效率。由于木本植物遗传转化困难,且毛果杨可作为木本植物研究的模式植物,因此,本研究利用农杆菌介导法,将35S启动子驱动的玉米KN1（35S：：KN1）基因导入毛果杨,并分析KN1基因表达对毛果杨再生率的影响。研究结果表明,经GUS组织化学染色及PCR分子鉴定,KN1基因已经成功导入毛果杨幼苗;KN1基因对毛果杨外植体愈伤诱导率影响不明显,但单个外植体芽诱导率比对照高0.96倍,毛果杨的再生频率明显提高;与移栽成活的野生对照植株相比,转化KN1基因植株出现叶片变小,叶色变深,在叶片边缘产生裂片,分枝增加,无顶端优势等特殊表型。本研究中KN1基因引起转化植株表型变化,因此在毛果杨的遗传转化中,可作为一种有效的正向选择标记基因。     

Genetic Engineering in Pea Crop Improvement

Abstract

Genetic engineering can be used to complement traditional breeding programmes in those plant species where suitable tissue culture and transformation methods allowing regeneration of fertile transgenic plants have been developed. Pea, an important legume crop, was earlier considered to be recalcitrant to genetic engineering. Recent advances in tissue culture methods have, however, made it possible to obtain fertile transgenic pea plants. This paper summarizes the results obtained in developing transformation methods for pea.     

小油桐外植体的KN1基因遗传转化及其超量表达的转基因植株

本研究采用农杆菌介导法将KN1基因遗传转化小油桐,并获得了转基因植株。在研究中分析了农杆菌菌液菌液的浓度、侵染时间和外植体的大小对遗传转化效率的影响以及KN1基因超量表达对转基因植株再生的影响。研究结果表明：以苗龄15d左右的小油桐无菌苗子叶为外植体,农杆菌菌液浓度OD600为0.6～0.8时,侵染8min,外植体大小为（0.8×0.8）～（1.0×1.0）mm时,遗传转化效果最好;对抗性芽及再生植株进行GUS及PCR检测结果表明,KN1基因已经整合到小油桐植物基因组中。KN1基因的超量表达可提高小油桐再生芽分化,影响转化芽及植株的外观形态及叶片的表型,包括芽及植株矮小,茎杆粗壮;叶片缩小,边缘分裂,对称性丧失,无子叶柄等。     

转基因高粱Cry1Ab蛋白含量的比较研究

通过农杆菌介导法将杀虫晶体蛋白基因cry1Ab导入高粱恢复系115中,共获得13个独立的转基因株系,26株转基因植株,转化率为5.1%;GUS活性、PCR、Southern和Western杂交分析表明,此基因已整合进高粱基因组并得到正确表达。利用ELISA试剂盒测定Cry1Ab蛋白含量,结果表明,不同转基因植株的Cry1Ab蛋白含量有明显差异,最高可达0.850 μg/g,占可溶性蛋白的0.016%,还有一些转基因植株中不能表达;同一转基因植株的不同组织中表达量有明显差异,其顺序为：叶>颖壳>籽粒>根>茎;不同部位的叶片也有差异,其顺序为：中部叶>基部叶>新叶。     

Brassicaceae,a Plant Family Well Suited for Modern Biotechnology

Abstract

A survey of recent progress in various biotechnological areas, on various Brassica crops, is presented. Wide hybridization and subsequent culture of embryos, ovaries and ovules can facilitate sexual gene transfer between species. The protoplast fusion technique extends the possibilities of transferring genes between species, even from different genera and tribes, it being independent of sexual incompatibility barriers. Furthermore, somatic hybridization provides novel possibilities for modifying the organelle composition of plants. Genetic engineering for crop improvements and fundamental studies in plant biology involve isolation of genes, studies of gene expression and gene regulation. In order to change or improve agronomically desirable traits, or to investigate further specific gene functions, methods for transfer of cloned genes into plants have developed. Furthermore, cryopreservation would enable conservation of genetic material, including genetically modified plants deriving from various biotechnological manipulations.     

抗草甘膦EPSPS转基因棉花的研究

林敏教授课题组从具有草甘膦抗性的荧光假单胞菌G2中克隆了EPSP合酶基因aroAG2，根据aroAG2的氨基酸序列，按照双子叶植物偏爱密码子人工合成aroAG2M基因。我们利用aroAG2M基因和Impactvector1.4，构建了以菊花Rubisco启动子和叶绿体信号肽驱动aroAG2M基因高效表达的植物表达载体Pim1.4-epsps-plus，以农杆菌介导法转化烟草，转基因烟草经PCR和Southern检测，证明外源基因已整合到基因组中，转基因烟草具有草甘膦抗性。以花粉管通道法转化棉花，经草甘膦抗性筛选得到T1代转基因棉花3株，转基因棉花的PCR和Southern检测结果均为阳性，说明目的基因已通过花粉管通道法导入棉花。