云南元阳梯田红米水稻种子健康状况初探

使用洗涤法、PDA平板法、滤纸保湿法、扫描电镜检测等方法,分析了元阳哈尼梯田水稻生产中使用的3个红米品种种子的健康状况。结果显示,洗涤法检测红米种子表面携带的优势菌群为Aspergillus及Fusarium,出现频率为83%及5%。PDA平板法检测出的主要菌群为Aspergillus、Fusarium、Verticillium,种子携带3个属真菌的分离比率为28%、39%及10%。滤纸保湿法检测出的优势菌群与PDA平板法一致,均为上述3个属的真菌,其检出频率分别为17.6%、41%及12%。红米水稻品种种子表面携带的真菌类型丰富,数量较多。     

水稻种子寄藏真菌的3种检测方法对比研究

通过研究3种水稻种子寄藏真菌检测方法的异同和适应性,为提高水稻种子健康检测的针对性提供科学依据。以云南省具有代表性的3个主栽水稻品种楚粳26、滇优35和宜香9的种子为材料,采用洗涤法、PDA平板法进行种子寄藏真菌检测;同时采用滤纸保湿法对此3个品种以及富优80等产地海拔高度不同的共计20个水稻品种的种子进行检测。结果显示,洗涤法适用于种子外部带菌检测,洗涤时间为20min,洗涤液稀释10倍涂平板可以观测记录带菌的数量,供试水稻种子外部主要携带Aspergillus、Fusarium、Penicillium、Alternaria,它们出现的比例分别为21.4%、17.9%、16.7%和8.3%;PDA平板法可以满足整粒种子以及解剖后种子不同部位的寄藏真菌检测,结果与洗涤法基本一致,种子携带4个属真菌的分离比率分别为42.7%、25.6%、1.2%和4.9%;滤纸保湿法可较好地检测20个水稻品种整粒种子的带菌情况,共检测到24个属的真菌,主要优势菌为Aspergillus、Fusarium和Penicillium,它们分别在14、19和18个供试品种中广泛分布,出现频率最大,而在版纳10号等少数地方种水稻种子中,上述3个属的真菌未检出或者检出频率明显降低。研究分析了种子类型、来源、产地海拔高度与种子寄藏真菌种类的关系,提出了对3种检测方法中获得的未知真菌分类地位进行进一步鉴定的建议。     

一种简易真菌分离技术

植物病原真菌通常采用组织分离、稀释分离、单孢子分离等技术，这里介绍一种我们在研究工作中摸索出来的方法——组织捣碎法，即将寄主植物上形成子囊果、分生孢子器、分生孢子盘或分生孢子角的组织块捣碎，加适量灭菌水，配成菌体悬浮液，再涂抹于培养基平板上生长，最后纯化的方法。     

菜地和稻田土壤真菌的分离方法比较

比较了虎红琼脂培养基、酸性PDA培养基、PDA培养基和植物组织诱集法对菜地和稻田土壤真菌的分离效果.结果表明,虎红琼脂培养基和酸性PDA培养基对土壤真菌的分离效果显著优于PDA培养基（α=0.05）.分离时土壤悬浮液以10^-1和10^-2稀释度最佳.采用植物组织诱集法可分离到土壤中的腐霉菌.     

用SSR标记和巢式PCR快速检测大豆疫霉菌

 【目的】建立快速、准确的大豆疫霉菌检测和病害早期诊断分子技术。【方法】基于大豆疫霉菌SSR标记Psc239设计两对引物Psc239EF/Psc239ER和Psc239F/Psc239R,建立特异性检测大豆疫霉菌的巢式PCR方法。【结果】用36个大豆疫霉菌分离物和25个其他卵菌和真菌分离物基因组DNA评价引物及巢式PCR的专化性,引物对Psc239EF/Psc239ER、Psc239F/Psc239R和巢式PCR反应只在大豆疫霉菌中分别扩增出519、242和242 bp的特异片段,在其它卵菌和病原真菌中不扩增片段;用两对引物进行常规PCR扩增,检测大豆疫霉菌DNA的灵敏度均为50 pg?μl-1,而巢式PCR的灵敏度为50 fg?μl-1;巢式PCR检测土壤中卵孢子的灵敏度为每克土壤0.4个卵孢子;巢式PCR能够特异地从大豆病株和土壤中检测到大豆疫霉菌。【结论】基于SSR标记建立的巢式PCR方法能够用于大豆疫霉菌的快速检测和病害诊断。     

禾本科植物内生真菌研究14:Neotyphodium sinofestucae在小颖羊茅体内的分布及其种传特性

2010年在南京紫金山地区采集小颖羊茅(Festuca parvigluma Steud.)的完整植株和成熟种子,通过染色、分离、特异性基因片段检测等方法探究内生真菌Neotyphodium sinofestucae Chen,Ji et Wang在其体内的分布和种传特性。从植株茎秆、叶鞘、叶片和种子稃片及颖果等部位分别检测和分离到具有禾本科植物内生真菌特征的真菌。同时,从含有内生真菌的种子培育实生苗,并从实生苗中检测和分离到类似的内生真菌。通过对tubB基因片段的PCR扩增和检测,证明分离自小颖羊茅的样品与其实生苗的分离菌株是相同的N.sinofestucae。上述结果表明:N.sinofestucae遍布小颖羊茅植株地上部分,却不进入根部;内生真菌N.sinofestucae能进入种子,通过种子进行垂直传播,与宿主植物长期互利共生。     

基于不同病原真菌单孢分离方法研究

在植物病理学研究中,通常需要分离和纯化病原真菌,掌握一套简捷又高效的单孢分离技术,有助于研究工作的顺利开展。以葡萄灰霉病菌为试验材料,比较稀释纯化法、挑针转移法、平板稀释画线法和实体镜下转移法4种单孢分离方法。试验发现,实体镜下转移法分离成功率最高,高达93.62%。但各方法各有其优缺点,需结合自身优势和实验条件,总结出一套适宜的、简便可靠的单孢分离方法。     

贺州荸荠秆枯病病原鉴定及其侵染过程

[目的]对广西贺州市荸荠种植区感染秆枯病的荸荠样本进行病原分离鉴定及分析病原菌的侵染过程,为荸荠秆枯病的有效防治提供参考。[方法]以常规组织分离法对发病明显的荸荠茎秆组织进行分离,采用传统的形态学对病原菌进行鉴定。通过制备分生孢子悬浮液接种于载玻片上培养,测定分生孢子萌发情况。利用病菌孢子悬浮液对荸荠茎秆进行离体接种,检测病菌的侵染过程。[结果]分离获得1株病原分离物(Ceh),经形态学鉴定该病原为荸荠柱盘孢菌(Cylindrosporium eleocharidis Lentz)。病菌分生孢子接种于载玻片后4 h开始萌发,8 h后大量萌发,12 h后形成大量附着孢,菌丝24 h后形成。病菌接种荸荠茎秆4 h后,分生孢子开始萌发并产生芽管;8～12 h芽管伸长,形成附着孢侵入荸荠茎秆表皮组织;24 h至7 d菌丝形成;接种8 d后,病菌在茎秆表面形成分生孢子盘。[结论]引起广西贺州市荸荠种植区荸荠秆枯病病原为荸荠柱盘孢菌(Cylindrosporium eleocharidis Lentz)。荸荠秆枯病菌分生孢子萌发和侵染过程可用于病原菌和寄主互作机理研究。     

短密木霉、咪唑乙烟酸和种植大豆对土壤真菌多样性及农药残留的影响

采用平板稀释法分离试验土壤真菌,对土壤真菌数量、种类进行分析,采用高效液相色谱法检测土壤农药含量,对土壤中的农药残留进行分析。结果表明:加入短密木霉(Trichoderma brevicompactum)后,短密木霉对其他真菌具有抑制作用,与对照组相比,土壤真菌数量、种类差异显著。单独种植大豆(Glycine max)后,土壤真菌的数量、种类变化不明显。咪唑乙烟酸质量分数对土壤真菌数量、种类有显著的影响。短密木霉、大豆、咪唑乙烟酸三者互作试验组与对照组差异显著。土壤中的咪唑乙烟酸质量分数随着处理时间的增加都逐渐的减少,10~20d降解效率最高。短密木霉、大豆和咪唑乙烟酸都会影响咪唑乙烟酸的降解。     

银杏内生真菌的分离鉴定及抑菌试验

利用PDA培养基进行银杏内生真菌的分离、尖端菌丝挑取法对分离得到的内生真菌进行纯化,然后从形态学上对分离得到的内生真菌进行初步鉴定,最后采用杯碟法对所分离到的部分菌株进行抗病原性细菌试验。从银杏中分离到的内生真菌,经初步鉴定结果表明,从银杏分离得到的内生真菌属于11个属。部分内生真菌菌株对病原性细菌有不同程度的抑制作用,其中对革兰氏阳性菌,金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑制作用明显。     

木霉菌T38D对大豆根腐病菌的拮抗机制

利用从土壤中分离出的木霉(Trichoderma spp.)菌株T38D,通过对峙法、对扣培养和圆盘滤膜法对引起大豆根腐病的病菌进行了拮抗作用研究,结果表明:木霉菌T38D对根腐病菌有明显的空间竞争能力,对立枯丝核菌和终极腐霉菌的拮抗系数达到Ⅰ级,对4种镰孢菌的拮抗系数均达到Ⅱ级;木霉菌T38D可以寄生于4种根腐病菌菌丝上,最终导致病原菌解体死亡;T38D的难挥发性代谢产物对立枯丝核菌的抑制率可达100%,对终极腐霉菌的抑制率为87.6%,对燕麦镰孢菌的抑制率为75.2%,对其余3种镰孢菌的抑制率都在40%～50%;T38D的易挥发性代谢产物对立枯丝核菌和终极腐霉菌有一定的抑制效果,对镰孢菌的抑制效果不明显。     

A LAMP-assay-based specific microbiota analysis reveals community dynamics and potential interactions of 13 major soybean root pathogens

Soybean root diseases are associated with numerous fungal and oomycete pathogens; however, the community dynamics and interactions of these pathogens are largely unknown. We performed 13 loop-mediated isothermal amplification(LAMP) assays that targeted specific soybean root pathogens, and traditional isolation assays. A total of 159 samples were collected from three locations in the Huang-Huai-Hai region of China at three soybean growth stages(30, 60, and 90 days after planting) in 2016. In LAMP results, we found that pathogen communities differed slightly among locations, but changed dramatically between soybean growth stages. Phytophthora sojae, Rhizoctonia solani, and Fusarium oxysporum were most frequently detected at the early stage, whereas Phomopsis longicolla, Fusarium equiseti, and Fusarium virguliforme were most common in the later stages. Most samples(86%) contained two to six pathogen species. Interestingly, the less detectable species tended to exist in the samples containing more detected species, and some pathogens preferentially co-occurred in diseased tissue, including P. sojae–R. solani–F. oxysporum and F. virguliforme–Calonectria ilicicola, implying potential interactions during infection. The LAMP detection results were confirmed by traditional isolation methods. The isolated strains exhibited different virulence to soybean, further implying a beneficial interaction among some pathogens.     

大豆霜霉病发生规律的研究

通过大豆霜霉病病粒接种、孢子囊人工接种胚轴试验以及病苗徒手切片观察，揭示出大豆霜霉病为系统侵染病害。种子表皮下的卵孢子越冬后，萌发侵染胚轴，形成系统侵染。带病种子是翌年的主要初侵染源。通过不同温度下贮藏的种子，不同时期播种，发现温度对卵孢子的萌发和侵染影响很大，在室温下贮藏豆种以及适时播种可减少病害的发生与流行。不同品种的抗性试验表明，大豆品种间的抗病性差异显著，采用抗病品种是最有效的防治措施。通过对１９８３～１９８７年的病害调查，发现降雨造成的高湿度对病害影响很大，尤其是７月份的降雨量，是大豆霜霉病流行的关键因素。     

大豆根腐病病原菌种类鉴定及其生物学研究

本研究的目的是进一步明确大豆根腐病的病原菌种类及其生物学特性。通过对病原菌的分离、培养、接种等系列试验和大量的田间试验,得出大豆根腐病是由尖孢镰刀菌芬芳变种等多种病原菌侵染所致,各种病原菌在生物学特性上略有差异。致病力以立枯丝核菌略强,田间症状特征主要由不同病原菌侵染决定。     

河北省大豆主要病原真菌鉴定及防治药剂筛选

【目的】明确引起河北省大豆植株主要病害的病原真菌种类,筛选能有效抑制所鉴定病原菌的杀菌剂,为河北省大豆病害化学防治提供依据。【方法】对采自河北省的大豆主要病原真菌根据病症采用组织分离法纯化培养,初步利用超景深和正置光学显微镜分别进行菌落、菌丝和孢子形态学的观察鉴定,然后利用通用引物ITS1-ITS4对5种不同病症的致病菌株rDNA-ITS区进行PCR扩增、测序分析,采用MEGA 7.0中邻接法（neighbor-joining,NJ）构建系统发育树,分析病原菌种之间的亲缘关系,对具有特异性引物序列的病原菌进行分子鉴定,通过病害和病原菌宏观形态、显微特征与分子生物学技术相结合从而明确引起河北省大豆植株主要真菌病害的病原菌种类;采用菌丝生长速率法和不同种类杀菌剂在离体叶片或幼茎上对大豆主要病害的防治效果筛选防治药剂。【结果】通过病原菌的宏观形态、显微结构和分子序列综合分析,确定分离自河北省大豆主产区的病原菌分别为木贼镰孢(Fusarium equiseti）、大豆炭疽菌(Colletotrichum chlorophyti）、茎点霉菌（Phoma herbarum）、链格孢(Alternaria alternata）、嘴突凸脐蠕孢(Exserohilum rostratum）,对应病害分别为大豆根腐病、炭疽病、茎点霉叶斑病、大豆黑斑病、凸脐蠕孢叶斑病。毒力测定结果显示,5种病原菌对三唑类杀菌剂苯醚甲环唑、氟菌唑、叶菌唑和甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂吡唑醚菌酯均敏感,木贼镰孢对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂肟菌酯敏感,除木贼镰孢外的病原菌对酰胺类杀菌剂氟吡菌酰胺敏感,大豆炭疽菌和嘴突凸脐蠕孢对烷基多胺类杀菌剂辛菌胺敏感,大豆炭疽菌对有机硫类仿生杀菌剂乙蒜素敏感,EC₅₀值均低于10 μg·mL^-1;杀菌剂对大豆主要病害的防治效果结果显示,苯醚甲环唑、氟菌唑、叶菌唑、吡唑醚菌酯和肟菌酯对上述大豆主要病害防治效果均显著,氟吡菌酰胺对除大豆根腐病外的病害防治效果显著,辛菌胺、乙蒜素对大豆炭疽病和凸脐蠕孢叶斑病防治效果显著,防治效果分别达到90%以上。【结论】共鉴定出河北省大豆病原真菌及其对应病症病害5种;推荐三唑类甾醇抑制剂苯醚甲环唑、氟菌唑、叶菌唑和甲氧基丙烯酸酯类呼吸抑制剂吡唑醚菌酯作为河北省大豆主要真菌病害的优选兼治药剂。     

芽孢杆菌的筛选及其在豆粕发酵中的应用

筛选出耐酸耐胆盐且产蛋白酶、淀粉酶性能较好的优势芽孢杆菌菌株,以期制备高效复合益生素或应用于豆粕发酵。首先,对分离并镜检出的17株菌株进行耐酸耐胆盐特性初筛,而后对筛出的3株菌株进行耐酸耐胆盐梯度复筛,随后检测其发酵豆粕的蛋白酶和淀粉酶活性以及对抗原蛋白的降解能力。最后通过16SrRNA扩增比对鉴定筛选的菌种,进而通过MEGA4.0构建系统进化树进行分析。成功筛选出1株耐酸耐胆盐、产蛋白酶和淀粉酶,且能高效降解豆粕抗原蛋白的解淀粉芽孢杆菌B9。     

植物生长调节剂对大豆茎叶柄显微结构及光合特性的影响

以垦农4号为试验材料,在大田条件下,试验于始花期叶面喷施SODM、CC和DTA-6,研究植物生长调节剂对大豆茎叶柄显微结构及光合特性的影响,结果表明:三种植物生长调节剂改善了大豆叶片的光合特性,DTA-6效果最佳;均明显增加了大豆叶片厚度、栅栏组织厚度、栅栏组织细胞密度和栅栏组织与海绵组织厚度比值(P/S),增加大豆叶片主脉的导管数目、输水横截面积和韧皮部横截面积;增加大豆叶柄维管束横截面积和叶柄导管数目;对茎部表皮厚度的促进作用不显著,但均增加了初生韧皮部、次生韧皮部、次生木质部和初生木质部的厚度,且SODM主要促进了次生木质部厚度的增加,CC主要促进初生木质部和次生木质部厚度的增加,DTA-6主要促进了初生韧皮部、次生韧皮部和次生木质部厚度的增加.     

基于特异性引物分子标记技术的大豆根腐病主要病原菌分子判别体系研究

[目的]探索大豆根腐病主要病原菌分子检测方法,为复合侵染病害的进一步深入研究及大豆根腐病的科学防治奠定基础.[方法]采用病原菌rDNA-ITS区段序列分析对各病原菌种进行分子验证,采用病原菌特异性引物对大豆根腐病各病原菌种进行分子标记,以特异性引物分子标记技术建立多病原的分子判别体系.[结果]通过序列比对使收集到的7种大豆根腐病致病菌(立枯丝核菌、瓜果腐霉菌、尖孢镰孢霉、禾谷镰孢霉、茄腐镰孢霉和茄腐镰孢霉蓝色变种、燕麦镰孢霉)的鉴定结果得到分子验证;采用6种针对各病原菌种的引物(茄腐镰孢霉和茄腐镰孢霉蓝色变种为同一引物)进行的扩增实验均有特异性条带;经扩增条件优化和灵敏度检测初步建立针对大豆根腐病多种病原菌的分子判别体系.[结论]采用特异性引物分子标记技术基础上的病原菌分子判别体系可用于多病原复合侵染大豆根腐病的病原菌种类的分子判别,并为该病分子检测技术的建立奠定基础.     

菜用大豆炭疽病病原菌的分离鉴定与防治

炭疽病是菜用大豆生产上发生的常见真菌性病害,破坏力强,发病时在豆荚表面形成黑色斑点,严重影响鲜荚外观商品性和品质,已成为我国菜用大豆生产上面临的主要问题之一。为明确浙江省菜用大豆炭疽病病原菌的种类,本文对采集的菜用大豆炭疽病样本进行分离纯化培养,基于柯赫氏法则分离到引起菜用大豆炭疽病的病原菌,并通过病原菌的菌落形态特征结合其rDNA-ITS区域的序列分析对病原菌进行种类鉴定。结果表明,造成浙江省菜用大豆炭疽病的主要病原菌为平头炭疽菌(Colletotrichum truncatum)和胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)。为筛选可以用于防控菜用大豆炭疽病的杀菌剂,测定了分离得到的病原菌平头炭疽菌Cts18和胶孢炭疽菌Cts22对生产中常用杀菌剂多菌灵和戊唑醇的敏感性,发现多菌灵对Cts18、Cts22的抑制中浓度(EC₅₀)分别为2.13μg·mL^-1和96.12μg·mL^-1,戊唑醇对Cts18、Cts22的EC₅₀分别为0.27μg·mL^-1     

大豆叶片及种子内大豆花叶病毒(SMV)的生物与免疫测定方法的比較

用生物测定(局部枯斑反应)、免疫吸附电镜(ISEM)、酶联免疫吸附试验(ELISA)三种方法对大豆叶片及种子内的SMV进行了定性定量测定。结果表明,三种方法均可用来检测叶片及种胚和子叶内的SMV,并可对其定量,结果高度吻合,相关系数达0.97以上。ELISA能测出稀释2430—7290倍病叶中的SMV,测提纯病毒的下限为70ng—20ng/ml,生物测定可测出稀释640—1280倍病叶中的SMV。种皮内含有非侵染性SMV,不能用生物方法测出,而需用免疫方法检测。