兰花两种主要病毒双重RT-PCR检测方法的建立

根据建兰花叶病毒(Cymbidiummosaic virus,CymMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglossumringspot virus,ORSV)这两种主要兰花病毒的保守序列设计特异性引物,在CymMV和ORSV单一RT-PCR优化体系的基础上,建立了同时检测CymMV和ORSV的双重RT-PCR检测方法。此方法可特异性地从感染CymMV和ORSV的样品中扩增出2条目的带,即CymMV(781 bp)和ORSV(588 bp)。扩增产物测序表明,CymMV扩增产物与GenBank中登陆的分离物核苷酸同源性为84%~97%,ORSV扩增产物与GenBank中其它分离物的核苷酸序列同源性为98%~99%。运用该方法对随机抽取的田间样品及组培苗样品进行检测,都得到了特异性扩增条带,其灵敏度达到了10-5。     

利用ELISA检测两种兰花病毒的研究

建立了三抗夹心酶联免疫吸附法(TAS-ELISA)检测建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)和双抗夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)检测齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)的方法.共检测了浙江省内139个兰科样品和8个百合科样品,结果表明有31.7%的兰花检出CymMV,有28.8%的兰花检出ORSV.根据病毒外壳蛋白基因上下游保守序列设计了检测ORSV的引物,参照周国辉报道设计了检测CymMV的引物并对人工接种两种病毒的兰花进行了逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测,结果表明,RT-PCR检测结果与ELISA结果相一致,进一步证实本研究建立的TAS-ELISA,DAS-ELISA方法稳定可靠,重复性好,可应用于兰花上CymMV和ORSV两种病毒的早期诊断和检测.     

齿兰环斑病毒RT-qPCR检测方法的建立

【目的】针对齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus, ORSV)建立快速、有效检测方法,对于保障兰花规模化生产有重要意义。【方法】以齿兰环斑病毒为材料,根据NCBI上已登录的齿兰环斑病毒外壳蛋白(coat protein, cp)基因序列分析其序列保守区,使用Primer Premier 5.0设计反转录荧光定量PCR引物及TaqMan荧光探针,建立检测齿兰环斑病毒的一步法RT-qPCR。构建齿兰环斑病毒cp基因克隆质粒,并以该质粒作为标准品进行荧光定量PCR标准曲线测定;以齿兰环斑病毒、建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)的病毒RNA为模板进行一步法RT-qPCR特异性检测;以10倍倍比稀释的cp基因质粒为模板进行灵敏性检测;用该法对大田18个兰花样品进行齿兰环斑病毒感染情况监测。【结果】齿兰环斑病毒一步法RT-qPCR检测法仅检出齿兰环斑病毒阳性模板,其余模板检测结果为阴性,说明检测方法具有特异性;该方法能够检测到的齿兰环斑病毒cp基因最低拷贝数...     

甘蔗线条花叶病毒 RT-LAMP 检测方法的建立及应用

【目的】建立甘蔗线条花叶病毒（Sugarcane streak mosaic virus,SCSMV）的 RT-LAMP 检测方法,为 SCSMV 的检测提供技术支持。【方法】根据甘蔗线条花叶病毒外壳蛋白基因的保守序列设计特异引物,优化 RT-LAMP 的反应条件,对比分析 RT-LAMP 的检测灵敏度和特异性;并在 RT-LAMP 反应产物中加入 SYBR GREEN I 进行可视化检测,方便快速判定结果。【结果】成功建立了一种用于检测 SCSMV 的 RT-LAMP 方法,可在 60 ~ 63 ℃下 60 min 完成对 SCSMV 的检测,且具有较高的灵敏度,比传统 RT-PCR 高 100 倍,最低检测RNA 浓度为 167.9×10-5 ng。此外,该方法具有较高的特异性,可特异检测 SCSMV。【结论】建立了一种灵敏、简便、快速的 SCSMV RT-LAMP 检测方法并用于田间甘蔗样品的检测。     

水稻黑条矮缩病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

【目的】建立一种快速、灵敏的逆转录环介导等温扩增方法（RT-LAMP）检测寄主植物和传毒介体体内的水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV）。【方法】合成4条针对RBSDV S10核苷酸序列6个位点的特异性引物。分别对引物浓度、MgSO4浓度、反应温度和时间进行优化。将感病水稻总RNA梯度稀释后进行灵敏性检验并与RT-PCR比较分析。选择RBSDV和南方水稻黑条矮缩病毒（SRBSDV）验证该方法的特异性。用本RT-LAMP方法检测田间病株。【结果】RT-LAMP检测方法可排除SRBSDV的干扰而特异地检测植物和飞虱体内的RBSDV,与RT-PCR灵敏性基本一致。检测结果易于判定。【结论】RT-LAMP检测方法适合寄主植物和介体体内RBSDV的快速检测。     

双重一步法RT-PCR检测2种主要兰花病毒

[目的]研究建兰花叶病毒（CymMV）和齿兰环斑病毒（ORSV）双重一步法RT—PCR检测方法,为病毒的早期快速诊断提供技术支持。[方法]根据2种病毒的外壳蛋白基因的保守序列分别设计两对特异性引物,并进行双重与单一RT—PCR对比试验。[结果]结果在健康蜘蛛兰被人工接种病毒后第10天和第21天用一步法RT-PCR方法分别获得CymMV和ORSV与预期相符的约764和946bp扩增产物务带;且双重一步法RT—PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后,出现两务与单一RT—PCR产物相对应的清晰务带,获得较理想的检出效果;扩增产物的核酸序列经BLAST分析,同源性均在85％以上,证实了检测结果的准确性。[结论]该方法具有更加灵敏、特异、快速和简便的特点,适合于两种主要兰花病毒的同时快速检测。     

猪脑心肌炎病毒一步法RT-PCR检测方法的建立及应用

【目的】实现快速、准确地对猪脑心肌炎进行临床诊断和病原学检测。【方法】根据GenBank中已发表的猪脑心肌炎病毒（EMCV）3D基因序列设计合成1对特异性引物,优化反应条件,建立了EMCV一步法RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行验证。【结果】一步法RT-PCR可以从EMCVB JC3株中扩增出与试验设计相符的286bp特异性片段,而对猪口蹄疫病毒（FMDV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、BHK-21正常细胞的扩增结果均为阴性;对EMCVBJC3株细胞毒的敏感度达到2TCID50;对10份EMCVB JC3株细胞毒进行重复性检测,结果均一致;对207份临床疑似发病猪的病料进行检测,其阳性检出率为9.18%。【结论】所建立的EMCV一步法RT-PCR检测方法具有特异、灵敏、高效、快速等特点,可用于EMCV的临床检测及流行病学调查。     

猪脑心肌炎病毒一步法RT-PCR检测方法的建立及应用

【目的】实现快速、准确地对猪脑心肌炎进行临床诊断和病原学检测。【方法】根据GenBank中已发表的猪脑心肌炎病毒（EMCV） 3D基因序列设计合成1对特异性引物,优化反应条件,建立了EMCV一步法RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行验证。【结果】一步法RT-PCR可以从EMCV BJC3株中扩增出与试验设计相符的286 bp特异性片段,而对猪口蹄疫病毒（FMDV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、BHK-21正常细胞的扩增结果均为阴性;对EMCV BJC3株细胞毒的敏感度达到2 TCID50;对10份EMCV BJC3株细胞毒进行重复性检测,结果均一致;对207份临床疑似发病猪的病料进行检测,其阳性检出率为9.18%。【结论】所建立的EMCV一步法RT-PCR检测方法具有特异、灵敏、高效、快速等特点,可用于EMCV的临床检测及流行病学调查。     

脑心肌炎增强型绿色荧光蛋白嵌合病毒的构建

携带增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein, EGFP)的脑心肌炎(Encephalomyocarditis virus, EMCV)嵌合病毒是研究该病毒体内外生物学特性的有力工具。因此,本研究基于前期构建的巨细胞病毒(Cytomegalovirus, CMV)感染性克隆,在EMCV基因组2A蛋白序列之后插入EGFP基因片段,并将重组质粒转染BHK-21细胞,获得携带EGFP的嵌合病毒。通过荧光定量PCR(real-time PCR)、间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence assay, IFA)及半数组织细胞感染量测定(Median tissue culture infective dose, TCID₅₀)等方法对拯救病毒的基因组复制、蛋白表达及病毒粒子的感染性进行测定,结果证实嵌合病毒能够在BHK-21细胞上成功表达EGFP并产生完整的病毒粒子。然而,相较于野生型亲本拯救病毒,嵌合病毒在BHK-21细胞上的复制能力降低,并且在连续传代后逐渐失去绿色荧光信号,表明嵌合病毒中EGFP...     

计算机病毒的预防和杀毒策略

针时计算机病毒的种类，常见的传播方式，命名规则以及命名解释进行了介绍，并根据其传播方式，介绍了相应的防毒措施和有效的顽固性病毒杀毒策略。按照所介绍的知识，能够防止绝大部分病毒时网络计算机的入侵，并能够在杀毒软件无效的情况下，对顽固性病毒进行彻底地查杀。     

Types of Maize Virus Diseases and Progress in Virus Identification Techniques in China

There are a total of more than 40 reported maize viral diseases worldwide.Five of them have reportedly occurred in China.They are maize rough dwarf disease,maize dwarf mosaic disease,maize streak dwarf disease,maize crimson leaf disease,maize wallaby ear disease and corn lethal necrosis disease.This paper reviewed their occurrence and distribution as well as virus identification techniques in order to provide a basis for virus identification and diagnosis in corn production.     

表达禽流感病毒凝素基因的重组禽痘病毒的构建

为构建表达禽流感病毒（ＡＩＶ）血凝素（ＨＡ）基因的重组禽痘病毒,将禽痘病毒启动子ＬＰ２ＥＰ２驱动的Ｈ７亚型ＡＩＶ ＨＡ基因ｃＤＮＡ和大肠杆菌ＬａｃＺ基因插入禽痘病毒疫苗株Ｆ－０１７的复制非必需区。经蓝班筛选后,对重组病毒又进行了３次蚀斑克隆。以不同代次重组禽痘病毒核酸为模板,利用Ｈ７亚型ＡＩＶ ＨＡ基因特异的引物进行聚合酶链式反应,均扩增出１条特异的１．７ｋｂ ＤＮＡ条带。收集不同代次的重组禽痘病毒细胞培养物进行免疫斑点试验,均检测到ＨＡ蛋白,表明Ｈ７ ＨＩＶ ＨＡ在重组禽痘病毒中获得了成功表达。该重组禽痘病毒的构建为ＡＩＶ病毒活载体疫苗的研制奠定了基础。     

病毒钝化剂对水稻条纹叶枯病的控制作用

病毒钝化剂对水稻条纹叶枯病等病毒病的控制作用一直存在争议,试验研究表明,毒钝化剂对水稻条纹叶枯病有一定的控制效果,但是随着秧苗生长作用逐步减弱,生产上建议与杀虫剂混用,以提高整体防病效果。     

猪瘟伪狂犬病重组病毒SA215(A)疫苗株的构建(初报)

采用磷酸钙转染系统 ,将伪狂犬病三基因缺失疫苗SA2 15株DNA与PP6 3LacZE2DNA共转染Vero细胞 ,获得SA2 15 (A) 1、SA2 15 (A) 2和SA2 15 (A) 3等 12个重组病毒株。以光生物素标记的HCVE2基因为探针进行初步鉴定后 ,挑选SA2 15 (A) 1株作BamHⅠ酶切和southern转印杂交鉴定 ,结果表明构建是成功的 ,将其命名为SA2 15(A)。直接荧光抗体检测、SDS -PAGE电泳和western免疫印迹检测结果表明HCVE2基因在重组病毒内获得表达 ,产生大小约 5 1kd的蛋白。对SA2 15 (A)株进行部分生物学特性研究 ,培养特性观察试验表明该毒株可适应Vero、BHK2 1和鸡胚成纤维细胞等多种细胞 ,但对不同细胞系表现有一定的差异。     

水稻矮缩病媒介昆虫及其传毒机制的研究进展

水稻矮缩病是不同病毒引发的几种植株矮缩症状的总称。为全面了解该病媒介昆虫的传毒机制,对水稻普通矮缩病毒、水稻黑条矮缩病毒、南方水稻黑条矮缩病毒、锯齿叶矮缩病毒和草状矮化病毒引发的水稻矮缩病的媒介昆虫及其传毒机制的研究情况进行综述,分析和讨论了未来的研究方向。     

鸡痘病毒载体研究进展

本文就鸡痘病毒作为基因工程重组疫苗的重要载体研究的进展作以综述，主要包括鸡痘病毒表达载体的构建，外源基因在重组鸡痘病毒中的表达及免疫效果，并对鸡痘病毒载体的研究及开发应用前景加以展望。     

禽流感病毒 HA 基因在狂犬病毒中的表达

为了研究狂犬病毒作为载体表达外源基因的特性,将禽流感病毒 HA 基因插入狂犬病毒全基因组cDNA感染性克隆pHEP-3.0 G基因与L基因的假基因位点,再通过反向遗传技术,获得了携带流感病毒 HA 基因的嵌合狂犬病毒(HepFHA),并进行了病毒传代与 HA 基因表达的研究. 结果显示,重组病毒经BHK-21细胞传代10次,病毒表达稳定,但各代次常规红细胞凝集试验均为阴性; Western blotting检测到病毒表达产物中存在部分HA蛋白的表达,其相对分子质量为39 540,与HA裂解的HA1蛋白相对分子质量相吻合.     

地黄花叶病毒的分子检测

设计了能同时检测Re MV、TMV和ToMV的简并引物,利用RT-PCR的方法对我国不同地区的地黄病毒样品进行了检测。共克隆了25个病毒样品的外壳蛋白(CP)基因,序列测定结果表明,24个病毒样品均是Re MV,其相近病毒TMV未检测到,ToMV仅在一个野生地黄样品上检出,说明Re MV在我国栽培地黄和野生地黄上普遍存在。