小金海棠金属硫蛋白基因MxMT2克隆与生物信息学分析

以苹果属植物小金海棠(Malus xiaojinensis Cheng et Jiang)为试材,将差异筛选消减cDNA文库得到的27个金属硫蛋白cDNA片段序列构建成本地数据库,通过电子拼接和RT-PCR相结合的方法,分离到了小金海棠金属硫蛋白基因MxMT2(Genbank登录号为GQ906589),该基因全长610个碱基,开放阅读框(ORF)为240bp,编码80个氨基酸,推测分子量7.74kDa。该基因具有金属硫蛋白基因的典型结构域特征,编码的氨基酸含有14个半胱氨酸Cys,分布在蛋白质的N端和C端,呈Cys-Cys、Cys-X-Cys、Cys-X-X-Cys形式排列。通过系统进化树分析,小金海棠MxMT2与沙梨、杏树、美洲李等植物保持了较近的亲缘关系,与欧洲山毛榉、旱柳、红小豆、鼠尾草等植物亲缘关系较远。     

番茄中WRKY2基因的克隆

WRKY转录因子在植物应对生物或非生物胁迫的反应及生长和发育中起重要作用,为研究WRKY转录因子在番茄中的功能,本研究根据课题组已经克隆的番茄WRKY转录因子片段设计引物,采用RT-PCR方法,从JA诱导的番茄幼苗中,获得了608 bp的cDNA片段。序列分析表明,该序列含有WRKYGQK保守结构域,与Capsicum annuum WRKY-c序列相似性是79%,与Nicotiana tabacum NtWRKY-7序列相似性是74%,表明已经成功克隆了番茄WRKY2基因片段。     

小鼠睾丸Hsc70t基因的克隆与序列分析

摘要：为了获得小鼠睾丸Hsc70t基因的开放阅读框,根据GenBank中已发表的Hsc70t的基因序列设计了特异性引物（GenBank accession No:NM_013558）,提取睾丸中的总DNA,利用PCR方法扩增Hsc70t基因序列,连接到pMD18-T载体上,然后进行序列测定与序列分析。测序结果表明PCR扩增得到一条1926bp左右的基因片段。所测序列被GenBank 收录, 收录号为EU549780 ,与GenBank上公布的小鼠Hsc70t基因序列同源性达99.9%,与大鼠（Rattus norvegicus）、猕猴（Macaca mulatta）、黑猩猩（Pan troglodytes）、蟾蜍（Xenopus）、人类（Homo）和青鳉（Oryzias latipes）的相似性分别为94.4％、85.4％、84.9％、72.7％、71.9％、67.1％;进化树构建结果表明小鼠与大鼠距离最近。证实了Hsp70基因的高度保守性,并为Hsc70t的进一步研究和应用奠定了基础。     

丹参DHN2基因的克隆与序列分析

本文以组织培养2～13周的丹参幼苗为材料，构建丹参cDNA文库并进行大规模EST序列分析，所得序列经NCBI的BLAST工具分析，克隆号为rsmsxl_014903．y1．scf序列与晚期胚胎丰富(late embryogenesis abundant)基因家族Ⅱ中的成员有较高的同源性。该序列全长864bp，包含1个长726bp开放阅读框(ORF)，编码241个氨基酸，并含有ⅡLEA蛋白的特征序列，与NCBI注册的脱水素家族基因具有较高的同源性，表明本基因可能是一种新的脱水素基因，命名为DHN2，并在GenBank上进行了注册，序列号为：AY737725。     

小金海棠缺铁胁迫相关miR394a的克隆与表达分析

为了研究铁高效植物小金海棠的miRNAs信息及在缺铁处理下miRNA的表达变化,以进一步了解小金海棠缺铁分子调控机制。以改良CTAB法提取的总RNA为模板,从小金海棠中分离得到miR394a。通过Real-time PCR检测miR394a的表达,并利用生物信息学方法预测了miR394a的靶基因及其功能。miR394a具有高度保守性,从小金海棠中分离的miR394a与其他物种的miR394a序列高度相似。缺铁胁迫后,小金海棠的miR394a在根及叶中都有表达,但表达模式有所不同,miR394a在根部响应较为迅速,缺铁处理1天时,即有上调表达;而在叶片的响应较晚,缺铁3天时有上调表达。miR394a的靶基因预测表明,miR394a主要调控转录因子及参与代谢途径的基因。结果表明,miR394a受缺铁胁迫所诱导,参与了小金海棠缺铁调控途径,在缺铁调控中起重要作用。     

斑茅铜锌超氧化物歧化酶基因(SaSOD-1)的克隆与序列分析

斑茅是甘蔗近缘野生种之一,具有较强的抗逆性,研究并开发利用斑茅的强抗逆基因,对甘蔗育种具有重要意义。本研究以高粱Cu/Zn-SOD(登录号:XM 002445626.1)cDNA序列为探针,对甘蔗属EST数据库进行检索、比对、拼接,通过设计特异引物,PCR扩增和序列分析验证,克隆得到2个Cu/Zn-SOD(SaSOD-1a和SaSOD-1b,登录号:KJ001795和KJ001796)基因全序列,其中SaSOD-1a基因组序列全长2 473 bp,SaSOD-1b基因组序列全长2 228 bp,均有8个外显子,7个内含子,其cDNA序列长度均为692 bp,编码206个氨基酸。序列比较分析表明,SaSOD-1a和SaSOD-1b序列相似性为98.6%,有8个单核苷酸多态性位点,蛋白质相似性为99.0%,2个氨基酸变异位点。用推导出的氨基酸序列与其它植物做同源进化分析,与高粱、玉米、谷子等比较均表现出较高的保守性。研究结果可为进一步了解超氧化物歧化酶与斑茅耐旱性的关系奠定基础。     

黄瓜抗寒基因CsRAV2的克隆与序列分析

中国黄瓜品种繁多,很早就开始选育黄瓜品种,但黄瓜的抗逆性不强,容易产生病虫害和冷害.黄瓜幼苗早春定植在露地或冬春季节在保护地栽培,经常会出现低温冷害的情况,这对黄瓜的早熟和高产会有较大影响.因此,分析和验证冷胁迫相关的基因,探究黄瓜抗低温冷害形成的机理,可以为黄瓜耐低温品种的选育和抗性品种的培育奠定基础.本研究中以吉林地区主要栽培品种'翠秋20'为试验材料,通过RNA-seq测序技术筛选出一个AP2/EREBP转录因子中RAV亚族的CsRAV2,推测该基因可能参与黄瓜幼苗冷胁迫,采用PCR技术克隆CsRAV2的序列全长,同时通过生物信息学分析比对,了解CsRAV2的结构域与分类,结果表明:CsRAV2编码区序列全长1122 bp,编码了344 aa,为疏水性蛋白质,无明显信号肽和无跨膜结构,亚细胞定位在细胞核.该研究结果为深入探究CsRAV2基因的功能提供了科学依据.     

猪HK2基因的克隆及序列分析

为克隆猪己糖激酶2基因,分析其生物功能,采用已报道的人及小鼠HK2的cDNA序列为依据,利用电脑克隆策略获得的ESTs设计引物,扩增新的猪HK2基因cDNA序列。将PCR产物克隆测序,分析获得的核苷酸序列及其编码蛋白的特性,分离的开放阅读框全长2754bp,编码917个氨基酸,与人和小鼠的核苷酸序列同源率分别为90%和87%,与人和小鼠的氨基酸序列同源率分别为96%和94%,利用生物信息学软件分析出此蛋白的理化特性并预测了其蛋白结构,为进一步开展猪HK2基因的结构功能、表达调控的相关研究奠定了基础。     

绵羊intelectin基因cDNA克隆与序列分析

【研究目的】克隆并分析绵羊intelectin基因;【方法】十二指肠粘膜组织提取总RNA,分别以上游电子克隆的拼接体和下游保守区为模板设计引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD-19T载体连接后转化E. coli JM109,筛选阳性克隆并测序;【结果】克隆的绵羊intelectin基因与牛、猪、人、大鼠的同源性分别为93%、87%、83%、79% ,预测的氨基酸序列包含FBG结构域。【结论】成功克隆了绵羊intelectin-2基因,并注册GenBank (Accession. EF624459)     

鸡白细胞介素2的克隆及其序列分析

旨在从分子生物学角度进一步研究鸡免疫刺激因子白细胞介素2(IL-2),探究IL-2蛋白结构。根据GenBank发表的IL-2序列设计引物扩增IL-2基因,将其克隆到p GM-T载体后进行鉴定,鉴定正确的pT-IL-2重组质粒,然后对其进行序列分析。应用生物信息学软件对IL-2序列进行跨膜区、磷酸化位点、氨基酸序列、开放阅读框进行分析和IL-2蛋白的三级结构进行预测。核苷酸序列测定结果表明:IL-2基因片段为430 bp,编码143个氨基酸。生物信息学分析结果表明:本实验获得的IL-2基因编码的蛋白质中含有1个丝氨酸和3个苏氨酸,这可能成为蛋白激酶磷酸化的位点。IL-2蛋白可能在5~28位含有跨膜区。其蛋白二级、三级结构预测结果显示其属于亲水性蛋白,多为α-螺旋、β-转角和N端无规卷曲结构。该结果为IL-2的分子生物学探究奠定了基础。     

芍药分生组织决定基因APETALA2(AP2)的克隆及生物信息学分析

花分生组织决定基因APETALA2(AP2)属于植物ABCDE模型基因,在花器官发育过程中起着重要的调控作用。为进一步了解芍药AP2基因的生物学功能,利用RACE扩增和测序技术克隆plAP2基因序列,利用生物信息学在线程序对其序列特征、蛋白结构及功能、亚细胞定位进行预测,并利用MEGA 5.0构建不同植物AP2分子进化树,最后利用qPCR检测其在内外花瓣中的差异表达情况。结果显示,克隆获得芍药AP2基因(plAP2)cDNA序列全长1 935 bp,其ORF全长为1 578 bp,编码525个氨基酸。蛋白结构与功能分析表明,plAP2蛋白为亲水性不稳定蛋白,无跨膜结构和信号肽,表明为非分泌蛋白;核定位信号位于氨基酸序列139-147(KKSRRGPRS);二级结构包括α-螺旋(24%)、β-折叠(19%)、β-转角(28%)和无规则卷曲(28%);plAP2蛋白存在8个糖基化位点和64个磷酸化位点,plAP2蛋白包含2个相同的保守结构域:AP2/(Ethylene-Responsive factors,ERF)(151-213aa和243-306aa)。亚细胞定位主要在细胞质(45.0%)中,少量分布于微体、线粒体基质间隙和溶酶体;进化树分析表明,芍药AP2基因与牡丹高度同源且亲缘关系最近;qPCR检测显示外瓣AP2表达量均极显著高于内瓣(P0.01)。克隆出芍药AP2全长cDNA序列,系统地揭示了plAP2蛋白基本结构、功能位点区域、细胞定位以及组织表达情况,为今后深入研究plAP2基因功能提供基础素材和理论参考。     

疣粒野生稻金属硫蛋白(OMMT-2)基因的获得及序列分析

从疣粒野生稻叶片cDNA文库中分离出1个金属硫蛋白基因的cDNA序列,命名为OMMT-2。该基因全长532bp,其中5’非翻译区为111bp,3’非翻译区171bp,开放阅读框长249bp,编码82个氨基酸,该蛋白的分子量为7775.9,理论等电点为6.49;基因编码的氨基酸含有14个半胱氨酸(Cys),占了总氨基酸的17.07%,且集中分布在肽链的N端和C端,呈CXC和CXXC排列方式。疏水性分析表明,该蛋白在43~56个氨基酸之间有较强的疏水区。通过氨基酸序列分析表明,金属硫蛋白中半胱氨酸的位置和数目有较强的保守性,揭示了半胱氨酸对金属硫蛋白的功能十分重要。     

小金海棠抑制性消减cDNA文库的构建及文库质量分析

构建小金海棠抑制性消减文库,为进一步大量筛选、克隆苹果铁高效基因、果树转基因工程奠定基础。试验是在提取水培条件下小金海棠缺铁(EDTA-Fe2＋,4μmol/L)和正常供铁(EDTA-Fe2＋,40 μmol/L)的根的总RNA,经过LD-PCR扩增双链cDNA后,利用抑制性消减杂交(SSH)方法,通过两轮杂交和两次抑制性PCR,构建了小金海棠缺铁条件下包含1200个独立克隆的消减cDNA文库。用菌落PCR检测,结果显示插入片段大小范围在300~800bp之间,提取质粒进行PCR和质粒RsaⅠ酶切同样也得到一致性的结果。     

美洲南瓜WRKY4基因克隆与序列分析

以美洲南瓜(Cuc urbita pepo)幼叶为材料,采用Trizol方法进行总RNA的提取.根据GenBank上己提交的黄瓜WRKY4基因序列保守区域设计特异性引物,扩增得到1条长度为497 bp的WRKY4转录因子基因片段,利用已知中间序列,通过RT-PCR和RACE (rapid amplification cDNA ends)等技术,克隆得到美洲南瓜WRKY4的cDNA全长序列,长度为l 722 bp,5′非翻译区为185 bp,3′非翻译区为118 bp,开放阅读框为1 419 bp,编码472个氨基酸,分子量约为51.40 kD,等电点约为8.36,GenBank登录号为JX096811.用Blast和DNAMAN软件对其核苷酸序列进行分析,结果显示,美洲南瓜WRKY4与黄瓜WRKY4同源性达到87％.美洲南瓜WRKY4基因克隆及序列分析为以后研究此基因的功能奠定了基础.     

三黄鸡β-防御素基因片段的克隆与序列分析

根据GeneBank公布的鸡β-防御素序列设计一对特异性引物,运用RT-PCR技术从新郑三黄鸡肺脏组织中扩增其β-防御素基因并测序分析,结果表明,获得了195bp的cDNA目的片段,编码65个氨基酸;BLAST分析表明,该片段与GeneBank中已公布的鸡β-防御素Gal-9序列基因同源性达到98％。其与已公布的10个Gal-9序列进行同源性比较,并绘制系统发育进化树的结果显示,所测的防御素基因核苷酸同源性为91.8％～94.4％;进化树分析表明获得的目的基因与Gal-9基因处于同一进化分支。这为进一步研究Gal-9基因在地方品种鸡中的先天性免疫功能奠定了基础,也为研发具有广谱抗菌活性的新型肽类生物制品奠定了前期基础。     

猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒HN-HW株ORF2-7基因的克隆与序列分析

为了研制有效的PRRS疫苗,参照GenBank中公布的猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型ATCC VR-2332基因序列,用Primer 5.0软件分别设计合成了针对PRRSV ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7基因的特异性引物,利用RT-PCR从HN-HW株分别扩增得到了大小约771,904,564,670,619和586 bp的片段,并将扩增的片段插入pGEM-Teasy载体,然后转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中,挑取阳性克隆PCR和酶切鉴定后进行测序.利用DNAStar软件将HN-HW株ORF2-7基因的核苷酸序列和推导氨基酸序列与ATCC VR-2332、JX-A1、CH-1a、BJ-4、HB-1、HB-2、HEB-1、HUB-1、HUB-2、SP、P129、MN184A、RespPRRS MLV、Prime Pac、LV等毒株相应序列进行了同源性分析,并绘制系统进化树.结果显示,HN-HW株与美洲型ATCC VR-2332核苷酸同源性为88.9%～94.9%,与欧洲型LV核苷酸同源性为64.0%～69.0%;推导氨基酸序列与ATCC VR-2332株同源性为82.4%～96.0%,与LV株的同源性为34.5%～78.9%.系统进化树表明,HN-HW株属于美洲型,与JXA1、HUB-1、HUB-2、HEB-1亲缘关系较近.