γ-干扰素ELISA检测方法在广西牛结核病流行病学调查中的应用

【目的】摸清广西水牛及奶牛结核病的流行情况,为制定净化广西牛结核病防制策略提供参考。【方法】2008～2011年采用皮内变态反应和γ-干扰素ELISA检测方法联合对广西奶牛及水牛开展结核病流行病学调查,共检疫5478头奶牛和1580头奶水牛。【结果】2008～2011年从广西南宁、柳州、北海、钦州、桂林等市累积检测出皮内变态反应阳性奶牛63头、水牛17头,阳性检出率分别为1.15％和1.08％,总体上广西奶牛及水牛结核病阳性率呈现逐年降低的趋势。通过采用自制水γ－干扰素EusA检测试剂盒和Bovigam牛结核分枝杆菌γ-干扰素检测试剂盒对牛结核病进行检测,发现γ-干扰素ELISA检测的牛结核病阳性率低于皮内变态反应,且准确度高。【结论】对牛群进行结核病检测时,先以变态反应检疫牛群,再结合γ-干扰素ELISA检测进行综合判断,更有利于牛结核病的检测与净化。     

鸡γ-干扰素的克隆·表达和序列分析

[目的]为鸡γ-干扰素的进一步研究奠定基础。[方法]根据GenBank发表的鸡γ-干扰素核苷酸序列,设计1对特异性引物。利用RT-PCR技术从ConA诱导培养的鸡脾脏淋巴细胞中克隆鸡γ-干扰素基因,并在IPTG诱导下在大肠杆菌中表达重组菌。[结果]克隆的鸡γ-干扰素基因全长495bp,编码165个氨基酸,与国外克隆的鸡γ-干扰素基因序列的同源性为100%。鸡γ-干扰素蛋白含有12个α螺旋,3个β折叠,7个β转角。它具有强抗原性,而第16～23位氨基酸无抗原性。重组蛋白的分子量约18kD,其经IPTG诱导表达4h后,表达量最高,表达产率高达25%。[结论]鸡γ-干扰素具有一定的抗原性,预示其在免疫反应中起一定作用。     

鸡γ-干扰素的克隆·表达和序列分析

[目的]为鸡γ-干扰素的进一步研究奠定基础。[方法]根据GenBank发表的鸡γ-干扰素核苷酸序列,设计1对特异性引物。利用RT-PCR技术从ConA诱导培养的鸡脾脏淋巴细胞中克隆鸡γ-干扰素基因,并在IPTG诱导下在大肠杆菌中表达重组茵。[结果]克隆的鸡γ-干扰素基因全长495bp,编码165个氨基酸,与国外克隆的鸡γ-干扰素基因序列的同源性为100％。鸡γ-干扰素蛋白合有12个α螺旋,3个β折叠,7个β转角。它具有强抗原性,而第16～23位氨基酸无抗原性。重组蛋白的分子量约18kD,其经IPTG诱导表达4h后,表达量最高,表达产率高达25％。[结论]鸡γ-干扰素具有一定的抗原性,预示其在免疫反应中起一定作用。     

鸡γ-干扰素基因在大肠杆菌中的表达

构建鸡γ-干扰素基因(lFN-γ)的融合表达质粒,并在原核系统表达。根据GenBank发表的鸡γ-干扰素核苷酸序列,使用prim er5设计一对特异性引物,通过RT-PCR技术从ConA诱导培养的鸡脾脏淋巴细胞中克隆出鸡γ-干扰素基因并对其进行测序。测序结果表明,鸡γ-干扰素基因全长495bp,具有一个完整的开放阅读框,编码164个氨基酸,与国外发表的序列同源性为100%。将序列连接到原核表达载体pET28 a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳分析。结果表明鸡γ-干扰素表达蛋白大小为20.8KD,并以包涵体形式表达。为鸡γ-干扰素生物制剂或疫苗佐剂的开发奠定基础。     

畜禽干扰素-γ研究进展

干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)是一种具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能的细胞因子,主要由活化的T细胞和自然杀伤(Natural killer)细胞产生。干扰素因其重要的免疫调节功能而被广泛地应用于疾病的诊断及治疗过程。本研究主要对干扰素-γ诱生、作用机制、生物学活性、畜禽IFN-γ基因多态性与疾病的关系以及畜禽干扰素开发等的研究现状进行综述,以期为畜禽干扰素-γ的深入研究及其在畜禽生产中的应用奠定一定的理论基础。     

萧山鸡γ-干扰素(IFN-γ)成熟蛋白基因的克隆、原核表达及真核表达载体的构建

以有丝分裂原ConA诱导鸡脾脏淋巴细胞,用Trizol试剂提取细胞总RNA,利用RT-PCR技术获得了萧山鸡γ-干扰素成熟蛋白基因495 bp的序列,GenBank登录号为DQ470471。序列分析表明,与已经发表的鸡γ-干扰素成熟蛋白基因序列的核苷酸同源性为95%-99.9%。将该cDNA序列构建得到鸡γ-干扰素的原核表达载体pET30a-ChIFN-γ,成功在大肠杆菌中表达了分子量20.88 kD的目的蛋白,与预期分子量一致;并构建得到了鸡γ-干扰素的pCI真核表达载体（pCI-ChIFN-γ）。     

奶牛结核病皮内变态反应和γ-干扰素法检测对比实验

本研究用双变态反应和γ-干扰素体外释放实验对昆明市某奶牛合作社75头奶牛开展结核病检疫对比实验,单皮试反应(SCT)的检出率为19.0%、双皮试反应(CCT)的检出率13.3%、γ-干扰素实验法(IGRA)的检出率为25.3%。75头牛中SCT、IGRA共同阳性为7头,阳性符合率为36.8%(7/19),阴性符合率91.0%(51/56)。CCT、IGRA两种方法的符合率,75头牛中共同阳性为7头,阳性符合率为36.8%(7/19),阴性符合率94.6%(53/56)。鉴于单纯皮内变态反应诊断的局限性,应进行双侧变态反应,结合γ-干扰素实验法进行检疫。由于γ-干扰素实验法的价格贵,操作要求高,在操作中应严格按照操作要求进行,并进行重复检测。     

鸡γ-干扰素与新城疫病毒F蛋白抗原表位融合基因的构建与表达

[目的]研究鸡γ-干扰素（ChIFN-γ）的免疫佐剂功能,构建ChIFN-γ与新城疫F蛋白抗原表位（NDV F2-3）的融合基因,并进行原核表达。[方法]以头尾相连的方式构建鸡γ-干扰素基因与NDVF2-3的pET-32a重组质粒,经PCR扩增、双酶切和测序鉴定后,重组子在E.coliBL21细胞进行IPTG诱导融合蛋白表达,采用SDS-PAGE和Western blot方法分别检测表达的产物。[结果]获得了726 bpChIFN-γ与NDVF2-3融合基因,经原核表达,融合蛋白分子量约为35 000,能与相应的抗体结合。[结论]ChIFN-γ与NDVF2-3串联基因在原核细胞中能有效表达,且融合蛋白具有一定的免疫活性。     

延边黄牛γ-干扰素基因的克隆与序列分析

应用刀豆素蛋白(ConA)和植物分裂素(PHA)双重诱导培养延边黄牛脾淋巴细胞,提取脾淋巴细胞总RNA,RT-PCR扩增延边黄牛γ-干扰素基因,并将其克隆到pMD-18-T simple载体中,进行PCR鉴定和酶切鉴定及测序。结果表明:成功克隆了462bp大小的延边黄牛γ-干扰素基因片段;所克隆基因片段序列与欧洲牛、印度牛的亲缘关系最近,同源性分别为99.8%和99.6%,与欧洲牛的氨基酸同源性为100%。本试验为进一步研究延边黄牛γ-干扰素生物学作用奠定了基础。     

重组鸡γ-干扰素对H5亚型禽流感灭活苗的免疫增强作用

为研究重组鸡γ-干扰素(Chicken interferonγ,ChIFN-γ)对禽流感灭活疫苗的免疫增强效果,使用重组鸡γ-干扰素作为免疫佐剂,联合禽流感灭活疫苗采用胸部肌肉注射的方式免疫SPF雏鸡,免疫后每周测定血清抗体效价、免疫器官T、B淋巴细胞转化水平,攻毒后计算攻毒保护率。结果表明,鸡γ-干扰素提高了血清抗体水平,免疫器官T、B淋巴细胞转化水平和攻毒保护率,与疫苗组相比多数指标差异显著(P0.05)。鸡γ-干扰素对H5亚型禽流感灭活疫苗具有免疫增强作用。     

猪白细胞介素18的研究简介

主要介绍了猪IL-18的分子生物学结构和其生物学活性,IL-18与IL-1在结构方面有很多相似的地方,但其功能表现不同;猪IL-18是一种多效细胞因子,能够诱导NK细胞和T细胞增殖,促进其分泌干扰素γ(IFN-γ),并增强NK细胞的活性。     

离子交换层析复性重组人γ-干扰素折叠二聚体的形成

SP Sepharose Fast Flow离子交换层析柱作为蛋白质复性系统,采用尿素梯度法进行重组人γ-干扰素包涵体蛋白质的复性实验.结果表明,尿素梯度离子交换层析法能有效地复性重组人γ-干扰素包涵体,复性后的重组人γ-干扰素的纯度达95%,蛋白收率达54%,比活为7.5×105IU·mg-1.以Superdex 75凝胶作为体积排阻层析介质,对离子交换层析复性的样品进行分析,表明离子交换层析复性的样品中没有重组人γ-干扰素聚集体存在.荧光光谱分析表明重折叠的重组人γ-干扰素的构象接近于其天然二聚体构象.     

青鱼γ-干扰素基因的克隆与表达分析

【目的】开展青鱼γ-干扰素(IFN-γ)基因的克隆、结构特征与表达谱分析研究。【方法】采用cDNA末端快速扩增技术获得了青鱼(Mylopharyngodon piceus)IFN-γ基因cDNA的5′和3′末端序列,然后根据其末端序列设计特异性引物,扩增得到青鱼IFN-γ基因cDNA全长序列,对其序列和编码氨基酸序列进行生物信息学、同源性比较及系统进化树分析,同时对其在青鱼各组织中的表达进行分析。通过构建真核表达载体,将其转染青鱼鳍条组织细胞进行表达分析。【结果】青鱼IFN-γcDNA全长为895bp,其开放阅读框大小为549bp,编码182个氨基酸。氨基酸序列比对分析结果显示,青鱼IFN-γ与人、鸡、鼠IFN-γ的序列相似性仅为1.5%~7.7%,与其他鱼类IFN-γ序列相似性较高,为16.3%~92.9%。青鱼IFN-γ分子N末端包含1个信号肽序列、C末端有IFN-γ特征序列([I/V]-QX-[K/Q]-A-X2-E-[L/F]-X2-[I/V])以及核定位基序(RRRR)。青鱼IFN-γ蛋白二级结构与高等脊椎动物IFN-γ类似,包含7个α螺旋结构。经Poly I:C诱导后发现,IFN-γ在青鱼头肾、肾、脾、皮肤和鳃组织中表达显著上调,最高的为头肾,其次为脾、皮肤、鳃和肾,而在心脏和脑组织中无显著变化。青鱼γ-干扰素真核表达质粒在青鱼鳍条组织细胞中成功表达IFN-γ。【结论】成功克隆了青鱼IFN-γ基因cDNA,经Poly I:C诱导后,该基因在头肾中上调倍数最为显著,青鱼γ-干扰素在体外获得表达。     

重组猪γ—干扰素在毕赤酵母中的表达及其生物学活性研究

采用RT-PCR从猪外周血液淋巴细胞中克隆出猪γ-干扰素基因cDNA,构建了重组酵母表达载体(pPICZα-PoIFN-γ),并在巴斯德毕赤酵母X33株中实现了高效分泌表达,经SDS-PAGE和Western-lot证实猪γ-干扰素分子量为18 kD,细胞培养试验结果表明,莺组猪γ-干扰素能抑制水泡性口炎病毒(VSV)对猪肾传代细胞(PK-15)的攻击;而在动物试验中,重组猪γ-干扰素可明显提高猪伪狂犬疫苗的免疫效果.     

石歧杂鸡γ-干扰素基因的克隆与序列分析

根据现有鸡γ－干扰素基因序列设计引物，应用反转录－聚合酶链反应（RT－PCR）技术，从Con A诱导培养的鸡脾淋巴细胞中扩增得到石岐杂鸡γ－干扰素（spzChIFN-γ)基因，将克隆到pGEM-T载体中，进行序列测定，结果表明，克隆得到的ChIFN-γ基因的开放阅读框架由492个核苷酸组成，和其他ChIFN-γ基因的同源性达99％，与火鸡γ－干扰素基因的同源性性为96％，与鸭γ－干扰素基因的同源性为81％，推导的石岐杂鸡IFN-γ氨基酸序列与其他已发表的ChIFN-γ氨基酸序列完全一致，与火鸡和鸭IFN－γ氨基酸同源性分别为97％和67％。     

IFN-γ对奶牛乳腺上皮细胞转分化的影响

[目的]用转化生长因子-β_1(TGF-β_1)诱导奶牛乳腺上皮细胞-肌纤维母细胞转分化(EMT),以不同浓度的IFN-γ为阻断剂,探讨干扰素-γ(IFN-γ)对奶牛乳腺上皮细胞(BMEC)表型重塑的作用。[方法]将原代培养的BMEC分为对照组、诱导组(TGF-β_110ng/m L)、药物组(IFN-γ20 ng/m L)及阻断组(TGF-β_110 ng/m L+IFN-γ10、20、50、100 ng/m L)。培养72 h后,观察α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、结缔组织生长因子(CTGF)和胶原Ⅰ(COLⅠα1)的mRNA相对表达量。[结果]诱导组α-SMA、CTGF和胶原Ⅰ mRNA相对表达量显著增加(P0.05);药物组CTGF的mRNA相对表达量与对照组相比无显著差异(P0.05),α-SMA和COLⅠα1mRNA相对表达量显著下降(P0.05);阻断组IFN-γ明显抑制了TGF-βl诱导的转分化。[结论]IFN-γ能够负性调控TGF-β_1诱导的奶牛乳腺上皮细胞-肌纤维母细胞转分化(EMT),减少COLⅠα1分泌。     

鸡γ干扰素基因的分子克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据GenBank已发表的鸡γ干扰素cDNA基因序列设计一对引物,以血淋巴细胞提取的总RNA为模板,通过RT-PCR的方法克隆出鸡γ干扰素基因,把它与融合表达载体pET32a相重组。通过对阳性宿主菌的不同时间的诱导摸索出最佳表达时间。     

5种细菌鞭毛素蛋白诱导细胞因子IL-4、IFN-γ mRNA的表达水平

选择5种不同细菌来源的鞭毛素蛋白刺激猪外周血淋巴细胞,利用荧光定量PCR检测相关细胞因子白介素4(IL-4)和γ-干扰素(IFN-γ)mRNA的表达水平,进一步选择4个含量(0.1、1.0、5.0、10.0μg·m L~(-1))的创伤弧菌鞭毛素蛋白,探讨其诱导IFN-γ的表达效果.结果表明,鞭毛素蛋白可以显著提高IFN-γmRNA的表达水平(P0.05),以创伤弧菌(Vibrio vulnificus MO6-24/O)的效果最佳.4个含量的创伤弧菌鞭毛素蛋白均能显著提高猪外周血淋巴细胞IFN-γmRNA的表达量(P0.05),其中以5.0μg·m L~(-1)为创伤弧菌鞭毛素蛋白的最适含量.本试验主要目的是筛选一种能够有效提高猪免疫功能的细菌鞭毛素蛋白,为挖掘新型疫苗佐剂提供基础.     

油菜偏嗜性ChIFN-γ基因合成及原核表达

依据鸡γ-干扰素基因(ChIFN-γ)的氨基酸序列,采用油菜偏嗜性的密码子,人工合成ChIFN-γ,构建原核表达载体pET32a-ChIFN-γ,并转化到E. coli BL21中.1 mmol·L-1 IPTG 37℃诱导表达12h ChIFN-γ表达量达到菌体总蛋白的37%.SDS-PAGE电泳检测表明,ChIFN-γ重组蛋白分子量约为33kDa.研究为下一步制备ChIFN-γ抗体进行真核表达研究奠定了基础.     

重组γ干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达

重组质粒pCG25(IFN-γ)转化大肠杆菌DH5 α,接种LB培养基,在32℃培养,42℃诱导后经SDS-PAGE凝胶电泳分析,γ-干扰素基因在大肠杆菌细胞中表达的蛋白质为18 Kd,诱导6 h达到最高峰,表达活性为1.2×108IU/L菌液,对酸(pH2)和热(60℃)不稳定.