线虫fat-1基因的原核表达及其抗体的制备

通过RT-RCR得到线虫f a t-1基因全长,将其N端亲水区克隆至原核表达载体pGEX-4T-2中,构建重组质粒pGEX-f a t1-N,将其转化大肠杆菌,并进行诱导表达。对表达产物G ST-f a t1-N融合蛋白进行纯化,制备其抗体,并对抗体效价进行了检测。结果表明,线虫f a t-1基因能在大肠杆菌中表达,制备的抗体能识别在原核表达系统内表达的G ST-f a t1-N融合蛋白,且效价很高,达到1∶107。     

绿僵菌黏附素MAD1体外表达及诱导花生响应的作用

[目的]绿僵菌具有昆虫致病性和植物共生性,其黏附素MAD1在绿僵菌侵染寄主昆虫过程中起重要作用.通过体外真核表达MAD1蛋白,明确MAD1在绿僵菌与植物共生中发挥的作用.[方法]以绿僵菌转录组的Unigenes作为参考序列,在GenBank中进行同源性检索比对,设计引物,以金龟子绿僵菌(Metarhizium anis...     

金龟子绿僵菌MA4菌株蛋白酶Pr2基因的克隆及其表达分析

克隆了金龟子绿僵菌MA4菌株蛋白酶Pr2基因,编码序列长度为771bp,推导蛋白由256个氨基酸组成,是一疏水性蛋白。与菌株ME1得到Pr2编码序列(GeneBank/X78875,AJ242736)相比,MA4比菌株ME1(X78875)多6个核苷酸,同源性为97.4%,编码的氨基酸同源性为95.3%;MA4与菌株ME1(AJ242736)的核苷酸数目相同,同源性达到97.8%,编码的氨基酸同源性达98.1%。MA4菌株对东亚飞蝗4龄幼虫的LT50为4.83d,RT-PCR检测Pr2基因在东亚飞蝗体内的表达:接种第三天时扩增预期771bp条带。     

泉古菌Sulfolobus islandicus PCNA1的原核表达及其多克隆抗体的制备

泉古菌Sulfolobus islandicus中PCNA有3个同源类似蛋白,本研究选取PCNA1作为研究对象,为获得可溶性表达的PCNA1蛋白,制备多克隆抗体,深入了解PCNA1基因的功能,将PCNA1基因片段克隆到组氨酸标签融合的表达载体pET30a中,利用IPTG诱导,金属螯合亲和层析进行纯化分析表明,融合蛋白大部分可溶。紫外分光光度法测定纯化蛋白的纯度可达90%以上,浓度约为2 mg/mL。免疫家兔制备多克隆抗体,ELISA检测抗血清效价可达1∶10 000以上,Western印迹检测证明抗体特异性良好。     

贵州绿僵菌和戴氏绿僵菌分类地位的确证

为正确描述贵州绿僵菌和戴氏绿僵菌的分类地位提供更充分的形态学和分子证据,通过观察贵州绿僵菌和戴氏绿僵菌的形态特征并扩增其转录间隔区序列(ITS)和翻译延伸因子(TEF)基因部分序列,用最大简约法构建了系统发育树。结果表明:戴氏绿僵菌应归入贵州绿僵菌中。     

绿僵菌的研究进展

综述了近年来国内外对绿僵菌属的分类、绿僵菌入侵寄主过程中的相关基因的研究、剂型开发等方面的概况。     

小鼠Rig-Ⅰ蛋白的原核表达、纯化及其抗体制备

【目的】进一步研究小鼠维甲酸诱导基因Ⅰ(Rig-Ⅰ)蛋白的细胞信号传导、结构与功能。【方法】利用已经构建好的逆转录病毒载体MigRI-Rig-Ⅰ,用PCR方法扩增出小鼠Rig-Ⅰ基因氨基端100 bp长度的片断(Rig-Ⅰ-N),将此片段定向克隆到原核表达载体pGEX-4T2中,构建pGEX-4T2-Rig-Ⅰ-N,再将Rig-Ⅰ基因剩余部分克隆到已构建有Rig-Ⅰ-N部分片段的pGEX-4T2-Rig-Ⅰ-N中,构建融合表达载体pGEX-4T2-Rig-Ⅰ,将其转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,对表达产物GST-Rig-Ⅰ融合蛋白进行纯化,制备抗体,并对抗体效价进行ELISA检测及抗体特异性的Western blot分析。【结果】重组蛋白GST-Rig-Ⅰ能在大肠杆菌中表达,表达的融合蛋白GST-Rig-Ⅰ纯化和洗脱后分子质量为130 ku,纯度>90%,制备的抗体效价达到1∶625 000,并且能够识别在原核表达系统以及真核细胞内表达的小鼠Rig-Ⅰ蛋白。【结论】建立的表达系统能够表达重组蛋白GST-Rig-Ⅰ,制备的抗体具有良好的免疫特异性。     

金龟子绿僵菌致病的分子机理研究进展

金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)是一类重要的昆虫病原真菌,在害虫生物防治中起着重要作用.与化学农药相比,昆虫病原真菌开发的真菌杀虫剂作用时间持久、无环境污染、对非靶标生物安全,但存在致死时间长,杀虫效率低,防效不稳定等缺点,严重阻碍了真菌杀虫剂的广泛应用,为解决这一问题,从分子水平揭示昆虫病原真菌的致病机理尤为重要.从分子水平阐述了金龟子绿僵菌对寄主的识别与粘附、绿僵菌侵染寄主过程中附着胞的形成、绿僵菌对寄主体壁的穿透机制和绿僵菌进入寄主血淋巴后的适应机制.     

金龟子绿僵菌对小菜蛾的室内毒力测定

[目的]采用浸叶法和浸虫法测定金龟子绿僵菌在不同浓度下对小菜蛾的室内毒力。[方法]以小菜蛾3龄幼虫为供试虫源,用浸叶法和浸虫法研究金龟子绿僵菌在2种侵染途径下对小菜蛾的室内毒力,并对感染反应的时间与剂量效应作综合分析。[结果]在2种方法处理下。10^5～10^9个孢子／ml浓度的金龟子绿僵菌孢悬液对小菜蛾均有杀伤作用,同一浓度下浸虫法优于浸叶法。在浸叶法中,金龟子绿僵菌对小菜蛾第3天的LD。对数剂量为15．48,第8天的加。对数剂量为11．93;在浸虫法中,金龟子绿僵菌对小菜蛾第3天的凹。对数剂量为9．25,第8天的蛾．对数剂量为8．73。10^9个孢子／ml金龟子绿僵菌处理的小菜蛾在第8天校正死亡率达到92．86％,其￡％为1．95d。[结论]该研究为田间应用金龟子绿僵菌防治小菜蛾提供理论依据。     

绿僵菌毒素的提取

用金龟子绿僵菌的液物培养体,提取绿僵菌素。每升培养液得绿僵菌素0.7mg。用绿僵菌素注射青杨天牛幼虫,每克虫体用量10.6μg,3d内死亡率达100％。     

金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae HN1)几丁质酶与谷胱甘肽S-转移酶GST在大肠杆菌中的高效融合表达

使用RT-PCR方法,从高毒力金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae HN1中,克隆得到一个全长为1275bp的几丁质酶基因,经Blast分析此基因序列与M．anisopliae E6的chil基因（AF02749）同源率为96％。将此基因克隆到pGEX-6p-1载体上,使之与载体上一个约26kD大小的谷胱甘肽S-转移酶（GST）相连,构建pGEX-chi融合表达载体,转化到大肠杆菌（Escherichia coli）BL21中,经SDS-PAGE结果分析显示：表达出的融合蛋白大小为68kD,此目的蛋白占表达总量的64．5％。经破碎处理后可检测到几丁质酶活性。     

液固两相法培养金龟子绿僵菌的研究

通过对绿僵菌液固两相发酵技术的研究,优化控制发酵过程,筛选出玉米粉(2份)+麦麸(2份)+谷壳(2份)为固体发酵培养基的优化配方,液体种子发酵周期72 h,初始接种量控制在25%为宜。保持25-28℃的培养温度和83%-94%的相对环境湿度,同时选择合适的覆盖物(可降低杂菌的污染)。固态发酵周期11 d,菌粉干燥温度控制在35℃,时间24 h,可缩短生产周期。     

蓝光促进绿僵菌产孢和产孢调节基因fluG表达

【目的】明确蓝光照射对绿僵菌产孢的促进作用及与产孢调节基因fluG表达量的关系,为绿僵菌发酵生产提供光照促进产孢的理论依据和技术参数。【方法】以绿僵菌高效杀虫菌株M202为试材,平板接种培养,通过显微观察每隔12 h的菌体发育状态,确定菌株发育进程产孢前期、初始期、旺盛期、平稳期的对应时段。以蓝光6 804-54 432 J?m^-2的8个能量梯度,照射处理在黑暗中培养至不同发育期即24、48、72 h的菌体,继续培养到产孢稳定期后,采用打孔法取样,以显微计数法检测计算产孢量,评估菌体发育阶段对蓝光的敏感性以及蓝光照射能量对产孢量的影响。克隆fluG,建立fluG real-time PCR反应体系;以蓝光6 804-54 432 J?m^-2的8个能量梯度,照射处理发育至48 h即处于产孢前将进入产孢期的菌丝体,照射处理后立即取菌丝,液氮冷冻,提取RNA并反转录成cDNA,通过real-time PCR检测fluG表达量,评估蓝光照射对fluG表达量的影响。【结果】绿僵菌M202菌株发育24 h前为萌发期,24-72 h为菌丝快速生长期,其中48 h还处于产孢前期,60 h已进入产孢初期,72-96 h为产孢盛期,96-120 h为产孢末期,120 h后为孢子成熟期,7-10 d后产量达到稳定。蓝光不同能量照射24 h菌龄即初期菌丝体,其产孢量与无光照处理的对照无显著差异,照射48 h菌龄即菌丝快速生长的产孢前期,其产孢量显著提高,最适照射能量为20 412-40 824 J?m^-2,其中34 020 J?m^-2使产孢量最高达无光照处理对照的1.50倍,72 h菌龄即产孢结构形成、产孢量快速增长期对蓝光最为敏感,低至6 804 J?m^-2的照射能量即可显著提高产孢量,且宽泛的各剂量均有效。对于fluG的表达,在试验照射剂量范围内,48 h菌龄接受蓝光照射后,fluG表达量显著提高,表达量随照射剂量呈先上升后下降的趋势,在20 412 J?m^-2以下较低能量时,fluG表达量与照射剂量成正相关,当照射时间为2.25 h时,表达量达到最高,为无光照处理对照的2.41倍,而在20 412 J?m^-2以上较高能量时,二者呈现负相关,随着蓝光照射时间的增加,基因表达量呈下降趋势;灰色关联度分析显示,当关联因子为0.5时,产孢量与fluG表达量的关联度r值为0.74。【结论】蓝光照射能够促进绿僵菌产孢及fluG表达,不同发育阶段的菌体对蓝光感应有显著差异,在48-72 h菌龄时照射34 020 J?m^-2能量可获得最高产孢量,产孢与fluG之间有较高关联度说明fluG参与绿僵菌产孢的调控。     

绿僵菌毒素的研究进展

绿僵菌毒素是绿僵菌产生的具有杀虫活性的次生代谢物质,在农业害虫防治方面具有广阔的应用前景。根据其分子量和结构分为低分子量毒素和高分子量蛋白毒素两大类,对其分子结构、种类、提取方法、生物活性、产生条件等进行了综述。     

金龟子绿僵菌的液固双相发酵研究

金龟子绿僵菌是重要的害虫致病真菌,采用液固双相发酵方法对MA4-37菌株进行发酵,研究液体培养基、固体培养基及其厚度、浅盘固体发酵、袋装固体发酵对金龟子绿僵菌生长及产孢量的影响,优化控制发酵过程。结果表明,液体发酵较适合的培养基为发酵液B(大豆1%、蔗糖1%、NaCl0.5%、MnSO40.5%,用KH2PO4-K2HPO4缓冲液调节pH值为6.0～7.0),采用该培养基时液生分生孢子产量和菌丝生长量均最高,分别达到4.3×109个/L、5.99g/L。固体发酵时,浅盘发酵方法优于袋装发酵,其中采用配方F的固体培养基(碎米600g、大米300g、H2O 50%、KH2PO4-K2HPO4缓冲液0.05%、蔗糖0.5%),厚度在1.3cm时,浅盘培养7d的产粉量可达16.1mg/g。     

金龟子绿僵菌对椰心叶甲的致病力

采用喷菌法接菌,测定5株金龟子绿僵菌对不同龄期椰心叶甲的致病力。结果表明:浓度为(1±0.5)×10~7孢子·mL~(-1)的孢子悬液接菌10 d后,各绿僵菌菌株对该虫不同发育阶段均有一定致病力。其中,以Ma1775菌株对椰心叶甲致病力最强,成虫校正死亡率和僵虫率分别为(67.96±3.66)%和(60.59±1.31)%,LT_(50)为(7.11±0.52)d;5龄幼虫校正死亡率和僵虫率分别为(78.53±2.73)%和(73.55±3.22)%,LT_(50)为(5.77±0.38)d;4龄幼虫校正死亡率和僵虫率分别为(82.59±2.48)%和(77.86±3.44)%,LT_(50)为(5.80±0.14)d;2~3龄幼虫校正死亡率和僵虫率分别为(73.46±4.60)%和(69.50±3.87)%,LT_(50)为(6.49±0.12)d。Ma1775菌株对该虫各发育阶段6 d的LC50分别为:3.52×10~8、7.13×10~7、2.48×10~7、7.69×10~7孢子·mL~(-1)。时间-剂量-死亡率(time-dose-mortality,TDM)模型分析结果表明椰心叶甲各发育阶段幼虫死亡高峰期均为3~7 d。因此,Ma1775菌株在椰心叶甲生物防治中有较大的应用潜力。     

水稻乙醇酸氧化酶基因OsGLO1的原核表达及多克隆抗体制备

乙醇酸氧化酶是光呼吸代谢的关键酶.以水稻Oryza sativa叶片cDNA为模板,利用RT-PCR扩增水稻乙醇酸氧化酶基因(OsGLO1),并构建了该基因的原核表达载体pET23d-OsGLO1,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达融合蛋白.以纯化的OsGLO1融合蛋白为抗原免疫新西兰白兔,制备兔抗OsGLO1的多克隆抗体.Western-blot分析表明,制备的多克隆抗体能有效地检测水稻、菜心Brassica campestris、拟南芥Arabidopsis thaliana和菠菜Spinacia oleracea中乙醇酸氧化酶的表达,为进一步深入研究乙醇酸氧化酶在调控光呼吸及抗逆性等方面的作用奠定了基础.     

橡胶延长因子基因的原核表达及其多克隆抗体的制备(英文)

[Objective] The aim of this study was to prepare the recombination protein of rubber elongation factor and its polyclonal antibodies.[Method] The encoding gene of rubber elongation factor(REF)was amplified by RT-PCR,and cloned into the prokaryotic expression vector pDEST17 to transform into Escherichia coil BI2I-AI.The recombinant protein induced by L-Arabinose was purified by the affinity chromatography.As the immunogen,the recombination protein was used to immunize mice for preparing polyclonal antibodies,while ELISA and Western blot hybridization were used to detect the titers and specificity.[Result] The purified recombination protein of REF with high expression was used to immunize house mice for preparing polyclonal antibodies with high titer and specificity.The western blot hybridization showed that the antibody could recognize the natural REF from latex.[Conclusion] The recombination protein of REF was successfully obtained and the mouse anti REF antibody with high titer and specificity was prepared,which lays a basis for further studies on biological functions of rubber elongation factor and other membrane proteins in rubber particles.     

Prokaryotic Expression of Rubber Elongation Factor Gene and Preparation of Its Polyclonal Antibody

[Objective] The aim of this study was to prepare the recombination protein of rubber elongation factor and its polyclonal antibodies.[Method] The encoding gene of rubber elongation factor(REF)was amplified by RT-PCR,and cloned into the prokaryotic expression vector pDEST17 to transform into Escherichia coil BI2I-AI.The recombinant protein induced by L-Arabinose was purified by the affinity chromatography.As the immunogen,the recombination protein was used to immunize mice for preparing polyclonal antibodies,while ELISA and Western blot hybridization were used to detect the titers and specificity.[Result] The purified recombination protein of REF with high expression was used to immunize house mice for preparing polyclonal antibodies with high titer and specificity.The western blot hybridization showed that the antibody could recognize the natural REF from latex.[Conclusion] The recombination protein of REF was successfully obtained and the mouse anti REF antibody with high titer and specificity was prepared,which lays a basis for further studies on biological functions of rubber elongation factor and other membrane proteins in rubber particles.