应用荧光RT-PGR检测亚欧型口蹄疫病毒

根据口蹄疫病毒基因组的5’非翻译区序列比较保守的特点,采用软件设计亚欧型（A、O、C及Asia-1型）FMDV通用的引物和探针,经对反应条件和反应体系进行优化,建立了亚欧型FMDV的实时荧光RT—PCR检测方法。研究表明,该方法检测阳性质粒模板的线性范围为1．9×10^7-1．9×10拷贝,最低可检测19个拷贝。通过对FMDV各血清型（A、O、C、Asia-1及SAT-1,2,3型）的检测,证实该方法对亚欧型FMDV具有良好的特异性,能有效区分亚欧型和南非型FMDV感染。本研究为亚欧型口蹄疫的快速诊断和流行病学调查提供了新的方法。     

A型塞尼卡病毒与O型、亚洲I型、A型口蹄疫病毒多重RT-PCR检测方法的建立

为建立鉴别A型塞尼卡病毒(SVA)与O型、亚洲I型、A型口蹄疫病毒(FMDV)的快速检测方法,本研究分别设计4对特异性引物,用于扩增SVA 3D基因(157 bp)、O型FMDV VP1基因(240 bp)、亚洲I型FMDV VP1基因(460 bp)、A型FMDV VP1基因(320 bp)。经优化引物浓度、退火温度等反应条件,初步建立了同时检测SVA与O型、亚洲I型、A型FMDV的多重RT-PCR方法。利用该方法同时检测SVA及O型、亚洲I型、A型FMDV、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型(PCV2)、PCV3等主要猪源病毒,结果显示该方法仅对SVA及O型、亚洲I型、A型FMDV检测为阳性,其他均为阴性,特异性较强;SVA、O型、亚洲I型、A型FMDV重组质粒标准品10倍倍比稀释后利用本研究建立的多重RT-PCR方法检测,结果显示同一反应体系中,4种重组质粒标准品的检出下限均为2.5×10~2拷贝/μL,敏感性较高;批内、批间重复性试验结果一致,该方法重复性较好。利用本实验建立的方法对2019年采集自广西省的30份临床疑似样品进行检测,结果显示,SVA、O型FMDV的阳性检出率分别为16.67%和63.33%;未检出亚洲I型及A型FMDV;同时采用国家标准《口蹄疫诊断技术》(GB/T18935-2003)中RT-PCR方法以及文献报道的SVA套式RTPCR方法对FMDV、SVA检测,结果与本实验建立的多重RT-PCR方法检测结果的符合率为100%。本研究首次建立的多重RT-PCR检测方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点,为鉴别检测SVA与O型、亚洲I型、A型FMDV提供了有效的技术方法。     

A型塞尼卡病毒与O型、A型、亚洲I型口蹄疫病毒多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立鉴别检测A型塞尼卡病毒(SVA)与O型、A型、亚洲I型口蹄疫病毒(FMDV)的方法,针对SVA 3D基因与O型、A型、亚洲I型FMDV VP1基因,分别设计特异性引物和TaqMan探针,经优化反应条件,建立了同时检测SVA与O型、A型、亚洲I型FMDV的TaqMan荧光定量RT-PCR方法.所建立的方法能特异性扩...     

O型、A型及Asia1型3个型口蹄疫病毒通用套式RT-PCR检测方法的建立

为了建立针对流行于我国及周边国家主要口蹄疫病毒(FMDV)血清型的检测方法,本实验设计2对特异性引物,通过对反应条件的优化,建立了能够同时扩增O型、A型及Asia1型FMDV VP1全基因的套式RT-PCR (RT-nPCR)方法.该方法能特异性检测O型、A型和Asia1型FMDV,对其它相关动物病毒的检测结果均为阴性;比FMDV多重RT-PCR商品试剂盒敏感约1 000倍.利用该方法对10份FMDV样品进行扩增检测,结合扩增产物的克隆测序技术,对所检样品进行了准确定型.实验结果表明,该方法通用型强,可用于3个血清型FMDV的检测和分子流行病学调查.     

O型、A型及Asia-1型口蹄疫病毒多重RT-PCR检测方法的建立

根据口蹄疫病毒VP1基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计4条特异性引物,通过对退火温度等反应条件进行优化,建立能够同时扩增出O型、A型、Asia-1型口蹄疫病毒的多重RT-PCR检测方法。结果表明,建立的方法最低可以检测出约含1 pg/μL的病毒样品;该方法对猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒等其他相关病毒的检测结果均为阴性,特异性良好。建立的方法能够对口蹄疫O型、A型、Asia-1型病毒准确定型,可广泛用于口蹄疫病毒3个血清型的快速检测和分子流行病学调查。     

口蹄疫病毒通用型和A型二重实时荧光RT-PCR检测方法的建立

为建立一种快速、敏感、特异的口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)分型鉴别诊断实时荧光RT-PCR(Fluorescence quantitative,FQ-PCR)检测方法,根据O、A、AsiaⅠ三种血清型FMDV保守基因序列,设计能够检测到FMDV的特异性通用检测引物和A型检测引物,以及不同荧光素标记的MGB探针。通过对PCR反应体系和反应条件的优化筛选,建立了FMDV通用型和A型二重实时荧光RT-PCR检测方法,并对该方法进行了特异性、敏感性、重复性试验;利用所建立的方法,对123份疑似FMDV感染的临床样品进行了检测。结果显示,建立的FMDV通用型、A型二重实时荧光RT-PCR检测方法在10~1～10~7拷贝/μL模板范围内有很好的线性关系;对pGEM-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-A重组质粒出现阳性扩增信号,但对正常细胞培养物对照和其他7种病原对照未扩增出特异性曲线;自123份疑似FMDV感染样品中,检出10份FMDV-T阳性,6份FMDV-T/FMDV-A双阳性并且与基因测序结果一致。结果表明,本研究建立的FMDV通用型、A型二重实时荧光RT-PCR检测方法重复性好、敏感性高、特异性强,最低检测模板浓度为10拷贝/μL,可用于FMDV的快速分型检测,为FMDV的早期检测及临床诊断提供了新方法。     

抗A型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及抗原捕获ELISA检测方法的建立

为建立A型口蹄疫病毒(FMDV)病原学诊断方法,本研究应用纯化的A型FMDV免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选获得一株稳定分泌单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株5F7.经IFA特异性鉴定,5F7为一株血清型特异性MAb.亚类为IgG1/k.间接ELISA检测杂交瘤细胞上清和腹水抗体效价分别为1:12 800和1:105.硫氰酸盐洗脱法测定其相对亲和力常数为1.5 mol/L.应用该A型特异性MAb及实验室已制备的MAb 3D9初步建立了检测A型FMDV的抗原捕获ELISA方法.该方法可以检出2.0 ng纯化FMDV和1.0×104 TCID50病毒,与O型、Asial型FMDV及牛肠道病毒、牛呼肠孤病毒、牛传染性鼻气管炎病毒等均无交叉反应,组内及组间重复性试验显示变异系数小于8％.本研究建立的抗原捕获ELISA方法为A型FMDV抗原检测提供了一种实用有效的技术手段.     

抗Asia1型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及抗原捕获ELISA检测口蹄疫病毒的研究

本研究用纯化的Asial型口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)免疫BALB/c小鼠,按常规单克隆抗体技术方法,经筛选获得6株能稳定分泌抗Asial型FMDV单抗的杂交瘤细胞株。以牛抗口蹄疫病毒IgG为捕获抗体,选择一株单抗(184)用辣根过氧化物酶标记(HRP-184)作为检测抗体,建立了检测Asial型FMDV的抗原捕获ELISA方法。该方法可检出0.5859μg纯化Asial型FMDV抗原和2.5×10~3TCID_(50)病毒,对O型FMDV、牛结核病、牛肺疫、牛流热、赤羽病、牛传染性鼻炎等病毒进行检测,均为阴性,无交叉反应发生。本研究建立的FMDV抗原捕获ELISA方法,具有敏感性高、特异性强和重复性好的特点,可用于Asial型FMDV的特异性检测。     

共表达O型FMDV衣壳蛋白和绿色荧光蛋白重组腺病毒的构建

为构建表达O型口蹄疫病毒(FMDV)的P12A3C基因及GFP基因的重组腺病毒rAdV-P12aEGFP2a3C,本研究以FMDV的2A基因序列为Linker,将报告基因EGFP插入FMDV的P12A与3C之间。重组腺病毒感染HEK-293细胞后可以观察到绿色荧光,表明EGFP蛋白获得表达。应用FMDV的VP2单克隆抗体4B2对重组病毒感染细胞进行western blot检测,反应条带与FMDV衣壳蛋白VP0和VP3的分子量大小相符,表明FMDV的完整衣壳蛋白和3C蛋白酶也均获得表达,而且EGFP的插入并未影响P1蛋白的表达和3C蛋白酶对P1的正确切割。重组腺病毒的生长特性分析表明,EGFP的插入也未影响该重组腺病毒的增殖特性。上述研究结果显示,表达FMDV衣壳蛋白P12A3C的重组腺病毒可以作为载体,以2A蛋白作为Linker表达一个小分子蛋白,为改进以腺病毒为载体的口蹄疫基因工程疫苗提供了新思路。     

临沧市边境地区牛和猪口蹄疫抗体检测

2018年在临沧地区沧源、镇康、耿马3个边境县采集入境牛血清440份、本地猪血清300份,应用O、A、Asia-1型口蹄疫cELISA抗体检测试剂盒和口蹄疫非结构蛋白抗体单抗阻断ELISA试剂盒进行检测。检测结果显示,规模场牛口蹄疫O、A、Asia-1型及非结构蛋白抗体阳性率分别为47.43%、83.43%、31.43%、45.14%,散养户分别为43.40%、36.60%、18.11%、31.70%,规模场疫苗免疫效果优势明显,但口蹄疫带毒风险较大。猪血清口蹄疫O、A、Asia-1型抗体阳性率分别为3.00%~24.00%、0~15.00%、0~15.00%,阳性率偏低。建议提高临沧市边境地区牛、猪口蹄疫疫苗免疫强度和抗体监测力度。     

O型和Asia1型口蹄疫病毒感染RT-PCR鉴别诊断方法的建立

根据GenBank中O型和Asia1型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)的vp3、vp1和2A基因序列,并与其它血清型FMDV的对应基因序列进行比较,设计用于扩增O型和Asia1型FMDV vp1基因的特异性引物,建立O型和Asia1型FMDV RT-PCR鉴别诊断方法。本方法首先用通用型引物进行RT-PCR,确定是否为FMDV感染,然后用特异性引物鉴别O型或Asia1型FMDV的感染。用vp1基因序列分析进行符合性试验,验证了该方法所具有的特异性和敏感性。本方法可用于O型和Asia1型FMD的快速诊断及流行病学调查。     

塞尼卡病毒与口蹄疫病毒双重RT-PCR鉴别检测方法的建立

2014~2015年,美国、巴西等国爆发了一种症状类似于口蹄疫的水泡性疾病,病原被确定为塞尼卡病毒A(Senecavirus A,SVA)。为了鉴别和诊断塞尼卡病毒A和口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV),本研究针对塞尼卡病毒的VP1基因和口蹄疫的5’UTR基因,合成特异性引物,优化了反应体系和扩增条件,建立了一种可同时检测塞尼卡病毒A和口蹄疫病毒的双重RT-PCR方法。特异性和敏感性试验结果表明,建立的双重RT-PCR检测方法特异性好,敏感性强,对塞尼卡病毒A和口蹄疫病毒最低检出量分别为104 copies/μL、103 copies/μL。本研究建立的方法对临床快速鉴别塞尼卡病毒A和口蹄疫病毒感染具有重要意义。     

Evaluation of a novel proximity ligation assay for the sensitive and rapid detection of foot-and-mouth disease virus

A novel proximity ligation assay (PLA) using a pan-serotype reactive monoclonal antibody was developed and evaluated for the detection of foot-and-mouth disease virus (FMDV) in clinical samples collected from field cases of disease. The FMDV-specific PLA was found to be 100 times more sensitive for virus detection than the commonly used antigen capture-ELISA (AgELISA). As few as five TCID50 were detected in individual assays, which was comparable with the analytical sensitivity of real-time RT-PCR. Although this assay was capable of detecting diverse isolates from all seven FMDV serotypes, the diagnostic sensitivity of the PLA assay was lower than real-time RT-PCR mainly due to a failure to detect some SAT 1, SAT 2 and SAT 3 FMDV strains. In conclusion, this new PLA format has high analytical sensitivity for the detection of FMDV in clinical samples and may prove valuable as a rapid and simple tool for use in FMD diagnosis.     

口蹄疫病毒抗原胶体金试纸条的研究

利用单克隆抗体技术制备抗口蹄疫病毒的单克隆抗体,特异性试验表明其只与O、A、Asia 1型3种血清型FMDV抗原结合。进而采用胶体金标记技术,以胶体金标记的抗口蹄疫病毒单克隆抗体、多克隆血清抗体和葡萄球菌A蛋白为主要材料,研制口蹄疫快速检测试纸条。该试纸条检测O、A、Asia 1型3种血清型灭活口蹄疫病毒均为阳性,检测水疱性口炎病毒、猪水疱病病毒、蓝舌病病毒、猪蓝耳病病毒4种灭活抗原及小反刍兽疫病毒疫苗株均为阴性,试验结果与口蹄疫实时荧光定量RT-PCR方法的完全一致,表明其具有良好的特异性。敏感性试验结果是,试纸条的检测极限为1∶160稀释的样品,其敏感性相当于实时荧光定量RT-PCR方法的1/64。由于试纸条具有操作方便、检测快速等优点,因此该试纸条可以用于大量临床样品的快速检测和现场检测。     

一种用于口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测的引物和方法

本文建立了一种用于口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测的引物和方法。分析所有已报道的口蹄疫病毒通用型基因组序列,分别设计引物和荧光探针,通过实时荧光RT-PCR检测,得到口蹄疫通用型的特异性荧光曲线,可以确定血清型,检测结果准确、可靠。     

.基于TaqMan探针的牛布氏杆菌实时荧光定量PCR的特异性鉴定

根据牛布氏杆菌BM28保守序列设计引物和探针,建立了一种快速鉴定牛布氏杆菌的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释的含有目的扩增片段的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。结果显示:5.0×105~5.0×101拷贝范围内定量PCR均有"S"型扩增曲线,检测灵敏度为50拷贝每微升。本研究建立的实时荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性和重复性好、方便经济的特性,在牛布氏杆菌的检测与鉴定中具有良好的应用前景。     

Detection of foot-and-mouth disease virus by nucleic acid sequence-based amplification (NASBA)

A study was conducted to evaluate the performance of a nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) assay for the detection of foot-and-mouth disease virus (FMDV). Two detection methods: NASBA-electrochemiluminescence (NASBA-ECL) and a newly developed NASBA-enzyme-linked oligonucleotide capture (NASBA-EOC) were evaluated. The diagnostic sensitivity of these assays was compared with other laboratory-based methods using 200 clinical samples collected from different regions of the world. Assay specificity was also assessed using samples (n=43) of other viruses that cause vesicular disease in livestock and genetic relatives of FMDV. Concordant results were generated for 174/200 (87.0%) of suspect FMD samples between NASBA-ECL and real-time RT-PCR. In comparison with the virus isolation (VI) data, the sensitivity of the NASBA-ECL assay was 92.9%, which was almost identical to that of the real-time RT-PCR (92.4%) for the same set of samples. There was broad agreement between the results of the NASBA-ECL and the simpler NASBA-EOC detection method for 97.1% of samples. In conclusion, this study provides further data to support the use of NASBA as a rapid and sensitive diagnostic method for the detection and surveillance of FMDV.     

基于TaqMan探针的虎制品实时荧光定量PCR的特异性鉴定

根据虎线粒体细胞色素b核苷酸保守序列设计引物和探针,建立了一种快速鉴定虎制品的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释的含有目的扩增片段的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。结果显示,5.0×10⁵~ 5.0×10¹拷贝/μL范围内定量PCR均有"S"型扩增曲线,检测灵敏度为50拷贝/μL。对豹、狮子、猫等7种非虎哺乳动物DNA样本的检测结果均为阴性。本研究建立的实时荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性和重复性好、方便经济的特性,在虎制品的检测与鉴定中具有良好的应用前景。