大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位基因的原核表达

大肠杆菌(Escherichia coli)不耐热肠毒素B亚单位(LTB)不仅是重要的黏膜免疫原,而且作为佐剂在黏膜免疫中起着重要的作用.试验采用PCR方法扩增了肠毒素性大肠杆菌的LTB基因,并将其克隆到pGEX-KG原核表达栽体上,构建了重组质粒pKG-LTB,经酶切和测序鉴定后,转化到大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western-blot分析表明,克隆的LTB基因与谷胱甘肽转移酶(GST)基因获得了高效融合表达,表达的融合蛋白GST-LTB分子量约为35kDa,并具有免疫反应活性.这为进一步研究LTB蛋白黏膜免疫原性和黏膜佐剂的作用奠定了基础.     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位与产气荚膜梭菌毒素融合蛋白的免疫原性

梭菌毒素作为产气荚膜梭菌的主要致病因子可引起家畜的多种疾病,其中β1毒素和β2毒素是由C型菌产生的2种引起动物坏死性肠炎的主要致病因子。基因工程重组毒素蛋白已作为潜在候选疫苗用于预防该菌所引起的多种传染性疾病,大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)是一种常用的黏膜免疫佐剂。本研究将ltb-cpb2-cpb1及ltb-cpa融合基因进行IPTG的诱导表达,制备了包涵体粗提物,并对小白鼠进行免疫攻毒试验及其免疫后抗原免疫保护期的免疫原性的研究。结果显示,经LTB-CPB2B1及LTB-CPA重组蛋白免疫后的小白鼠在第28、第56天时用产气荚膜梭菌强毒攻击,可获得很好的保护,产气荚膜梭菌毒素与LTB融合基因重组菌株能够有效刺激免疫小白鼠产生特异性抗体。说明该重组菌株可以作为预防产气荚膜梭菌所引起疾病的候选菌株。     

大肠杆菌肠毒素STI、STII、LTB融合基因植物表达载体的构建

产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)LT和ST是导致人和动物腹泻的主要病原菌。利用PCR方法分别从pGEM-5Zf( )-STI、K88ab(LT ,ST )质粒中扩增到了STI、STII基因,然后通过三引物PCR实现了STI、STII基因的融合,再与LTB基因融合,并置同一阅读框。LTB基因的5′位于STII基因的3′端,并在ST基因和LTB基因之间插入7个氨基酸的连接肽。将融合基因STI-STII-LTB构建到带有核基质结合区序列(MARs)的植物表达载体pBI121-MARs中,并通过冻融法导入根癌农杆菌EHA105。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在毕赤酵母中的表达及鉴定

为了在毕赤酵母中高效表达大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)及研制具有粘膜免疫佐剂活性的无毒重组LTB,采用PCR方法从产毒型大肠杆菌H44815菌株扩增获得LTB完整编码区DNA,将其克隆到酵母表达载体pPIC9K的分泌信号肽基因下游,构建真核表达载体pPIC9K-LTB;重组质粒经核苷酸测序确认并线性化后电转化毕赤酵母菌株KM71,PCR筛选转化子,并以小量诱导表达筛选高效表达工程菌株,最后Western blotting分析甲醇诱导上清中的LTB及采用亲和层析和HiTrap Desalting预装柱脱盐纯化蛋白。结果表明,PCR克隆获得的LTB编码DNA序列与GenBank登录DNA序列完全一致,定向插入pPIC9K载体,可获得表达LTB的酵母分泌表达载体pPIC9K-LTB;电转化后的重组酵母菌KM71诱导表达产物经SDS-PAGE和Western blotting分析,发现甲醇诱导的培养基上清中含LTB,且具有较好的免疫原性。     

多聚磷酸盐激酶(PPK)基因植物表达载体的构建

[目的]枸建融合表达PPK和绿色荧光蛋白的融合表达载体pCAMBIA1302-PPK.[方法]根据GenBank中登录的大肠杆菌PP基因序列(L03719)设计引物,以E.coli DH5α基因组DNA为模板,通过PCR扩增得PPK基因,然后用In-Fusion@HD Cloning Kit将PPK基因克隆到pCAMBIA1302载体的Nco Ⅰ酶切位点.[结果]序列测定结果显示,pCAMBIA1302-PPK含有约2.0kb的PPK基因片段,说明PPK基因已插入植物表达载体pCAMBIA1302的绿色荧光蛋白基因前.[结论]成功构建了融合表达PPK和绿色荧光蛋白的融合表达载体pCAMBIA1302-PPK.     

植物基因工程疫苗高效表达载体的构建

分别将编码HIV-1的gag基因、gpl20基因及gag-gp120嵌合基因,FMDV的P1全长基因和猪白细胞介素18(ILl8)基因克隆到含CaMV35S启动子控制下的双元表达栽体pBIl21中,并通过冻融法导入农杆菌LBA4404,成功构建了能在植物中高效表达的5种植物表达载体：pBIl21gag,pBIl21gp,pBIl21gg,pBIl21P1,pBIl21IL18。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在大肠杆菌中的表达及其特性研究

将大肠杆菌不耐热性肠毒素B亚单位(LTB)基因eltb克隆到表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21/DE3/plyss。采用SDS-PAGE和Western blot分析,结果表明,在大肠杆菌中高效表达了LTB蛋白,其产量约为细菌总蛋白的20%,GM1-ELISA方法鉴定目的重组蛋白可与GM1结合,具有潜在的佐剂活性;由纯化的重组蛋白免疫小鼠制备的抗血清效价为1:16000,并且可以特异性识别天然毒素。结果表明,所表达的LTB有良好的抗原性和佐剂活性,制备的抗血清具有良好的免疫活性,为下一步以LTB作为佐剂的黏膜疫苗研究提供基础材料。     

产肠毒素大肠杆菌K88-STII-LTA2/LTB融合基因在烟草中的表达

融合保护性抗原的LT类全毒素具有传输抗原载体和免疫佐剂两重功效。利用基因工程技术，构建了带有信号肽的Pr1as-K88ac-STII-LTA 2/UP-LTB融合基因的双价植物表达载体。双价植物表达载体通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101，并利用农杆菌介导技术叶盘法转化模式植物烟草。转基因烟草经PCR和RT-PCR初步检测，证明外源基因已经整合到受体植物基因组中，同时表明融合基因在转录水平上有表达。转基因烟草的获得，为进一步研制新型的抗腹泻植物口服疫苗奠定了良好的基础。     

多聚磷酸盐激酶(PPK)基因植物表达载体的构建(英文)

[目的]构建融合表达PPK和绿色荧光蛋白的融合表达载体pCAMBIA1302-PPK。[方法]根据GenBank中登录的大肠杆菌PPK基因序列(L03719)设计引物,以E.coli DH5α基因组DNA为模板,通过PCR扩增得PPK基因,然后用In-Fusion@HD Cloning Kit将PPK基因克隆到pCAMBIA1302载体的NcoI酶切位点。[结果]序列测定结果显示,pCAMBIA1302-PPK含有约2.0kb的PPK基因片段,说明PPK基因已经插入植物表达载体pCAMBIA1302的绿色荧光蛋白基因前。[结论]成功构建了融合表达PPK和绿色荧光蛋白的融合表达载体pCAMBIA1302-PPK。     

AtDREB2B基因的克隆及植物表达载体的构建

[目的]获得耐旱转录因子的植物表达载体,进而转化植物获得耐旱性提高的新植物株系。[方法]提取脱水处理的拟南芥总RNA,利用AtDREB2B特异引物通过RT-PCR扩增出1.2kb片段,并将其克隆至pBS-T上,测序。[结果]序列分析表明,该克隆序列与GenBank上登录AtDREB2B基因序列的一致性为100%。进一步通过片段的亚克隆,将其构建至植物表达载体pCAMBIA1301和pBin438上,分别由rd29A启动子和重复35S启动子调控基因表达。[结论]成功构建了2种AtDREB2B的植物表达载体,并通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101,为农杆菌介导的AtDREB2B基因对植物的遗传转化奠定基础。     

大肠埃希菌不耐热肠毒素双突变体的表达及活性研究

为了使大肠埃希菌不耐热肠毒素(LT)的毒性丧失或减弱的同时仍保留其较强的免疫原性,通过PCR和重叠—延伸PCR扩增突变体LTK63/G192基因片段,IPTG诱导表达目的蛋白,经Western免疫印迹检测目的蛋白,在HPLC系统上纯化目的蛋白,经ADP-核酸转移酶试验及Patent-mouse毒性试验检测其酶活性与毒性,纯化的目的蛋白与鸡新城疫病毒弱毒疫苗联合一起经滴鼻免疫鸡。结果表明:制备的突变体LTK63/G192的基因片段经酶切和测序发现,所构建的表达载体pLTK63/G192阅读框架正确,且相应位点氨基酸获得了替换;经SDS-PAGE电泳检测,野生型LT及双突变体均表达出约33.0ku和13.0ku的两条蛋白带,与LTA、LTB亚基分子质量相吻合;经Western bolt检测,两个蛋白亚基均可与His抗体发生特异性反应;双突变蛋白的酶活性和毒性与野生型LT相比酶活性和毒性都有所降低;突变体LTK63/G192能辅助新城疫疫苗在血清和黏膜中产生较高抗新城疫病毒的IgG和IgA。说明LTK63/G192是一个良好的免疫佐剂。     

产气荚膜梭菌肠毒素基因原核表达载体的构建

以含C型产气荚膜梭菌分离株(CP2)肠毒素基因的克隆载体pMD18-T-cpe为材料,根据产气荚膜梭菌开放阅读框设计合成一对特异性引物,采用PCR技术对其进行扩增,经BamHI和EcoRI双酶切后,从胶上回收目的基因,与经过相同两种内切酶处理的原核表达栽体pET32a连接,转化大肠杆菌DH5a感受态细胞后,提取质粒进行PCR和BamHI/EcoRI双酶切鉴定后测序.结果表明,肠毒素基因已成功地克隆到原核表达栽体上(重组质粒命名为pET32a-cpe),从而构建了产气荚膜梭菌肠毒素基因的原核表达质粒.     

hbFGF基因的克隆及其植物双元表达载体的构建

[目的]为利用植物基因工程技术获取hbFGF基因奠定基础。[方法]采用RT-PCR方法克隆hbFGF基因,将其插入双元表达载体pCambia1301中,构建植物表达载体pCambia1301-hbfgf,并将该表达载体导入发根农杆菌菌株C58C1。[结果]1%琼脂糖凝胶电泳结果显示,hbFGF基因被成功连接到克隆载体pMD18-T上,且重组质粒pMD18-T-hbfgf的DNA测序结果与GenBank中登录的hbFGFcDNA序列完全一致;双元表达载体重组质粒pCambia1301-hbfgf经BamHI消化后进行1%琼脂糖凝胶电泳,结果显示,电泳图谱中出现1200、10000bp2个片段,说明hbFGF基因已被成功克隆到植物表达载体pCambia1301中;农杆菌转化子PCR产物电泳图谱中483bp处出现条带,说明pCambia1301-hbfgf已被转入农杆菌中。[结论]该研究成功获得了可直接用于遗传改良的工程菌pCambia1301-hbfgf-C58C1。     

拟南芥两个MYB基因标签融合蛋白植物表达载体的构建

[目的]研究MYB类基因At3g11280和At5g05790的详尽功能。[方法]利用农杆菌将标签蛋白融合的At3g11280和At5g05790基因转化拟南芥,利用转基因植株中标签蛋白的抗体进行染色体免疫共沉淀（ChIP）试验,挖掘两基因所调控的下游基因。[结果]首先扩增了At3g11280和At5g05790基因的CDS片段,随后经过一系列的亚克隆过程将两个基因和标签蛋白的融合基因片段克隆到载体pWM101上,位于35S启动子的下游,转录受35S启动子的调控。[结论]成功地构建了标签融合蛋白植物表达载体,两个基因分别携带HA和Flag标签,载体的成功构建将为ChIP试验奠定基础。     

蓝舌病病毒 NS4 基因原核表达载体的构建与表达

蓝舌病病毒（Bluetounge virus,BTV）非结构蛋白4（Non-structural protein 4,NS4）拮抗干扰素的产生,在BTV逃避宿主天然免疫的过程中发挥重要作用。利用PCR扩增得到 NS4 基因,与空载体pET-32a双酶切后连接,构建pET-32a- NS4原核表达载体;将pET-32a- NS4转化至E.coli BL21感受态细胞,以IPTG诱导表达;利用SDS-PAGE确定IPTG的最佳诱导浓度、时间与重组蛋白的表达形式;利用Western blot分析重组蛋白的表达情况。结果表明,成功构建pET-32a- NS4原核表达载体;IPTG最佳诱导浓度为 0.8 mmol/L,时间为6 h,蛋白主要以包涵体形式表达;Western blot在27 ku处可见目的条带,与预期相符。本研究成功构建pET-32a- NS4原核表达载体,实现NS4蛋白的大量、高效表达,为进一步探究NS4蛋白在BTV拮抗宿主天然免疫中的作用机制提供材料。     

核糖体失活蛋白(RIP)基因克隆及其表达载体的构建

以按玉米RIP基因(M83927)序列设计合成的特异性引物,用提取的玉米基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增目的片段,测定并克隆玉米的RIP基因。序列分析表明,它们的核苷酸和氨基酸序列与GenBank中登录的CRIP(M83927)的同源性分别为99.90%和100%。RIP与植物表达载体pCAMBIA2301相连构建成为带有35S启动子和polyA终止子的植物表达载体p2301-RIP。     

大肠杆菌热敏感肠毒素的检测与制备

为探索猪源大肠杆菌热敏感肠毒素的简易检测方法和纯化方法,拟采用兔回肠结扎试验、兔皮肤蓝斑试验和平板免疫溶血试验比较检测热敏感肠毒素的方法。初步试验表明:平板免疫溶血试验能够快速灵敏地检测出热敏感肠毒素,并具有很强的特异性,比肠结扎试验灵敏度高,而且简便易行;采用SephadexG 100纯化热敏感肠毒素LT并采用SDS PAGE电泳检测蛋白纯度,表明该方法可以除去杂蛋白,肠毒素蛋白分子量为12 5KD和25KD