适用于RAPD分析的蚕卵基因组DNA快速提取方法的探讨

目前所报道的家蚕基因组DNA的提取方法(Sharp et a1,1988;Yang et al,1993;夏庆友等,1996;王韵等,1997)基本上都是先应用离子型表面活性剂(SDS)及蛋白酶K去除结合在核酸上的蛋白质,然后用酚、氯仿变性除去蛋白,RNase去除RNA,最后乙醇沉淀DNA获得.这些方法操作过程繁复、耗时多,需用酚、氯仿等有毒试剂.本实验尝试进行改良,寻找适用于大量样品作RAPD分析并简单、快捷、低成本的蚕卵基因组DNA的提取方法.     

阿维菌素抗性小菜蛾的RAPD和SCAR标记

Black et al．（1992）利用RAPD（random amplified polymorphic DNA）技术对四种蚜虫进行了鉴别比较；Kambhampiti et al．（1992）将RAPD技术用于鉴定和区别蚊子的种和种群：Heckel et al．（1995）对小菜蛾抗Bt品系和敏感品系的基因组DNA进行了RAPD标记研究，获得了118条抗性品系特有的扩增带。目前有关应用RAPD对阿维菌素抗性小菜蛾进行标记研究未见文献报道。本研究拟采用RAPD技术寻找阿维菌素抗性小菜蛾特异性片段，并将其转化为更稳定的SCAR（Sequence-charactcrized amplified region）检测标记，旨在为建立实用的阿维菌素抗性小菜蛾分子检测技术提供基本资料。     

利用AFLP指纹技术鉴定桑树品种

传统的桑树品种鉴定是以形态学标记为依据，大多数性状易受环境条件的影响，而且，形态学性状常常局限于某一生命时期，给品种鉴定造成了一定的限制。AFLP分析的基本原理是选择性扩增基因组DNA酶切片段。由于不同基因组DNA的酶切位点存在差异，因而产生了扩增片段长度的多态性(Vos et al．，1995)。它既有RFLP的可靠性，又有RAPD的方便性，     

猪Ⅱ型圆环病毒ORF2基因在Hela细胞中的表达及表达蛋白的定位

猪圆环病毒（Porcine circovims，PCV）属于环状病毒属，该病毒无囊膜，基因组为单链环状DNA，大小约为1．7kb，编码2个主要的开放阅读框架：ORF1和ORF2，ORF2编码病毒的核衣壳蛋白（Nawagitgul et al，2000），可能在PCV2病毒致病方面具有重要的作用。PCV2可引起断奶仔猪多系统衰竭综合症（PMWS）．给养猪业带来了巨大的经济损失。分别用ORF2基因的亚单位疫苗免疫猪、核酸疫苗免疫小白鼠，均具有良好的效果（Blanchard et al，2003；Kamstrup et al，2004）。关于PCV2疫苗的研究在我国尚未处报道。本实验在异源启动子CMV下实现了ORF2在真核细胞中的表达。     

LiCl沉淀法提取富含荚膜的细菌基因组DNA

结合提取基因组DNA的CTAB法(hexadecyltrimethylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化铵)和用于提取海藻基因组DNA的LiCl法,设计了针对产生较多荚膜多糖细菌的DNA提取方法—LiCl沉淀法。通过电泳、分光光度计及16SrRNA基因扩增检测,证明LiCl沉淀法可以有效地提取产荚膜细菌基因组DNA,其片断大小约为23kb,不需进一步纯化即可用于后续分子生物学实验。     

黄瓜白粉菌基因组DNA 提取方法比较

以黄瓜白粉病菌为试验材料,比较分析了改良CTAB法、SDS法和真菌试剂盒法对黄瓜白粉病菌基因组DNA提取的效果。结果表明,CTAB法提取的黄瓜白粉菌基因组DNA在纯度(R=A260 nm /A 280 nm)和产量上均优于SDS法和真菌试剂盒法,且杂质少。CTAB法提取的黄瓜白粉菌基因组DNA产率为204.3 μg/g,而SDS法和真菌试剂盒法分别为147.7、117.7 μg/g,且方法产率之间差异极显著。采用CTAB法提取的DNA纯度较高,为1.969 6;SDS法和真菌试剂盒法提取的DND纯度较低,分别为1.832 2和1.507 9。     

杏花柱组织总RNA的提取方法

本课题组长期从事于自交亲和杏的育种工作，到2005年为止，已经选育出山农凯新l号等多个自交亲和杏品种（Chert et al．，2005），为了进一步研究杏自交不亲和性基因的表达特性，本实验参考多种方法（Koonjuleta1．，1999；Suzukieta1．，2001；Xu et a1．，2004；Zhang et a1．，2004），比较摸索了一条经济、便捷、产率高的提取杏花柱RNA的方法，并已成功的用于RT-PCR及相关基因的克隆和定量表达研究。     

克氏杆菌gldA基因亚克隆及其原核表达载体构建

甘油脱水酶(glycerol dehydratase EC 4．2．1．30)是控制甘油分解和产生1，3-丙二醇的关键性限速酶。甘油脱水酶是由α、β和γ3个亚基组成的复合物(α2β2γ2)，分别由gldA、gldB和gldC基因编码。研究(Frank et al.1998;Macis et al.,1998;Markus et al.,1996)认为甘油脱水酶α亚基无论在甘油脱水酶的结构上还是功能上都起到重要的作用。本研究克隆了克氏杆菌的甘油脱水酶α亚基基因(gldA)并构建了该基因的原核表达载体，为甘油脱水酶基因的进一步表达研究及探索其作用机制奠定了基础。     

大白菜低温诱导基因COR30的转录表达

低温诱导某些与失水相关的物质表达，保护大分子物质避免受到过度失水的伤害。在为数众多的低温相关蛋白中，胚胎发育后期富集蛋白（LEA）是一类提高细胞对脱水忍耐性的蛋白。Dure et al．（1989）根据LEA蛋白的结构将其分为3类：第1类是成熟蛋白（Em）；第2类是ABA应答蛋白（RAS）和脱水蛋白；其余为第3类。目前对脱水蛋白的研究较多（Borovskii et al．，2002，Lu et al．，2003）。     

棉花根际促生菌基因组DNA的提取及其鉴定

植物根际微生物基因组的提取往往因为细胞壁不能完全裂解以及内含物的成分和含量受到影响,获得完整的基因组DNA一直是土壤微生物分子生物学研究的关键。本文以新疆盐碱地棉花根际促生菌为材料,比较了SDS法、CTAB法以及高盐结合的CTAB法提取棉花根际促生菌基因组DNA的效率,结果显示,SDS法和CTAB法在细胞裂解后,由于过多的多糖类物质混于上清液中使其过于粘稠而无法分层,没能得到DNA样品。高盐结合的CTAB法则有效弥补了上述方法的不足,能够获得A260/A280为1.82、A260/A230为2.43的高质量基因组DNA。同时实验还以细菌16SrDNA为内标进行PCR扩增,结果证明所获得的棉花根际促生菌基因组DNA可直接用于PCR等分子生物学进一步研究。