水牛MyD88 cDNA的克隆与原核表达

采用RT-PCR方法从水牛外周血白细胞总RNA中扩增出髓样分化因子88（mydoid differentiation factor88,MyD88）cDNA序列,PCR产物分离纯化后,与pMD20-T载体连接,重组质粒经PCR、酶切鉴定后测序,并进行生物信息学分析;构建pET28a-MyD88表达载体,并将其转化至E.coli BL21（DE3）,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、镍柱亲和层析纯化和Western blotting分析。结果显示,克隆到的水牛MyD88cDNA全长为1189bp,含有1个891bp的开放阅读框,编码296个氨基酸,理论等电点为5.65。经IPTG诱导表达后,得到一个带His·Tag的约39kD的重组融合蛋白。用抗His单克隆抗体进行Western blotting,得到1条约39kD特异性抗体结合带,表明水牛MyD88原核表达载体成功构建并表达。本研究为进一步开展水牛MyD88的结构功能分析奠定了基础。     

水牛α-干扰素基因的克隆与表达及其抗病毒活性

从福安和富钟水牛(water buffalo，WB)基因组中克隆了其α-干扰素基因Fa-WBIFN-α,和Fz—WBIFN-α,，并分别与pQE30表达载体连接、测序后用IPTG诱导表达。结果表明，水牛IFN—α基因全长498个核苷酸，编码166个氨基酸的成熟蛋白，与已报道的牛α-干扰素(BoIFN—α)8个亚型氨基酸序列同源性为91．6％～94．2％，均为BoIFN—α的新亚型。SDS-PAGE和Western blot分析表明，表达产物分子量约为20kD，表达量占菌体总蛋白的25％，表达产物以包涵体形式存在。经包涵体提取、尿素变性和复性后，重组水牛α-干扰素(rWBIFN—α)在CEF／VSV和MDBK／VSV细胞系上的活性分别为10^5U／mg和10^6U／mg。并且，rWBIFN-α对传染性牛鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus IBRV)感染有抑制作用。     

水牛γ-干扰素单克隆抗体的制备及其特性分析

将原核表达的重组水牛(Bubalus bubalis)γ-干扰素成熟蛋(rGST-WBIFN-γ)以100 μg/只剂量免疫8周龄Balb/c小鼠(Mus musculus),经5次免疫后,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,以rHIS-WB-IFN-γ和rGST-WBIFN-γ蛋白共同作为检测抗原进行间接ELISA检测,筛选并最终得到了2株能稳定分泌抗体的单细胞克隆株(分别命名为IE4和4A11),分泌抗体亚型均为IgG1型,轻链均为κ链.Western-blotting检测显示:2株单克隆抗体与原核表达的rWBIFN-γ蛋白均能特异性结合,具有良好的免疫反应原性.     

鸡γ-干扰素cDNA的克隆和在大肠杆菌中的温度诱导型表达

克隆了鸡(Gallus gallus)的γ-干扰素cDNA，并用大肠杆菌(Escherichia coli)进行了温度诱导型表达。用PCR方法扩增了鸡γ-干扰素基因组基因，将其克隆到载体pGEM-T上。对重组载体的插入片段进行酶切分析和部分序列测定：证明了基因的正确性；克隆的鸡γ-干扰素基因的编码序列中存在一个点突变(G→A)，这一突变导致一个三联体密码子GAA变为AAA，编码的氨基酸由谷氨酸(Glu)变为赖氨酸(Lys)。用鸡γ-干扰素基因组基因构建了真核表达载体pCI-ChIFN。将这一真核表达载体转染兔成纤维细胞的细胞系中进行表达实验：提取转染后细胞裂解物中的RNA，再以此为模板进行RT—PCR，获得了完整的鸡γ-干扰素cDNA基因，同时证明鸡γ-干扰素基因组基因能在兔成纤维细胞系中表达。用鸡γ-干扰素cDNA构建了温度诱导型原核表达载体pBVcDNA，并将其转导到大肠杆菌DH5α中，经细菌发酵和温度诱导，表达了一个18kD的特异蛋白，其表达量占细菌总蛋白的8．75％。     

摩杂一代水牛与广西沼泽型水牛垂体组织结构的比较研究

对广西摩杂一代水牛的脑垂体进行组织学研究,并和广西沼泽型水牛(Bubalus bubalis)的脑垂体进行比较。将两种水牛的脑垂体做成切片,采用HE染色并通过图像分析仪进行分析。结果显示摩杂一代水牛脑垂体呈长卵圆形,其神经部细胞大小和细胞密度和广西沼泽型水牛差异不显著,中间部的嫌色细胞较广西沼泽型水牛的多,而远侧部的各种细胞出现率表现出差异显著,其中嗜酸性细胞与广西沼泽型水牛差异极显著。这些结果为培育广西奶水牛提供形态学依据。     

小鼠干扰素应答基因(Ifrg15)的克隆、原核表达及其融合蛋白的亲和纯化

为研究一个可能的干扰素应答基因(interferon responsive gene 15,Ifrg15)所编码蛋白质的生物学功能,对昆明小鼠(Mus musculus)基因组DNA进行PCR扩增获得Ifrg15(393 bp),并将其克隆到pGEM-T载体,经测序鉴定后用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切下Ifrgl5基因片段并和双酶切后的表达载体pET-41(c)进行连接,然后转化入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞.对重组克隆用IPTG诱导融合蛋白的表达,并进行分离纯化.结果表明,本实验在E.coli BL21(DE3)菌株中成功地高效表达、并在变性亲和层析条件下成功纯化了GST&6xHis-Ifrg15融合蛋白.     

鸡γ-干扰素基因的瞬时表达及其抗病毒活性检测

采用PCR技术从质粒pET-ChIFN-γ中扩增得到IFN-γ基因,将其亚克隆到真核表达载体pCAGGS中。将鉴定正确的克隆命名为pCAGGS-ChIFN-γ,体外转染CEF细胞,24小时后经间接免疫荧光（IFA）和免疫印迹（Western-blot）检测,表达蛋白具有良好的免疫原性。然后利用表达绿色荧光蛋白（GFP）的重组水疱口炎病毒（VSV*GFP）在CEF细胞上检测表达的ChIFN-γ抗病毒活性（AVA）,经检测其抗病毒活性为2×103AU/mL,并且其活性可被抗鸡IFN-γ的多克隆抗体阻断。结果表明：ChIFN-γ在鸡胚成纤维(CEF)细胞中成功表达,并且表达的ChIFN-γ具有良好的抗病毒活性。     

茶树黄酮醇合成酶基因的克隆与原核表达

本研究采用EST测序技术和RT—PCR技术,获得了一个茶树茶多酚代谢中的重要基因——黄酮醇合成酶（FLS）基因,在GenBank登录（GenBank accession No．EF205150）,其序列全长1317bp,其中开放阅读框长996bp,编码331个氨基酸,3]端有一个明显的多聚腺苷酸加尾信号,推测的蛋白分子量约为37．5kD,理论等电点为5．80。序列分析表明它与葡萄FLS基因序列的亲缘关系比较近。将该基因重组到表达载体pET-32a（＋）中进行原核表达,经IPTG诱导、SDS-PAGE检测,结果表明茶树黄酮醇合成酶基因能在大肠杆菌BL21中表达,电泳检测到一条大约61kD的外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量相符。用Ni-NTA亲和层析柱对融合蛋白进行纯化,得到了纯度在90%以上的纯化蛋白,为进一步研究PET-FLS融合蛋白的活性及功能奠定了基础。     

高粱抗病基因SbSGT1的克隆及原核表达

为探究高粱抗病基因SbSGT1的功能,以高粱BTx623为材料,利用RNA反转录得cDNA,以cDNA为模板扩增出全长SbSGT1基因,并对其进行生物信息学分析。进一步构建pET-28a-SbSGT1重组质粒进行原核表达,并分别对表达菌株、诱导温度以及异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导浓度进行了优化。结果表明,SbSGT1全长1 095 bp,编码364个氨基酸,蛋白理论分子大小约为40.45 kDa,蛋白质等电点为5.0。进化树分析表明,SbSGT1与玉米和水稻的亲缘性较高;蛋白质序列分析表明,SbSGT1蛋白为亲水性蛋白,定位在细胞质中;二级结构预测发现其α螺旋和无规则卷曲占比最高,分别达到43.41%和45.88%。原核表达结果表明,SbSGT1最佳表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3),最佳诱导温度和IPTG浓度分别为25℃和0.8 mmol·L^-1。本研究为进一步探究SbSGT1基因在高粱抗病机理中所发挥的生物学功能奠定了基础。     

猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（pGM-CSF)基因的克隆与原核表达

通过RT-PCR方法,从经ConA刺激的猪外周血淋巴细胞中扩增出猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（pGM-CSF）编码区的cDNA并将其克隆至pMD-19T载体,序列测定表明pGM-CSF基因的长度为435 bp,编码144个氨基酸。通过PCR方法获得缺失其N端17个氨基酸残基信号肽序列的成熟pGM-CSF蛋白基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a（+）,构建重组表达质粒pET-GM并转入大肠杆菌(Escherichia coli )BL21（DE3）中进行诱导表达。经SDS-PAGE电泳和Western blot分析表明,表达的重组蛋白分子量约31 kD,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的30.4% 。采用Ni2+-NTA亲和层析柱对经稀释复性的重组蛋白进行纯化,并采用MTT法以TF-1细胞检测纯化产物的生物学活性。结果表明,重组蛋白可有效刺激TF-1细胞增殖,其活性达到3.43×105 IU/mg。     

棉花肉桂醇脱氢酶基因GhCAD3的克隆及原核表达

肉桂醇脱氢酶(CAD)是木质素生物合成过程中的一个关键酶类。本研究从棉花中克隆了一个CAD基因,命名为GhCAD3(GenBank登录号为FJ376601)。GhCAD3全长1573 bp,具有1个1080 bp的开放阅读框,5′非编码区为35 bp,3′非编码区为458 bp,编码359个氨基酸,预测分子量约为39.116kD,等电点为7.48。氨基酸同源性分析发现,GhCAD3与其他CAD一致性为64.13%。为了进一步研究GhCAD3基因的功能,构建了该基因的原核表达载体pET-28a-CAD3,经酶切鉴定后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。SDS-PAGE电泳分析表明,最佳诱导表达条件为0.5 mmol/L IPTG在37℃下诱导7 h。     

奶牛γ-干扰素基因的克隆及其在COS-1细胞中的表达

应用RT—PCR技术从经体外植物血凝素(PHA)刺激诱导的奶牛外周血淋巴细胞的总RNA中扩增出牛γ-干扰素(bovine interferon-γ,BovIFN-γ)基因。将扩增出的BovIFN-γ克隆到PMD18-T载体中,经过限制性酶切分析筛选正向插入的克隆。测序结果表明,所克隆到的基因编码区序列与已报道基因存在3个核苷酸的差异。将该基因片段从PMD18-T载体中用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切后克隆到真核表达载体pcDNA3．1／zeo ( )中,构建真核表达载体pcDNA—BovIFN-γ,通过脂质体转染COS-1细胞,用鼠抗BovIFN-γ高免血清和FITC标记的羊抗鼠IgG进行间接免疫荧光实验(IFA)检测,结果表明,在COS—1细胞的细胞膜和胞浆内均有rBovIFN-γ表达,细胞病变抑制实验证实,转染后细胞培养上清液具有一定的干扰素活性,转染后72h细胞培养上清液在MDBK细胞上抑制VSV病毒的效价可达到128IU／mL。研究结果为进一步筛选稳定表达BovIFN-γ基因细胞系、开发奶牛疾病预防控制的新产品以及开展奶牛疾病的基因治疗奠定了基础。     

鸡γ-干扰素基因(ChIFN-γ)的瞬时表达及其抗病毒活性检测

采用PCR技术从质粒pET-ChIFN-γ中扩增得到鸡(Gallus gallus)γ-干扰素(chicken interferon gamma,ChIFN-γ)基因,将其亚克隆到真核表达载体pCAGGS中.将鉴定正确的克隆命名为pCAGGS-ChIFN-γ,体外转染鸡胚成纤维(CEF)细胞,24 h后经间接免疫荧光(IFA)和免疫印迹(Western blot)检测,表达蛋白具有良好的免疫原性.然后利用表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组水疱口炎病毒(VSV*GFP)在CEF细胞上检测表达的ChIFN-γ抗病毒活性(AVA),经检测其抗病毒活性为2×10~3AU/mL,并且其活性可被抗鸡IFN-γ的多克隆抗体阻断.     

蓖麻延伸因子基因的克隆与表达分析

为探讨蓖麻延伸因子基因(RcEF-1α)作为参考基因进行相关研究的可行性,以蓖麻雌性花为试验材料,扩增RcEF-1α(GenBank登录号: XM_002518027.3)的编码序列(CDS),并将其亚克隆至原核表达载体pET32a(+)构建成重组载体pET32a(+)-RcEF-1α;将pET32a(+)-RcEF-1α转化至大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)中进行优化表达,表达蛋白经纯化后进行Western blot验证。结果表明,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)可诱导一个分子量约66 kD的特异蛋白;采用纯化的表达蛋白免疫新西兰白兔制备抗RcEF-1α的多克隆抗血清,用多克隆抗血清进行Western blot验证,发现多克隆抗血清具有针对RcEF-1α的特异性,经ELISA检测,其效价为1∶51 200;以抗血清为一抗,通过Western blot分析RcEF-1α在时空条件一致且正常生长的根、茎、叶、雌花、雄花和果实中的表达量,结果显示,蓖麻各组织中RcEF-1α蛋白质的含量存在显著差异,其中雌花和雄花中的含量显著高于其他组织。RT-qPCR分析结果表明,蓖麻各组织中RcEF-1α mRNA差异不显著。本研究结果为蓖麻功能基因表达分析参考基因的筛选提供了一定的理论依据。     

茶树CsSNAT基因的克隆与表达分析

为明确茶树SNAT基因的序列特征和表达特点,在茶树转录组测序的基础上以茶树(Camellia sinensis)品种舒茶早为试验材料,通过SMART^TM RACE技术克隆茶树褪黑素合成途径中关键限速酶5-羟色胺-N-乙酰转移酶CsSNAT基因的cDNA全长序列,并分析其基因结构和表达模式。结果表明,CsSNAT基因序列全长1 014 bp,其中包含742 bp的完整开放阅读框(ORF),编码247个氨基酸,预测等电点7.64,蛋白分子量27.36 kDa。氨基酸序列比对显示,CsSNAT蛋白与其他高等植物的SNAT蛋白具有较高同源性,与葡萄 VvSNAT(CBI31163)同源性最高,为66.19%。诱导蛋白最佳条件为温度28℃,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度0.5 mg·L^-1,诱导时间6 h,在上清液中可获得大量分子量为66 kDa的可溶性融合蛋白。实时定量 PCR 分析表明,CsSNAT在褪黑素处理6 h后表达量最高,为对照的3倍;茶尺蠖取食6 h后,CsSNAT表达显著上调。不同激素处理结果显示,CsSNAT受脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和水杨酸(SA)诱导表达。本研究结果为5-羟色胺-N-乙酰转移酶功能研究奠定了一定的基础。     

人Irisin基因的克隆、原核表达及重组蛋白的纯化

鸢尾素(Irisin)是新发现的一种肌肉因子,其前体是Ⅲ型纤连蛋白组件包含蛋白5(fibronectin typeⅢdomain-containing protein 5,FNDCS).为实现人(Homo sapiens) Irisin的原核表达,通过反转录PCR得到人肌肉组织总RNA的cDNA,并以特异性引物扩增得到人FNDC5基因的cDNA序列.以特异性引物扩增将人Irisin基因序列引入NdeⅠ和Xho Ⅰ酶切位点,经双酶切后插入原核表达载体pET-30a中,构建重组质粒并转化大肠杆菌(Escherichia coli) Rosetta (DE3) pLysS.通过异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl dulfate polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE)检测,用镍柱纯化目的蛋白,并用Western blot方法鉴定.DNA序列分析结果显示,克隆的人Irisin基因序列和NCBI公布的序列一致,并成功构建了pET-30a-Irisin重组表达载体;SDS-PAGE电泳检测和Western blot结果表明,表达蛋白分子量约为14kD,与预期大小一致;实现了人Irisin的可溶性表达,得到了较高纯度的目的蛋白,为进一步研究人Irisin蛋白的结构、功能及应用提供了理论依据.     

蜘蛛拖牵丝蛋白基因的克隆与表达

蜘蛛丝具有极高的强度和韧度,工业和医学应用价值很高,但由于蜘蛛的不可驯养性使其应用受到限制。因此,本文尝试利用基因工程的方法获得蛛丝蛋白的表达。我们利用巢式PCR技术从大腹圆蛛Araneus ventricosus基因组中克隆了长度为837bp的拖牵丝蛋白基因（ASP）,并分别将其构建至原核表达载体pGEX-6p-1和真核表达载体pGFP-N2上,分别命名为pASG和pASN。pASG在大肠杆菌中16℃下24h诱导表达后,经蛋白质印迹证明成功地表达了GST-ASP融合蛋白;pASN转染昆虫sf9细胞48h后观察到了绿色荧光蛋白GFP的表达,表明ASP基因在大肠杆菌和真核细胞中分别得到了正确表达。本研究为利用基因工程的方法开发蛛丝蛋白的生产途径提供了有益的尝试。     

烟夜蛾泛素延伸蛋白基因的克隆与表达

应用RT-PCR技术，从烟夜蛾(Helicoverpa assulta)幼虫脂肪体组织总RNA中反转录扩增泛素延伸蛋白基因的cDNA片段，扩增得到的片段全长390bp，编码一个长为129个氨基酸残基的蛋白质，预测分子量14.8kDa。同源性分析表明，此cDNA序列为ubiquitin-53aa extension protein(ubi-53，UBE)基因，在泛素蛋白后融合了一个核糖体L40蛋白(ribosomal L40 protein)。使用Clustal W软件，对cDNA编码的氨基酸序列进行了同源性分析，分析表明：烟夜蛾的泛素延伸蛋白氨基酸序列与其他真核生物泛素延伸蛋白氨基酸序列高度同源（90%－98%），与棉铃虫核多角体病毒(HaSNPV)泛素的同源性为69%。将烟夜蛾的UBE基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-2上，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG进行诱导表达，电泳检测到一条约40kDa大小的外源蛋白，用鼠抗GST抗体进行Western blot检测表明原核表达蛋白是目的蛋白。     

解淀粉芽孢杆菌YN-1抑菌蛋白TasA基因的克隆及原核表达

本文以解淀粉芽孢杆菌YN-1菌株为研究对象,利用PCR方法从基因组DNA中扩增出编码TasA抑菌基因的全长DNA,并构建pGEX-4T2/TasA原核表达载体,获得TasA-GST融合表达的抑菌蛋白。测序结果表明,解淀粉芽孢杆菌YN-1TasA基因核苷酸序列全长为786bp(GenBank登录号:EU131674),编码261个氨基酸残基;同源性分析表明,它与解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens FZB42(YP_001421886)序列的同源性最高,达98%,预测蛋白分子量为31kD。SDS-PAGE分析表明,TasA基因能在大肠杆菌BL21中表达,Western印迹分析pGEX-4T2/TasA原核表达载体,检测到约57kD的TasA-GST融合外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量大小相符。表达产物细胞裂解液上清经Ni柱层析,表明浓度为500mmol/L咪唑洗脱缓冲液时获得较高浓度和纯度的纯化蛋白。进一步抑菌活性分析表明表达产物对黄瓜灰霉病病原菌检测平板上显示出较好的抑菌活性。本研究结果将为今后深入研究TasA抑菌蛋白基因以及抗病转基因工程提供了参考。     

鸡γ-干扰素基因的克隆与鉴定

干扰素是动物机体内复杂的免疫网络中起调节作用的重要细胞因子之一.在体内广泛参与免疫调节及炎症反应等生物过程,具有十分重要的生理功能.目前已有一大批人和动物的干扰素基因被克隆.以重组干扰素作为免疫调节剂及基因治疗剂已显示出广泛的应用前景,成为重要的学科增长点之一.