里氏木霉DWC—5纤维素酶液体发酵条件的研究

采用里氏木霉ＤＷＣ－５和５０℃,转速１１０ｒ．ｍｉｎ＾－１的摇瓶中发酵７ｄ。在装液量４０ｍｌ、初始ＰＨ６．５,接种量０．５％－１．５％,菌龄２ｄ,培养时间７－９ｄ、温度４５－５０℃,ＣＭＣ酶活、ＦＰ酶活都达到较高水平。     

培养条件对里氏木霉产纤维素酶的影响

通过对里氏木霉分别采用固体和液体进行静置或振荡(翻拌)培养,选择产纤维素酶活性最高的液体振荡培养的方式。以此为基础,在原有的培养液中分别添加葡萄糖、尿素、吐温80,测定其纤维素酶活、生物量以及pH值,得出在添加1.5g/L葡萄糖、1.0g/L尿素、0.5g/L吐温80的条件下,生物量增幅达到了48.67%;纤维素酶活可达到291.2×103U/L,提高了29.21%;pH值较为稳定,在5.0左右。     

里氏木霉利用杂细胞产纤维素酶条件的研究

以里氏木霉 (Trichodermareesei)为产酶菌株 ,杂细胞为产酶诱导物 ,通过固态发酵生产纤维素酶。研究结果表明 :杂细胞、稻草粉、麸皮三者之比为 2∶4∶4,氮源为硫酸铵 (总氮量为 0 4% ) ,料水比为 1∶2 ,2 8～ 30℃恒温培养5d ,为最佳产酶条件 ,CMC酶活达 5 16 6 4IU/g干曲。在培养基中添加 0 1%的表面活性剂Tween 80对产酶无显著影响。纤维素酶作用的最适 pH4 85、温度 5 0℃。     

里氏木霉产纤维素酶条件的优化

研究采用里氏木霉菌株30911、40358和40359,设计了9个影响里氏木霉产纤维素酶活性因素,对里氏木霉的纤维素酶活性进行了液体摇瓶发酵试验。结果表明,培养基中微晶纤维素和小麦麸皮的最适添加量分别为:微晶纤维素20 g·L-1,小麦麸皮80 g.L-1,微晶纤维素与小麦麸皮最适配比为1:4;接种孢子悬液浓度1×107个·mL-1,培养温度28～30℃,pH 5.5,培养时间72 h,摇瓶转速180 r·min-1,250 mL三角瓶中装液量为50～75 mL。     

里氏木霉产纤维素酶系各组分分泌特性

在液体发酵条件下,以纤维素粉或麦麸为不同碳源及添加碳酸钙和酵母膏对里氏木霉产纤维素酶系不同组分的最高酶活、比酶活及其形成时间、分泌规律等进行了探讨。结果表明:以纤维素粉或麦麸为不同碳源时,各组分的最高酶活、酶活比及其形成时间均有较大差异,并以混合碳源(1 0%纤维素粉+2 0%麦麸)时为最佳,内切型β 1,4 葡聚糖酶(C1)外节型β 1,4 葡聚糖酶(Cx)和β 葡萄糖苷酶(BG)的最高酶活分别达到76 18×10-5,313 25×10-5和135 59×10-5mol·s-1,比酶活分别为72 18×10-5,331 57×10-5和124 29×10-5mol·s-1,最高酶活形成时间为9～10d。添加碳酸钙可明显提高C1和Cx的最高酶活及提高C1的比酶活,降低BG的最高酶活及比酶活和缩短C1和Cx的最高酶活形成时间;添加酵母膏能明显提高BG最高酶活但降低其酶活比;而C1和Cx的比酶活和最高酶活则随其浓度变化而增减不一。3种组分酶的分泌规律和酶系的均衡性极不相同,其中对BG的影响较为滞后。图3表3参12     

里氏木霉纤维素酶水解稻草的研究

[目的]探讨碳氮源对里氏木霉发酵产纤维素酶的影响,以及纤维素酶水解稻草的条件。[方法]通过添加不同的碳源和不同浓度的酵母粉,探讨里氏木霉合适的发酵条件;使用不同添加量的纤维素酶对稻草进行酶解;分别利用纤维素酶、纤维素酶和木聚糖酶混合酶对稻草进行酶解反应。[结果]利用乳糖和稻草的复合碳源和12 g/L的酵母粉进行水解时,纤维素酶活性较高。酶解适宜的酶用量为每克稻草底物200 U的滤纸酶。用纤维素酶及木聚糖酶混合酶酶解稻草96 h的酶解得率为65.4%。[结论]该研究可为里氏木霉纤维素酶生产和酶解稻草的应用提供一定的依据。     

里氏木霉纤维素酶生产工艺的优化

提高纤维素酶生产效率,降低纤维素酶生产成本是纤维素乙醇生产技术的关键之一。而碳源、氮源和无机盐等产酶培养基成分以及接种时间、产酶温度、培养初始pH等产酶条件是纤维素酶生产过程中的关键因素。为充分利用里氏木霉生产纤维素酶,研究了纤维素酶高产菌株里氏木酶FST-1产酶培养基和产酶条件对纤维素酶产酶的影响。结果表明:麸皮、蛋白胨和磷酸二氢钾的含量对于纤维素酶的生产影响较大,并且确定了最优产酶培养基为4号培养基。通过对不同产酶条件的研究,确定最佳接种时间为24h、最佳产酶温度为32℃、最佳初始pH为5.5,优化后的生产工艺可以将滤纸酶活力和蛋白含量提高3倍。     

啤酒麦糟诱导里氏木霉生产纤维素酶的研究

以里氏木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）ＲｕｔＣ３０为产酶菌株，经适当预处理后的啤酒糟为碳源或诱导物，通过深层培养可获得较高浓度的纤维素酯液，当固体碳源浓度为２０ｇ／Ｌ，碳氮比为８．５时，于初始ｐＨ＝４．８温度２６～２８℃，转速１５０ｒ／ｍｉｎ下培养，其发酵时间为６ｄ酶液浓度可达３．８ＦＰＩＵ／ｍＬ，酶产率１７２ＦＰＩＵ／ｇ纤维素。     

里氏木霉RutC-30产纤维素酶条件优化研究

[目的]优化里氏木霉RutC-30产纤维素酶的液体发酵条件。[方法]以里氏木霉RutC-30为出发菌株,通过单因素试验研究培养基不同氮源(硫酸铵、尿素、蛋白胨)及浓度、不同碳源(纤维素、乳糖、甘油、葡萄糖)及浓度和不同的初始pH(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)对产酶的影响,在此基础上选取氮源、碳源和pH为影响因子采用正交试验探讨里氏木霉RutC-30产纤维素酶的优化条件。[结果]正交试验分析表明,各因素对产酶影响顺序依次为碳源>氮源>pH,里氏木霉RutC-30产纤维素酶的最佳条件是:以1%纤维素为碳源、以0.5%蛋白胨为氮源,初始pH值为4.0,在30℃产酶发酵培养5 d,纤维素酶活力高达7.303 U。[结论]里氏木霉RutC-30经优化培养后,产酶能力可得到大幅度提高,具有潜在的工业应用价值。     

黑曲霉葡萄糖氧化酶在里氏木霉中的分泌表达及其对内源纤维素酶表达的影响

目前饲料工业中所使用的纤维素酶和葡萄糖氧化酶来自不同的表达系统,其生产成本较高;而在同一种微生物宿主中同时表达这两种重要的饲料工业用酶则有可能会降低成本。根据里氏木霉中密码子的偏好性优化黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶基因god,并利用DNA assembler方法构建pRS424-cbh1P-god-cbh1T质粒(p PGT质粒);通过PEG介导的原生质体转化法,将其转入里氏木霉Tu-6Δtku70尿嘧啶缺陷型菌株中,经筛选得到葡萄糖氧化酶酶活较高的一株转化子(2号),SDS-PAGE分析显示重组GOD的蛋白分子量大小约为70 k Da,进一步使用质谱确证了GOD得到成功表达。摇瓶发酵表明,2号转化子在微晶纤维素诱导92 h后,GOD酶活达到4.63 U/m L。该转化子的滤纸酶活、内切葡聚糖酶活和外切纤维素酶活分别为7.88 U/m L、2.58U/m L和0.84 U/m L,而出发菌株分别为6.79 U/m L、3.19 U/m L和0.57 U/m L,而β-葡萄糖苷酶由原来的0.66U/m L提高到1.65 U/m L(1.5倍)。实验表明,在里氏木霉中表达GOD能显著提高β-葡萄糖苷酶的酶活,也能使总体纤维素酶活得到提高。     

高产纤维素酶木霉菌株的筛选

以前期筛选获得的20株木霉菌株为试验对象,通过刚果红羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基筛选出11株产纤维素酶能力较好的菌株,对其进行酶活性检测,发现菌株SS003产生的纤维素酶活性最高,并研究了温度和pH对该菌株所产的纤维素粗酶活性的影响。结果表明,SS003产生的纤维素酶最适反应温度为55~60℃,最适pH为3.0。     

产纤维素酶绿色木霉F-UV264产酶条件优化

对诱变菌株绿色木霉F-UV264产纤维素酶条件进行了研究,结果表明:以1%(NH4)2SO4和2%酵母膏为氮源,并加入3%表面活性剂,2%Mandels营养盐,麸皮与稻草粉比例为1∶3,加水量为干料的4倍,可提高酶的产量。该菌株最适产酶培养条件为pH值4.6~5.6,30℃条件下发酵96~135 h纤维素酶的酶活性达到较高水平。此研究可为工业化生产纤维素酶提供依据。     

里氏木霉DWC5纤维素酶的性质及应用的研究

对里氏木酶DWC5产生的纤维素酶性质进行了研究.里氏木霉DWC5粗纤维素酶粉在常温下可保存1 a.纤维素酶最适作用条件为50℃,pH 4.8,40℃以下酶稳定性较好,55℃1 hCMC酶活性保持83.23%,滤纸酶活性保持76.48%,70℃15 min酶活性几乎全部丧失.50℃时纤维素酶在pH4～8范围内稳定,相对酶活力保持在70%以上.将里氏木酶DWC5产生的纤维素酶应用于白酒和酒精发酵中,在每克玉米发酵料中加入6活力单位的纤维素酶,原料平均出酒率提高0.7%,相对出酒率提高2.7%;在每克高粱发酵料中分别加入5.7活力单位、11.4活力单位的纤维素酶,平均酒度分别比对照组增加0.5°和1°,相对出酒率分别比对照组提高14.29%和25.71%.     

高产纤维素酶木霉REMI突变株的构建与筛选

利用限制性内切酶介导的基因整合技术(REMI)转化T.koningii CICC 40144,共获得23个稳定的突变株。PCR检测结果表明质粒pV2已成功导入突变株中。此外,从已获得的木霉REMI突变株(178个T.atroviride T23的突变株、64个T.koningii T30的突变株和23个T.koningii CICC 40144的突变株)中筛选具有高纤维素酶活性的突变株,其中明显高于出发菌的菌株10余株(TK-2R-3、TK-2R-9、TK-2R-11、TK-2R-14、T30-B3、T30-C7、T23-A2H等)。研究发现出发菌纤维素酶活越高,其突变株纤维素酶活提高幅度越小。筛选获得了1株高产纤维素酶木霉突变株TK-2R-14,其CX酶活达37.6 U·mL-1,比出发菌提高8.05%,FPA酶活达16.9 U·mL-1,比出发菌提高19.01%。     

低纤维素酶背景里氏木霉菌株的构建和应用

丝状真菌里氏木霉（Trichoderma reesei）产生的纤维素酶主要包括纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶。在使用里氏木霉表达外源基因时,它们会形成较高的纤维素酶背景,而且其表达还可能会导致对细胞转录、翻译和分泌等相关资源的占用。应用CRISPR/Cas9技术,在体外组装Cas9/gRNA复合物并转化里氏木霉以定点敲除主要的纤维二糖水解酶cbh1基因,同时结合RNAi干扰技术来沉默主要的内切葡聚糖酶eg2基因,以期一步构建里氏木霉低纤维素酶背景的表达系统。获得了一株纤维素酶表达显著下降的11号转化子SUS6。该转化子中,cbh1的表达完全消失,而eg2基因的表达水平较出发菌株SUS5降低了98%。以该转化子为宿主表达外源基因NfBgl3A,两个代表性转化子的β-葡萄糖苷酶酶活最高分别为172.4和79.3 U·mL^-1,远高于以出发菌株（高纤维素酶背景）为宿主表达β-葡萄糖苷酶酶活（两个代表转化子分别为11.6和31.9 U·mL^-1）。因此,构建低纤维素酶背景的菌株作为表达宿主,还可明显的提高某些异源基因的表达水平。     

低纤维素酶背景里氏木霉菌株的构建和应用

丝状真菌里氏木霉（Trichoderma reesei）产生的纤维素酶主要包括纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶。在使用里氏木霉表达外源基因时,它们会形成较高的纤维素酶背景,而且其表达还可能会导致对细胞转录、翻译和分泌等相关资源的占用。应用CRISPR/Cas9技术,在体外组装Cas9/gRNA复合物并转化里氏木霉以定点敲除主要的纤维二糖水解酶cbh1基因,同时结合RNAi干扰技术来沉默主要的内切葡聚糖酶eg2基因,以期一步构建里氏木霉低纤维素酶背景的表达系统。获得了一株纤维素酶表达显著下降的11号转化子SUS6。该转化子中,cbh1的表达完全消失,而eg2基因的表达水平较出发菌株SUS5降低了98%。以该转化子为宿主表达外源基因NfBgl3A,两个代表性转化子的β-葡萄糖苷酶酶活最高分别为172.4和79.3 U·mL^-1,远高于以出发菌株（高纤维素酶背景）为宿主表达β-葡萄糖苷酶酶活（两个代表转化子分别为11.6和31.9 U·mL^-1）。因此,构建低纤维素酶背景的菌株作为表达宿主,还可明显的提高某些异源基因的表达水平。