白斑综合征病毒卵黄抗体对凡纳滨对虾免疫相关酶活力和抗病毒能力的影响

摘要：免疫活性物质可以调动或激活虾类自身的免疫系统,提高动物的免疫机能,增强动物的抗病毒能力。有关卵黄抗体对对虾体内酶活力及抗病毒能力的影响,国内外尚未见报道。本实验通过连续投喂的方法,用3个水平(1%、0.5%、0.1%)的Ig-Guard(shrimp)制成的试验饲料,同时以基础饲料为空白对照饲喂凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei) 20 d,分别测定了第5,10,15,20 d血淋巴的酚氧化酶(PO)、溶菌酶(UL)、酸性磷酸酶(ACP)及肌肉匀浆液的超氧化物歧化酶(SOD)等非特异性免疫因子活性,并对血清及肌肉匀浆液中蛋白进行定量。结果表明,免疫组的PO、UL、ACP、SOD活力均显著高于对照组(P<0.05)。免疫20 d后,用白斑综合征病毒(WSSV)投喂感染。攻毒后第7 d各免疫组的相对免疫保护率分别为17.95%、23.08%、35.90%。实验结果说明,Ig-Guard(shrimp)能有效提高对虾免疫因子的活性,对于提高抗WSSV感染能力也有一定作用。将对虾免疫因子活性和累计死亡率协同分析,摄食低浓度Ig-Guard(shrimp)组较之高浓度组的酶活力高,其累计死亡率低,故笔者建议适当地投喂低浓度Ig-Guard(shrimp)更为合理。     

凡纳滨对虾抗WSSV选育家系的建立及其抗病特性

2002-2007年在人工感染白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)的基础上进行一代个体选育(G1)后,对凡纳滨对虾连续进行4代家系选育,共建立120个抗WSSV家系,感染实验结果显示,G2～G5选育家系对虾平均成活率分别为5.57％ ±9.83％,8.66％±11.52％,9.52％ ±8.84％和13.79％±12.86％;G2～G5选育家系对虾平均成活率的变异系数分别为1.77、1.40、0.97和0.87.根据每个家系对虾的成活情况每个世代可分为敏感、中等抗性和高抗性家系,G2～G5敏感家系在各代选育家系中的比例逐年下降,分别占76.5％、55.2％、51.4％和33.3％,抗病成活率分别为0.44％±1.09％、0.78％±1.70％、2.27％±2.76％和2.44％±3.09％,感染WSSV后2～3d出现1个急性死亡高峰;中等抗病家系在各代选育家系中的比例逐年上升,分别占0、20.7％、31.1％和38.5％,抗病成活率分别为0、9.08％±1.46％、10.7％±1.41％和11.36％ ±3.30％,感染WSSV后出现2个死亡高峰,第1死亡高峰值大于第2高峰;高抗家系在各代选育家系中的比例逐年上升(G4除外),分别占23.5％、24.1％、17.1％和28.2％,抗病成活率分别为22.23％±5.21％、22.70％±12.30％、24.45％ ±6.56％和28.98％ ±8.09％,感染WSSV后出现2个死亡高峰,第1死亡高峰值小于第2高峰.经连续的定向选育,对虾抗病性状一代比一代强,表现出明显的抗病性能,特别是高抗对虾不仅死亡率低且其死亡高峰推迟2～3d,延缓了对虾WSSV暴发的时间,但是每代每尾对虾平均产卵量逐年下降.     

卵黄抗体对凡纳滨对虾生长、免疫及抗VpAHPND感染的影响

为探讨特异性卵黄抗体抗致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌 (Vibrio parahaemolyticus associated with acute hepatopancreatic necrosis disease, VpAHPND) 感染的效果及其机制,防控对虾急性肝胰腺坏死病 (Acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND),本研究以添加不同剂量VpAHPND卵黄抗体制剂 (0、0.2%和0.5%) 的饲料投喂凡纳滨对虾幼虾,测定对虾的生长率和存活率、对虾肝胰腺免疫酶活力和免疫基因相对表达水平,通过浸浴感染实验测定免疫对虾抗VpAHPND感染的能力。生长实验结果显示,免疫28 d后,免疫组与未添加卵黄抗体制剂的对照组对虾在平均生长率、特定生长率和存活率方面均无显著性差异。免疫功能实验结果显示,免疫14 d后,与对照组相比,0.2%免疫组对虾肝胰腺的酚氧化酶 (PO)、超氧化物歧化酶 (SOD)、溶菌酶 (LZM) 活力显著升高,抗菌肽 (Crustin) 基因的相对表达水平也显著升高,而β-1,3-葡聚糖结合蛋白-脂蛋白 (β-GBP-HDL) 基因的相对表达水平则显著降低。浸浴感染实验结果显示,0.2%免疫组对虾的存活率显著高于对照组;0.2% VpAHPND卵黄抗体制剂对凡纳滨对虾的相对免疫保护率为63.77%。研究表明,口服卵黄抗体不会对凡纳滨对虾的生长和存活产生不良影响,0.2%的VpAHPND卵黄抗体制剂通过提升凡纳滨对虾的PO、SOD、LZM活力和Crustin基因表达水平,增强凡纳滨对虾的免疫功能,从而提高对虾抗VpAHPND感染的能力,具有很强的应用潜力。本研究为使用特异性卵黄抗体防控AHPND提供了依据,也为其作用机制研究提供了参考。     

毒死蜱胁迫下WSSV对凡纳滨对虾的致病性

为了评价养殖水环境中毒死蜱对凡纳滨对虾生存的危害性,开展了毒死蜱胁迫下白斑综合征病毒(WSSV)对凡纳滨对虾致死实验,分析了毒死蜱胁迫下凡纳滨对虾鳃组织WSSV含量和肌肉组织乙酰胆碱酯酶活性变化。通过急性毒性实验测定了毒死蜱对凡纳滨对虾的半致死浓度(LC₅₀),随着暴露时间的延长,LC₅₀值显著下降,存在着浓度-反应的正向关系,96 h LC₅₀为0.758 μg/L(0.521～0.987 μg/L)。在此基础上,确定了毒死蜱胁迫实验浓度为0.2 μg/L,此浓度下药浴4 d后对凡纳滨对虾注射WSSV,结果显示:毒死蜱胁迫下注射WSSV组的对虾死亡率(83.33?Ee4.7%)极显著高于乙醇-WSSV组(40.00?Ee0.9%);对虾鳃组织WSSV荧光定量PCR检测结果显示:感染72 h后,毒死蜱-WSSV组WSSV含量约是乙醇-WSSV组的4倍;感染96 h后,毒死蜱-WSSV组WSSV含量显著增加,约是72 h毒死蜱-WSSV组的4.9倍,是96 h乙醇-WSSV组的5.9倍。毒死蜱胁迫下,对虾肌肉组织乙酰胆碱酯酶(AchE)活性低于对照组20%左右。由此可见,毒死蜱胁迫下,WSSV增殖速率加快,导致对虾死亡率升高。     

氨氮和亚硝基氮共同胁迫对凡纳滨对虾感染WSSV的影响

为了评价养殖水环境中氨氮和亚硝基氮对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的危害性,开展了氨氮和亚硝基氮共同胁迫对凡纳滨对虾感染WSSV后的死亡率、WSSV在患病对虾体内增殖速率和对虾主要免疫相关酶活性影响的研究。实验设置氨氮(NH+4)和亚硝基氮(NO-2)的共同胁迫浓度均为20 mg·L-1,分别注射10-4和10-5稀释度的WSSV提取液。结果显示,胁迫下感染10-4WSSV的凡纳滨对虾144 h死亡率达到100%,显著高于无胁迫组(76.67%),相同实验条件下高浓度病毒感染组死亡率高于低浓度组。对虾鳃组织WSSV荧光定量PCR检测结果显示,氨氮和亚硝基氮共同胁迫下凡纳滨对虾体内WSSV的增殖加快,感染48 h后胁迫组病毒量是无胁迫组的1.6倍,72 h时病毒量达到无胁迫组的2.0~3.7倍。此外,免疫相关酶活性结果显示,氨氮和亚硝基氮浓度突变会促使对虾血清中酚氧化酶(PO)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)活性先短暂升高然后降低。由此可见,氨氮和亚硝基氮共同胁迫会加快WSSV在患病凡纳滨对虾体内的增殖,导致更高死亡率,这可能是因为胁迫造成了对虾免疫相关酶活性的降低和抗病原感染能力下降所致。     

2株消化道优势菌对凡纳滨对虾免疫酶活性和抗白斑综合征病毒感染力的影响

以凡纳滨对虾为研究对象,在基础饲料中分别添加从健康对虾消化道中分离纯化的优势菌菌株——美人鱼发光杆菌PC463和坚强芽孢杆菌PC465(菌含量≥1011CFU/g)的活菌和破碎菌各1 g/kg,观察其对凡纳滨对虾血淋巴免疫酶活性和抗WSSV感染保护率的影响。经过20 d养殖实验后发现,与对照组相比,饲料中添加坚强芽孢杆菌活菌的免疫组和添加美人鱼发光杆菌灭活菌的免疫实验,其凡纳滨对虾血淋巴中酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性在不同程度上有所提高,并显著高于对照组(P<0.05)。WSSV感染后饲料中添加坚强芽孢杆菌活菌的免疫组存活率(53%±12%)和添加美人鱼发光杆菌灭活菌的免疫组存活率(49%±15%)显著高于对照组(P<0.05)。结果表明:饲料中添加坚强芽孢杆菌活菌和美人鱼发光杆菌灭活菌可以在一定程度上提高凡纳滨对虾免疫酶活性和抗WSSV感染能力,上述有防病作用的益生菌株以饲料添加剂的方式应用于对虾养殖生产,可望成为对虾白斑病生物防治的有效途径之一。     

凡纳滨对虾白斑综合征血液病理研究

对自然发病、投喂和注射感染的凡纳滨对虾白斑综合征（white spot syndrome,WSS）血液病理进行研究,结果发现：不同感染方式患病对虾的血液病理变化相似,表现为：1．患病对虾血细胞总数、透明细胞数量极显著减少,小颗粒细胞、大颗粒细胞极显著增加。2．显微病理变化主要表现为血涂片中血细胞明显减少且分布不均匀,破损或解体的细胞增多,呈典型的溶血状态。3．超微病理变化表现为,大部分血细胞坏死,少数血细胞呈不典型的凋亡。患病对虾的血细胞核中可见大量白斑综合征病毒（white spot syndrome virus,WSSV）粒子。病理变化表明血细胞是WSSV的主要靶细胞。     

氨氮胁迫对凡纳滨对虾肠道免疫相关指标的影响

为研究急性氨氮胁迫对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)肠道免疫功能的影响,将对虾暴露于氨氮浓度为20 mg·L^-1的海水中72 h,测定了不同时间点肠道中抗病原感染指标如酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(ALP)、溶菌酶(Lys)、酚氧化酶原(proPO)以及抗氧化功能指标如总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、热休克蛋白70(HSP70)、热休克蛋白90(HSP90)等变化。结果显示,与对照组相比,氨氮胁迫后:1)ACP和ALP活性均于6 h显著升高(P<0.05),随后于48～72 h显著低于对照组(P<0.05);Lys活性于24 h显著升高至最大值(P<0.05),随后于72 h显著低于对照组(P<0.05)。2)T-AOC和SOD活性均于6 h和12 h显著高于对照组(P<0.05),随后于48 h和72 h显著降低(P<0.05)。3)HSP70基因表达水平于24 h显著升高至最大值,随后虽有降低,但仍显著高于对照组(P<0.05);HSP90和proPO基因表达水平均于12...     

vp28重组核酸疫苗对凡纳滨对虾抗WSSV感染的免疫反应和保护效果

利用改构的pEGFP-N1-ie1强启动子载体构建含vp28基因的核酸疫苗,通过肌肉注射和饲料添加的形式免疫对虾,分析各实验组相对保护率和免疫基因(Dicer,Argonaute,STAT和Lyzome)表达,研究构建vp28重组核酸疫苗对凡纳滨对虾的保护效果。RT-PCR结果表明,注射和口服vp28组均可在对虾鳃组织中检测到vp28基因表达。在注射组中vp28的相对保护率为22.4%,饲料免疫组中vp28的相对保护率可达到36.84%。相对于对照组,vp28的注射组的STAT基因和Dicer基因表达量于第7天达到最大值。Argonaute基因表达量于第3天达到最大值,以后呈下降趋势。溶菌酶基因表达量一直呈相对较高的趋势。vp28的饲料投喂组的STAT基因和Argo-naute基因表达量于第7天达到最大值,以后呈下降趋势。Dicer基因表达量第3天达到最大值。实验结果表明,构建的vp28核酸疫苗在对虾抗WSSV防治中具有潜在应用价值。     

凡纳滨对虾感染白斑综合症病毒后的新症状

2007年6-7月,辽宁营口地区凡纳滨对虾养殖场陆续出现死虾现象,通过组织病理观察和PcR检测,确定为白斑综合症.患病初期,对虾并未表现出典型白斑、甲壳易剥离等症状,而在鳃区头胸甲内侧滋生一种囊状胶状物,导致头胸甲内侧肿胀,病理观察发现该滋生物为对虾感染白斑综合症病毒后,皮下组织\"胶质化\"的结果,同时胃和皮下组织的结缔组织中有大量的典型性病变核;细菌分离结果显示,伴随着弧菌和假单胞菌的混合感染.     

中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)和凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)对白斑综合征病毒的敏感性比较

本研究分别对中国对虾野生群体(Wild-Fenneropenaeus chinensis, W-Fc)、中国对虾选育群体‘黄海2号’(Selected-Fenneropenaeus chinensis, S-Fc)和凡纳滨对虾商业一代苗种(Commercial- Litopenaeus vannamei, C-Lv)采用单尾定量口饲感染白斑综合征病毒(WSSV),比较W-Fc、S-Fc及C-Lv对WSSV的敏感性差异。结果显示,感染同等含量WSSV后,W-Fc、S-Fc和C-Lv的平均存活时间分别为(124.11±39.49) h、(166.79±51.54) h和(136.90±41.99) h,3组对虾间的平均存活时间存在显著性差异(P<0.05)。3组对虾在感染期间的死亡趋势：W-Fc在96 h达到死亡高峰,并且一直持续到216 h;S-Fc和C-Lv在144 h出现死亡高峰。另外,分别在感染后的3、6、12、24、36、48、72、144 h共8个时间点对3组对虾进行活体取样,利用实时荧光定量RT-PCR技术对其进行了病毒载量检测,从对虾存活时间和体内肌肉组织病毒载量的角度比较不同对虾抗病性能的差异,结果如下：48 h时,W-Fc、S-Fc和C-Lv3对虾体内肌肉组织的病毒载量分别为(1.22×106±6.14×105)、(7.10×103±7.26×102)和(1.50×104± 4.19×103) copies/ng DNA;144 h时,3组对虾体内肌肉组织病毒载量分别为(8.44×106±1.25×106)、(3.21×106±8.21×105)和(1.49×106±6.59×105) copies/ng DNA。实验结果显示,3组对虾对WSSV敏感性从高到低依次为中国对虾野生群体、凡纳滨对虾商业苗种、中国对虾选育群体,表明中国对虾选育群体‘黄海2号’在人工感染WSSV条件下表现出了良好的抗病性能。     

不同温度下凡纳滨对虾和中国明对虾对白斑综合征病毒(WSSV)耐受性比较

本研究分别对凡纳滨对虾\"壬海1号\"(Litopenaeus vannamei\"Renhai No.1\")和中国明对虾\"黄海2号\"(Fenneropenaeus chinensis\"Huanghai No.2\")在3种温度条件下(24℃、28℃和32℃),采用单尾定量口饲感染白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)的方法进行感染实验,比较2种对虾在不同温度情况下对WSSV的耐受性差异(L代表凡纳滨对虾,F代表中国明对虾)。结果显示,L-24℃和F-24℃组的平均存活时间分为(184.05±69.56)h和(101.68±38.45)h;L-28℃和F-28℃组的平均存活时间分别为(100.25±26.79)h和(73.38±22.22)h,相同温度组内均存在显著性差异(P0.05);截至第15天,L-32℃和F-32℃组的存活率分别为45.74%和23.47%。3个温度组对虾在50%的死亡率时的存活时间分别为178 h和98 h、98 h和74 h、292 h和78 h;死亡高峰时间分别为第5天和第4天、第5天和第4天、第10天和第4天。另外,分别在感染后的12 h、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、15 d共9个时间点对每组对虾进行活体取样,利用实时荧光定量RT-PCR技术对其进行病毒载量检测,从对虾体内肌肉组织病毒载量的角度探寻不同对虾抗病性能的差异。6 d时,L-24℃和F-24℃组对虾肌肉内病毒载量分别达到(2.97×10~6±7.44×10~6)和(8.08×10~6±3.22×10~6)copies/ng DNA,差异极显著(P0.01),L-28℃和F-28℃组分别达到(6.73×10~6±1.49×10~6)和(1.20×10~7±6.15×10~5)copies/ng DNA,差异极显著(P0.01);15 d,L-32℃和F-32℃组分别达到(5.18×10~4±4.32×10~4)和(3.78×10~4±8.97×10~4)copies/ng DNA,差异显著(P0.05)。研究表明,2种对虾在3种温度环境下感染WSSV后,凡纳滨对虾耐受WSSV能力要高于中国明对虾;不同温度下同种对虾肌肉体内WSSV的增殖能力从强到弱依次为28℃组、24℃组和32℃组。     

凡纳滨对虾氨氮急性胁迫应激敏感群体和耐受群体对WSSV敏感性的差异分析

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)是世界范围内举足轻重的水产养殖品种,在普遍的高密度养殖活动及环境恶化的情况下,逆境胁迫是影响其养成率的主要因素之一,其中,高浓度氨氮胁迫是最普遍的毒理因子。由于对虾抗病性状的遗传力较低,且在受限于测试场地的低选择强度情况下,抗病选育的进展比较缓慢。而对虾的抗逆性具有较高的遗传力,且不具备传染性的特点使得其不受测试场地的限制。因此,本研究以氨氮急性胁迫应激敏感群体(SP)和耐受群体(TP)为实验材料,对其进行白斑综合征病毒(WSSV)敏感性差异分析,首次探索了通过提高对虾对逆境急性胁迫应激的耐受性,从而间接提高其抗病力的可能性。本研究每个群体设3个处理:高浓度氨氮胁迫下(10 mg/L)WSSV感染组,两群体分别命名为SPAV和TPAV;正常海水条件下(氨氮水平小于0.01 mg/L)WSSV感染组,分别命名为SPV和TPV;正常海水条件无WSSV感染组(空白对照组),分别命名为SPC和TPC。结果显示,SP群体(5 h)在WSSV感染后开始死亡的时间显著早于TP群体(16 h);从感染60 h后,SPAV组的死亡率呈直线上升趋势,到137 h时该组全部死亡,其累积死亡率显著高于SPV(70.42%)和TP群体的2个组TPAV(42.67%)和TPV(18.99%)(P0.05)。在144 h实验结束时,SPV的累积死亡率为73.67%,显著高于TP群体的2个组TPAV(46.15%)和TPV(18.99%)以及SP群体的对照组SPC(34.79%);此时,TPAV组的累积死亡率显著高于TPV和TPC组(P0.05),而TPV与TPC组间无显著差异。研究表明,逆境毒理因子(氨氮胁迫)会增加对虾对病原的敏感性,而且对氨氮急性胁迫应激耐受力高的群体对病毒的抵抗力也高。本研究为探索提高对虾抗病力而降低养殖过程中的死亡率提供了新的思路和途径。     

Experimental white spot syndrome virus challenge of juvenile Litopenaeus vannamei (Boone) at different salinities

In recent years, the shrimp industry has turned to inland freshwater culture as one method to avoid problems such as the introduction of possible vectors of viral pathogens into seawater ponds. Our experiments evaluated susceptibility to white spot syndrome virus (WSSV) in Litopenaeus vannamei held under different salinity regimens. Juvenile L. vannamei that were conditioned at salinities of 35, 25, 15, 5 and 2 g L⁻¹ were challenged with WSSV. In order to assess the severity of white spot disease, histological analysis and nested polymerase chain reaction (PCR) tests were carried out on the challenged shrimp every 4 h after 48 h post challenge. The results indicated that significantly more severe infections resulted at 15‰ than at other salinities. Mortality could not be compared due to the sampling design and because severe WSSV infections occurred in all test groups such that few shrimp remained alive in each challenged group at the end of the test. Despite this, the results suggest that salinity may affect the course and outcome of WSSV infections.     

3种市售养殖对虾白斑综合征病毒(WSSV)的核酸探针检测

对虾白斑综合征病毒是对虾养殖业危害最为严重的病毒, 每年给对虾养殖造成很大经济损失, 已成为对虾养殖业可持续发展的严重障碍。在过去的十几年中, 人们采取各种方法防止白斑综合征病毒的传播。中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis )、凡纳滨对虾( Litopenae vannamei)、日本囊对虾(Marsup enaeus jap onicus)是我国主要的对虾养殖品种, 也是白斑综合征病毒的敏感宿主。按照煮沸- 乙醇沉淀法快速、简便提取市售30 只中国明对虾、28只凡纳滨对虾、29只日本囊对虾DNA, 然后用地高辛标记的核酸探针进行斑点杂交检测白斑综合征病毒,从而了解市场中养殖对虾携带白斑综合征病毒的情况。检测结果显示, 所有样品均未感染白斑综合征病毒, 说明目前白斑综合征病毒在一定程度上得到了有效控制。     

白斑症病毒在日本对虾体内的感染增殖

用投喂患白斑症病毒病的虾组织人工感染日本对虾稚虾,每日取样,整虾冰冻切片,单克隆抗体的荧光抗体方法,原位观察病毒在虾体内的感染增殖,结果表明：感染后三天内,在感染虾的各组织器官内均未观察到明显的病毒感染的阳性细胞,每四天首先在鳃丝腔内的小量血细胞观察到病毒感染;第五天除血细胞外同时在血窦,鳃上皮组织,皮下组织内观察到,第六天进而在心脏,胃上皮组织内观察到：第七天进一步又在淋巴器官,中肠内观察到,八     

抗副溶血弧菌卵黄抗体制备及其与不同血清型菌株交叉反应研究

为探索卵黄抗体对防控凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 养殖中副溶血弧菌 (Vibrio parahaemolyticus) 病的潜在作用,将2种血清型 (O1:KUT和OUT:KUT) 的3株副溶血弧菌制备成灭活疫苗,分别免疫产蛋鸡制备卵黄抗体。通过ELISA实验和试管凝集实验,评估了卵黄抗体的效价消长规律、抑菌效果和交叉反应情况。结果显示：3株副溶血弧菌均能诱导高特异性水平的卵黄抗体,抗体凝集效价和ELISA效价的消长趋势相近,均在4免后10~60 d达到卵黄抗体的效价平台期,凝集效价在1∶8以上,ELISA效价在1∶6 400以上;卵黄抗体与血清型相同的其他副溶血弧菌发生强烈的交叉ELISA和交叉凝集反应,但与血清型不同的副溶血弧菌有较低的交叉ELISA反应,无交叉凝集反应。研究表明副溶血弧菌能刺激蛋鸡产生高特异性水平的卵黄抗体,对不同血清型菌株不具有交叉保护效果,可为抗副溶血弧菌卵黄抗体产品的开发与应用提供参考。