葡萄逆境胁迫诱导启动子的克隆及表达分析

为了研究葡萄抗逆基因(CAN70200.1)的表达特性,采用PCR技术从葡萄中克隆了CAN70200.1基因上游一段长度为1 354 bp的启动子片段,命名为PCAN。采用Plant CARE和PLACE启动子在线预测工具分析表明,PCAN启动子序列具有CAAT-box、TATA-box基本的顺式作用元件和一些参与非生物胁迫、光和植物激素应答相关的顺式作用元件。为验证启动子的表达特性,将PCAN启动子连接到p CAMBIA1391Z载体GUS基因的上游,构建成植物表达载体p1391Z-CAN,并通过农杆菌介导法转化烟草,经PCR鉴定,获得转基因植株。对转基因烟草植株进行逆境胁迫处理发现,在干旱处理120 min后,PCAN启动子活性达到最强;而4℃低温处理30~60 min时,PCAN启动子活性达到最强,表明PCAN启动子具有低温和干旱胁迫诱导表达特性。     

大豆逆境诱导基因GmPRP的克隆与表达

通过对大豆吉林32未成熟胚表达谱的分析,利用RT-PCR技术从大豆中克隆了一个新的脯氨酸富集蛋白基因,命名为GmPRP。GmPRP的开放阅读框长396 bp, 其分子量13.79 kD,具有131个氨基酸残基,等电点8.96,其DNA序列无内含子。GmPRP蛋白序列N端含有一段信号肽,中间为脯氨酸富集区,C端为半胱氨酸富集区。该蛋白与四季豆和木豆的PRP同源性最高, 具有较近的亲缘关系。GmPRP的683 bp启动子序列含有10种与逆境相关的顺式作用元件,分别为ABRE-like、G-box、W-box、GT-1、MYB、MYC、BIHD10s、DPBF、SEBF和WRKY。实时荧光定量PCR分析表明, 该基因表达量在大豆的根和叶中最高,在茎和胚中其次,在花中最低,且受干旱、高盐、低温、机械伤害及SA(水杨酸)、ETH(乙烯)、ABA(脱落酸)、MeJA (茉莉酸甲酯)的诱导上调表达。     

棉花GhMADS29启动子克隆及表达分析

以实验室克隆的GhMADS29(GeneBank登录号:JQ682642)基因的cDNA序列Blast搜索雷蒙德氏棉的基因组序列,根据Blast结果设计引物,克隆到起始密码子上游-19位开始的1316 bp的序列;利用PlantCARE启动子在线分析软件预测其含有核心启动子元件TATA-box和CAAT-box,并含有光、温、赤霉素、水杨酸、生长素等的响应元件.通过替换pBI121载体上的CaMV35S启动子构建了GhMADS29启动子与GUS基因的融合表达载体并转化拟南芥,组织化学染色分析发现其在14d幼苗的根和叶中都有表达,在萼片、花瓣、雌蕊、果瓣中也表达,而在雄蕊和种子中不表达.综上所述,我们推测GhMADS29可能与各种开花途径有关,与萼片、花瓣、雌蕊等花器官的发育有关,还可能与果实是否开裂有关.     

种子特异表达启动子的克隆分析及其植物表达载体的构建

根据GenBank已公布的种子特异性的Oleosin蛋白基因启动子序列设计合成引物,利用PCR技术从油菜总基因组DNA中扩增出Oleosin基因启动子序列(SOP),将该序列克隆到pGM-T载体中,经鉴定获得pGM-T-SOP重组载体。测序和序列分析表明,该启动子序列由899 bp核苷酸组成,其核苷酸序列与GenBank中的Oleosin基因启动子序列同源性高达95.6%。分别用限制性内切酶HindⅢ和BamH I双酶切重组质粒pGMT-SOP和双元植物表达载体pBI121,分别回收pGMT-SOP重组质粒中的SOP小片段和pBI121植物表达载体中去掉CaMV35S组成型启动子的大片段,经连接、转化和鉴定,获得由SOP驱动报告基因GUS的新型植物表达载体pBI121-SOP,为外源基因在油菜种子中的定位表达研究奠定基础。     

受多逆境诱导表达的GhWRKY64基因启动子克隆与功能分析

WRKY蛋白属于锌指型转录调控因子,参与植物生长发育及耐逆响应。以陆地棉遗传标准系TM-1为材料,克隆Gh WRKY64(KF031101)基因上游1064 bp的启动子序列,并对其调控元件及功能进行分析。生物信息学分析表明,该区域含18个组织器官表达及诱导表达关键元件,分别为6个ROOTMOTIFTAPOX1根特异调控元件,4个CACTFTPPCA1叶肉特异性调控元件、4个OSE2ROOTNODULE病菌诱导元件、2个GTIGMSCAM4盐调控元件和2个W-box胁迫应答响应元件。将该启动子与GUS基因融合,构建p BIW64:GUS植物表达载体,通过农杆菌介导叶盘转化法获得12个转基因烟草株系。选择GUS表达量最高的p BIW64-5进行转基因不同组织器官表达及诱导表达分析。GUS组织化学染色显示,苗期的转基因烟草植株在叶和根部均具有GUS活性,开花期在转基因烟草植株根、叶及叶柄均检测到GUS活性,特别在转基因烟草的根及根尖部分染色更深,在茎和花组织上未检测到GUS活性。对该转基因烟草幼苗进行黄萎病菌诱导处理,诱导48 h后,转基因烟草幼苗根和叶片的GUS染色比未诱导处理的对照明显加深。结果表明,Gh WRKY64上游1064 bp长度的DNA序列,具有启动子的相关顺式作用元件,且为病原菌诱导型启动子。该启动子可为开展棉花抗黄萎病转基因研究提供调控元件。     

白桦4CL基因启动子克隆及表达分析

为研究4-香豆酸辅酶A连接酶基因(4CL)在白桦木质素合成代谢过程中的组织特异性表达,利用染色体步移法克隆其启动子,用该启动子定向置换pBI121载体的35S启动子,构建重组载体P_(4CL)::GUS。利用瞬时转化法将重组载体转入白桦实生苗茎后进行GUS染色。结果显示:获得了4CL基因编码区起始密码子上游长1344 bp的启动子序列,该启动子除分布有TATA-box、CAAT-box等基本的转录起始元件外,还存在多个顺式作用元件序列位点,包括35S启动子作用元件ASF,参与脱落酸响应的顺式作用元件ABRE,参与茉莉酸甲酯响应的顺式调控元件CGTCA-motif,以及光反应元件G-Box、ACE、4CL-CMA2b等;启动子表达分析结果显示经过瞬时侵染的白桦茎段被染成蓝色。以上结果表明克隆获得的4CL基因启动子具有启动子表达活性,其可能参与了白桦木质部的发育。     

植物病原菌诱导表达载体构建及在烟草中的瞬时表达研究

根据GenBank中植物病原物诱导型启动子碱基序列设计引物,以烟草基因组DNA为模板,扩增PPP3启动子。用PPP3替换pCAMBIA1301中与gus基因相连的35S启动子,构建重组质粒pCOMBIA ＋PPP3＋gus后导入农杆菌GV3101。通过农杆菌介导的瞬时表达技术将受PPPs控制的gus基因导入烟草。分别接种青枯菌和水杨酸24 h后,烟草叶片中检测到gus基因转录效率分别提高了27．94,17．69倍。表明PPP3启动子具有本底表达水平低、诱导表达活性强的特点。     

大豆球蛋白G1启动子的克隆及表达活性分析

利用PCR的方法从大豆品种"吉豆2号"基因组DNA中克隆得到大豆球蛋白启动子G1p,长度约为686 bp,PLACE在线启动子预测工具分析表明:序列中含有多种典型的种子特异性表达元件。将克隆得到的G1p取代pCAMBIA1301中的CaMV35S启动子,构建于G1p与GUS基因融合表达的载体pCAM-G1p,通过农杆菌介导的方法在大豆根、茎、叶和种子中进行瞬时表达分析结果显示,仅能在种子中检测到GUS活性,而在根、茎和叶其他组织中基本检测不到GUS活性。说明G1基因上游686 bp片段具有种子特异性启动子的功能,G1p是一个比较高效的种子特异性启动子。     

玉米干旱诱导表达基因ZmCKS2的克隆与表达分析

在本实验室前期研究的干旱胁迫相关的抑制差减文库(SSH)中,发现一个玉米干旱胁迫诱导表达的EST序列,与拟南芥AtCKS2和AtCKS1基因有较高的同源性。应用生物信息学手段和同源克隆的方法,分离得到该基因,命名为ZmCKS2。序列分析表明该基因开放阅读框区267bp,编码88个氨基酸。ZmCKS2蛋白含有真核生物中高度保守的CKS(cyclin-dependent kinase regulatory subunit)结构域。应用在线分析软件预测该基因上游2kb序列表明,该序列具有启动子的核心序列和增强子序列,同时还具有与干旱等多种逆境胁迫相关的调控序列。应用实时荧光定量PCR分析表明该基因在幼穗中表达量最高,且受干旱和MeJA诱导上调表达,受低温和外源ABA诱导下调表达。     

大豆gma-miR160o启动子的克隆及植物表达载体构建

为了研究miRNA表达的调控机制,以大豆Williams 82基因组DNA为材料,根据预测的gma-miR160o启动子序列设计引物,采用PCR方法克隆gma-miR160o上游一段长度为1 910 bp的启动子序列。采用Plant CARE和PLACE启动子在线预测工具分析表明,gma-miR160o启动子序列具有TATA-box、CAAT-box基本的顺式作用元件和一些参与非生物胁迫、光和植物激素应答相关的顺式作用元件。将gma-miR160o启动子替代p BI121载体中的Ca MV35S启动子,构建了与GUS融合的启动子表达载体。     

玉米ZmPR4启子的克隆及其在小麦幼胚愈伤组织中的活性分析

以玉米B73基因组DNA为模板, 通过特异PCR扩增, 克隆出玉米启动子ZmPR4序列。序列分析表明, 该启动子与AJ969166序列同源性为100%。构建了ZmPR4或玉米泛素基因(Ubiquitin)启动子控制的报告基因GUS的表达载体。通过基因枪介导法转化小麦幼胚愈伤组织。瞬间表达实验表明, 在小麦幼胚愈伤组织中, 玉米ZmPR4启动子的本底表达活性明显比Ubi启动子的低, 但经纹枯病菌诱导后, ZmPR4 启动子控制的GUS基因的表达明显增强。PCR检测结果证实ZmPR4 启动子在小麦愈伤组织中具有表达活性, 能够驱动GUS基因的表达。因此, 玉米ZmPR4启动子在小麦抗病基因工程育种中具有潜在的应用价值。     

棉花种子特异性启动子的克隆及表达载体构建

种子特异性表达启动子是植物种子基因工程改良的重要工具.Lea(Late embryogenesis abundant)蛋白是胚胎发育后期种子中大量积累的一系列蛋白质,因此,其调控序列可能提供一个很好来源的种子特异性表达启动子.为研究植物Lea蛋白基因启动子在种子中的特异性表达,本研究通过PCR扩增,从亚洲棉(Gossy...     

维管特异表达启动子BSP的克隆与活性检测

为了研究维管特异表达启动子BSP的活性和组织特异性,从杨树基因组中克隆得到维管特异表达启动子BSP,利用该启动子与绿色荧光蛋白（GFP）报告基因构建植物表达载体,采用基因枪法转化烟草叶片,并在高渗培养基上培养过夜,后转移到诱导培养基上(MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L+Kan 100 mg/L)培养生根并长到一定高度后,剪下已形成维管组织的叶脉和根,制成切片,然后在OLYPUS BX51/BX52型荧光显微镜下用蓝光激发,观察各个组织细胞中的绿色荧光,同时以未转化的烟草材料做为对照。结果表明：BSP启动子所驱动的GFP基因在烟草的维管组织细胞中得到了高水平的表达,而在烟草的其他组织及对照的任何组织中几乎不表达。通过GFP在烟草维管组织中的瞬时表达,表明了该启动子具有维管组织特异性表达活性特点。     

大豆硬脂酸-ACP脱饱和酶基因启动子的克隆及其表达活性分析

以吉豆2号基因组为模板,通过TAIL PCR方法,扩增得到大豆硬脂酸-ACP脱饱和酶基因启动子片段SACPD-Cp。PLACE在线启动子预测分析表明, 该序列中含有多种典型的种子特异性表达序列元件。将SACPD-Cp片段取代pCAMBIA1301质粒中的CaMV35S启动子,构建表达载体pCAM-SACPD-Cp,通过农杆菌介导法在大豆组织中进行瞬时表达,GUS组织化学染色和荧光定量研究其表达特性。结果表明, SACPD-Cp驱动GUS基因在种子中的表达活性是CaMV35S启动子的93.01%;SACPD-Cp启动子与现已知启动子无同源性,仅在大豆种子中检测到GUS活性,而在根、茎和叶组织中均未检测到GUS活性,证实 SACPD-Cp是一个新的种子特异性启动子。     

玉米低磷胁迫诱导型强启动子P1502-ZmPHR1的克隆与表达分析

玉米ZmPHR1基因是转录因子MYB-CC家族成员, 过量表达该基因可促进低磷环境中植物对磷的吸收并改善植物的生长。本研究从磷高效利用型玉米自交系478中获得了ZmPHR1基因的5°上游序列P₂₂₀₅-ZmPHR1, 序列长度2205 bp。将P₂₂₀₅-ZmPHR1及它的4种5°端缺失启动子片段与报告基因GUS连接后转化拟南芥。GUS组织化学染色与GUS定量分析结果表明, 在0~1502 bp的片段范围内, 随着片段长度的增加, 它对外界低磷环境的响应逐步增加, 在-1502 bp时, 响应时间短, 表达活性高, 持续时间长; 超过1502 bp其活性不但没有增高, 反而变为下降或无变化。推测0至-972 bp为启动子功能区段, -972 bp至-1502 bp为启动功能增强区段。转P₁₅₀₂-ZmPHR1拟南芥的实时定量PCR结果显示, P₁₅₀₂-ZmPHR1既受外界信号的刺激, 也受体内基因产物的影响, 有反馈调节的作用, 是一个受低磷胁迫诱导的强诱导型启动子, 它诱导基因表达的功能受体内外磷浓度的调节。该研究为在低磷环境改良作物提供了理想的启动子和应用依据。     

柽柳GRAS转录因子基因启动子克隆和表达分析

克隆获得柽柳GRAS 转录因子基因启动子序列,并对其表达模式进行分析,从而初步探究GRAS转录因子基因的表达特征和功能。CTAB法提取刚毛柽柳基因组DNA,按照Genome Walking Kit 说明克隆GRAS 转录因子基因启动子序列,将克隆获得的GRAS 转录因子基因启动子序列定向替换pCAMB1301 载体上的35S启动子序列,构建融合表达载体,以驱动GUS 基因表达,瞬时侵染拟南芥后进行GUS 基因的染色。成功克隆获得刚毛柽柳936 bp 的GRAS 转录因子基因启动子序列。PLACE 和PlantCARE 数据库分析结果表明该启动子不仅包含启动子区的核心元件CAAT-box 和TATA-box,还含有多个与逆境应答有关的顺式调控元件。成功将GRAS 基因启动子序列定向置换pCAMBIA1301 的35S 启动子,构建重组载体PGRAS::GUS。瞬时转化拟南芥后GUS 染色,结果显示转基因拟南芥叶片被染色而根部着色较浅。初步表明克隆获得的GRAS 基因启动子具有启动子表达活性,其可能参与了柽柳的抗逆应答,为进一步分析该基因的抗逆功能和抗逆机制奠定了基础。