应用IC-RT-PCR方法检测齿兰环斑病毒和建兰花叶病毒

根据已报道的建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒外壳蛋白基因序列设计PCR引物,建立了蝴蝶兰建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒IC-RT-PCR检测方法。用该方法对天津地区8个蝴蝶兰标样检测,结果显示:8个标样中有4个检测到建兰花叶病毒,另外4个检测到齿兰环斑病毒。该方法简化了操作程序,为蝴蝶兰种苗病毒的快速检测奠定了基础。     

李属坏死环斑病毒（PNRSV）RT-LAMP检测方法的建立

针对李属坏死环斑病毒（PNRSV）外壳蛋白（CP）基因保守序列,设计了1套特异性识别CP基因中6个不同区段的环介导等温扩增（LAMP）引物。通过对反应条件的优化,建立了适用于PNRSV的RT-LAMP检测技术,对优化后的方法进行特异性、灵敏度评价。结果显示,此方法能够特异性的检测出PNRSV,对马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y病毒（PVY）、黄瓜花叶病毒（CMV）、蚕豆萎蔫病毒（BBWV）的检测均为阴性,灵敏度高于RT-PCR 10倍。     

建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒RdRp基因hpRNAi表达载体的构建

为了构建建兰花叶病毒(CymMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)复制酶RdRp基因hpRNAi的表达载体,根据GenBank中CymMV和ORSV RdRp基因的保守序列设计引物,以蝴蝶兰温室生产中两种病毒的分离物为模板,成功扩增了两种病毒的RdRp基因片段。扩增的这两种病毒的RdRp基因与数据库中病毒序列同源性均在98%以上。利用融合PCR将两种病毒片段串联在一起,然后通过Gateway技术的BP反应和LR反应将融合产物插入到基因沉默表达载体pHellsgate12中,成功构建了可同时抗建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的发夹结构RNA干扰载体,为兰花多抗基因工程育种奠定了基础。     

环介导等温扩增技术检测建兰花叶病毒

为了建立检测建兰花叶病毒的快速实用分子生物学技术,该研究借助新兴的环介导等温扩增技术,建立了一种灵敏、特异、快速的分子生物学检测方法——体外等温扩增检测方法。设计了4条针对目的基因的6个位点的特异性引物,建立了一套从核酸抽提到LAMP检测快速检测方法。所建立的检测方法比RT-PCR更灵敏;且具有特异性,操作简单,不需要复杂的仪器,肉眼可直接观察检测结果。适合基层和现场检测。     

齿兰环斑病毒RT-qPCR检测方法的建立

【目的】针对齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus, ORSV)建立快速、有效检测方法,对于保障兰花规模化生产有重要意义。【方法】以齿兰环斑病毒为材料,根据NCBI上已登录的齿兰环斑病毒外壳蛋白(coat protein, cp)基因序列分析其序列保守区,使用Primer Premier 5.0设计反转录荧光定量PCR引物及TaqMan荧光探针,建立检测齿兰环斑病毒的一步法RT-qPCR。构建齿兰环斑病毒cp基因克隆质粒,并以该质粒作为标准品进行荧光定量PCR标准曲线测定;以齿兰环斑病毒、建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)的病毒RNA为模板进行一步法RT-qPCR特异性检测;以10倍倍比稀释的cp基因质粒为模板进行灵敏性检测;用该法对大田18个兰花样品进行齿兰环斑病毒感染情况监测。【结果】齿兰环斑病毒一步法RT-qPCR检测法仅检出齿兰环斑病毒阳性模板,其余模板检测结果为阴性,说明检测方法具有特异性;该方法能够检测到的齿兰环斑病毒cp基因最低拷贝数...     

甘蔗线条花叶病毒 RT-LAMP 检测方法的建立及应用

【目的】建立甘蔗线条花叶病毒（Sugarcane streak mosaic virus,SCSMV）的 RT-LAMP 检测方法,为 SCSMV 的检测提供技术支持。【方法】根据甘蔗线条花叶病毒外壳蛋白基因的保守序列设计特异引物,优化 RT-LAMP 的反应条件,对比分析 RT-LAMP 的检测灵敏度和特异性;并在 RT-LAMP 反应产物中加入 SYBR GREEN I 进行可视化检测,方便快速判定结果。【结果】成功建立了一种用于检测 SCSMV 的 RT-LAMP 方法,可在 60 ~ 63 ℃下 60 min 完成对 SCSMV 的检测,且具有较高的灵敏度,比传统 RT-PCR 高 100 倍,最低检测RNA 浓度为 167.9×10-5 ng。此外,该方法具有较高的特异性,可特异检测 SCSMV。【结论】建立了一种灵敏、简便、快速的 SCSMV RT-LAMP 检测方法并用于田间甘蔗样品的检测。     

兰花两种主要病毒双重RT-PCR检测方法的建立

根据建兰花叶病毒(Cymbidiummosaic virus,CymMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglossumringspot virus,ORSV)这两种主要兰花病毒的保守序列设计特异性引物,在CymMV和ORSV单一RT-PCR优化体系的基础上,建立了同时检测CymMV和ORSV的双重RT-PCR检测方法。此方法可特异性地从感染CymMV和ORSV的样品中扩增出2条目的带,即CymMV(781 bp)和ORSV(588 bp)。扩增产物测序表明,CymMV扩增产物与GenBank中登陆的分离物核苷酸同源性为84%~97%,ORSV扩增产物与GenBank中其它分离物的核苷酸序列同源性为98%~99%。运用该方法对随机抽取的田间样品及组培苗样品进行检测,都得到了特异性扩增条带,其灵敏度达到了10-5。     

RT-PCR检测齿兰环斑病毒技术的建立

根据已报道的齿兰环斑病毒(ORSV)外壳蛋白(CP)基因序列,进行同源性比较,设计了一对各为20bp的引物.通过优化试验条件,建立了稳定的RT-PCR检测ORSV体系,其检测灵敏度可达0.01ng·mL-1.将此方法与ELISA进行比较,结果表明,RT-PCR检测灵敏度比ELISA高1000倍.应用这两种方法同时检测了138瓶兰花组培苗样品,其中RT-PCR检测出32瓶兰花组培苗感染病毒,而ELISA只能检测其中的18瓶.     

建兰花叶病毒的分子生物学检测

根据建兰花叶病毒外壳蛋白基因的保守序列设计2对引物,采用IC-RT-PCR方法和质粒梯度稀释的方法,研究建兰花叶病毒的分子检测方法和灵敏度.结果表明,从21个建兰花叶病毒的病株样品中均能扩增出与预期大小相同的DNA条带,序列测定和序列同源性分析表明所测定的序列均为CyMV外壳蛋白基因的部分序列,序列同源性均达到89%以上;灵敏度检测结果表明:可检测的最低病毒含量为2.72×10-7 μg/mL.     

双重一步法RT-PCR检测2种主要兰花病毒

[目的]研究建兰花叶病毒（CymMV）和齿兰环斑病毒（ORSV）双重一步法RT—PCR检测方法,为病毒的早期快速诊断提供技术支持。[方法]根据2种病毒的外壳蛋白基因的保守序列分别设计两对特异性引物,并进行双重与单一RT—PCR对比试验。[结果]结果在健康蜘蛛兰被人工接种病毒后第10天和第21天用一步法RT-PCR方法分别获得CymMV和ORSV与预期相符的约764和946bp扩增产物务带;且双重一步法RT—PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后,出现两务与单一RT—PCR产物相对应的清晰务带,获得较理想的检出效果;扩增产物的核酸序列经BLAST分析,同源性均在85％以上,证实了检测结果的准确性。[结论]该方法具有更加灵敏、特异、快速和简便的特点,适合于两种主要兰花病毒的同时快速检测。     

应用复合RT-PCR同时检测烟草环斑病毒和番茄环斑病毒

将烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus)和番茄环斑病毒(Tom ato ringspot virus)的CP基因及RNA2基因序列引物,合成特异性RT-PCR检测引物,对烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的感病植物组织进行了PCR扩增反应,结果显示,感染了烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的植物组织的PCR产物均出现600 bp和470 bp特异性扩增条带,而其他病毒均未出现扩增条带,证明这两对引物具有烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的鉴定特异性。将提取的烟草环斑病毒和番茄环斑病毒总RNA做梯度稀释,测定该检测体系的敏感度,结果显示,此体系最低可检出烟草环斑病毒和番茄环斑病毒提取的RNA模板浓度为234 pg/μl和264 pg/μl。表明,复合RT-PCR是一种可同时检测烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的快速检测方法。     

侵染兰花引起坏死斑症状的病毒种类鉴定

 在昆明市文心兰栽培基地发现了具有病毒病症状的感病文心兰和大花惠兰植株。感病文心兰和大花惠兰样品在电镜下可观察到长约460～500nm的线状病毒粒体和长约300nm的杆状病毒粒体，它们分别与已报道的建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒粒体大小一致。利用ELISA技术在感病文心兰和大花惠兰样品可以检测到建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒。利用建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的特异性引物，运用RT-PCR方法可以扩增到与引物设计预期大小一致的核酸条带。由此证明，云南文心兰和大花惠兰病毒病由建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒中的一种或两种侵染引起。     

番茄环斑病毒的普通RT-PCR和巢式PCR检测方法

根据番茄环斑病毒（ToRSV）外壳蛋白（CP）基因的保守序列设计了2对引物（引物对Ⅰ和Ⅱ）,利用RT—PCR分别扩增出预期大小的800bp和580bp的条带,其中引物对Ⅱ扩增效率较高、特异性较好。以引物对Ⅰ和Ⅱ进行2轮PCR扩增,建立了巢式PCR检测方法,其灵敏度比普通RT-PCR提高100～200倍。序列测定和分析表明所测定的序列为ToRSVCP基因的部分序列,在系统关系树上与ToRSV的其他分离物形成一簇,亲缘关系很近。     

建兰花叶病毒检测标准方法的建立

经过2004￣2005两年对上海口岸进境和进境后种植的260个兰花品种上建兰花叶病毒(CyMV)检测方法的研究,分别建立了检测和鉴定兰花上建兰花叶病毒的DAS-ELISA、电镜观察、鉴别寄主反应、RT-PCR和IC-RT-PCR的方法。     

热带兰花2种病毒的ELISA检测

采用三抗夹心酶联免疫吸附法（TAS-ELISA）和双抗夹心酶联免疫吸附法（DAS-ELISA）检测了海南主要兰花种植基地的疑似病毒感染的兰花叶片。结果表明,海南兰花病原病毒主要为建兰花叶病毒（Cym-bidium mosaic virus,CymMV）、齿兰环斑病毒（Odontoglossum ring-spot vi...