牛卵丘细胞对卵母细胞体外成熟与孤雌发育的影响

试验以牛卵泡内卵丘-卵母细胞复合体(COCs)为材料,探讨了牛卵丘细胞包裹程度对卵母细胞体外成熟(IVM)和孤雌胚胎(PAEs)发育的影响。试验1,将COCs随机分为2组,在开展IVM前,将其中一组COCs的卵丘细胞机械吹打去除成为机械裸卵(DOs),研究卵丘细胞层存在与否对卵母细胞体外核成熟(排出第一极体)和孤雌激活后发育能力的影响;试验2,根据COCs卵丘细胞包裹层数将COCs分为3组,即卵丘细胞层少(1～4层)的COCs为A组、卵丘细胞层多(5层以上)的COCs为B组及包裹5层以上卵丘细胞且附带卵泡壁颗粒细胞层(FSP)的COCs为C组,研究卵丘细胞层包裹程度对卵母细胞的体外核成熟和孤雌激活后胚胎发育能力的影响。结果表明:卵丘细胞的存在更有利于卵母细胞体外成熟和孤雌胚胎发育;COCs中卵丘细胞包裹层数对卵母细胞体外核成熟率没有显著影响,但包裹卵丘细胞层数多且附带FSP的卵母细胞,其PAEs的囊胚率显著高于包裹卵丘细胞少的卵母细胞PAEs。     

卵丘细胞对辽宁绒山羊卵母细胞体外成熟与孤雌发育的影响

为了进一步探索辽宁绒山羊卵母细胞体外成熟的方法,本试验以屠宰场绒山羊卵巢为材料,采用抽吸法收集直径大于2 mm卵泡的卵母细胞,研究卵丘细胞对卵母细胞体外成熟和孤雌发育的影响。试验1,将一部分COCs经机械吹打脱除卵丘细胞成为机械裸卵(DOs),然后以4种方式培养,即COCs单独培养、DOs与COCs共培养(DOs(COCs))、DOs与卵丘颗粒细胞共培养(DOs(CCs)),以及DOs单独培养。试验2,根据包裹卵母细胞的卵丘细胞的完整性分为3组,有3层卵丘细胞紧密包围的卵母细胞复合体COCs3,有1-3层卵丘细胞包围的卵母细胞COCs1-3,无卵丘细胞包围的裸露卵母细胞NOs,3组各自单独培养。结果表明:COCs组的成熟率、孤雌卵裂率和囊胚率最高,分别为83.25%、41.75%和29.25%,卵丘细胞的存在有利于卵母细胞体外成熟和随后的发育,COCs3组成熟率、孤雌卵裂率和囊胚率分别为83.25%、42.50%和29.75%,显著高于COCs1-3和NOs组,卵丘细胞的完整性也影响着卵母细胞的体外发育,自然裸卵已失去体外发育能力。     

卵丘细胞对猪卵母细胞成熟及发育的影响

本实验旨在研究有无卵丘细胞对卵母细胞成熟及其胚胎发育能力的影响。实验分别设裸卵组、卵丘细胞与卵母细胞共培养组、卵丘-卵母细胞复合体(COCs)组(对照组),检测猪成熟卵母细胞的存活率、极体率、孤雌激活后的卵裂率、囊胚率及各组卵母细胞的谷胱甘肽合成相关基因的表达。结果表明:COCs组卵母细胞经体外培养42 h后其存活率最高(95.76%),高于裸卵组(P<0.05)和共培养组(P>0.05);COCs组第一极体排出率为71.77%,高于共培养组和裸卵组(P<0.05);COCs组在后期发育中卵裂率与囊胚率高于共培养组和裸卵组(P<0.05),而共培养组的卵裂率及囊胚率高于裸卵组(P<0.05);与COCs组相比,裸卵组显著下调了GCLM、GCLC的表达(P<0.05),共培养组中GCLM的表达与COCs组无显著差异。研究结果显示,卵丘细胞对卵母细胞的成熟及发育均有显著影响,在卵母细胞成熟过程中,卵母细胞与卵丘细胞的缝隙连接受损会对卵母细胞的成熟效率产生影响,并且在卵母细胞后期发育中,缝隙连接的完整性与否会影响后期发育能力,并可推论出随着卵丘细胞的减少和缝隙连接的破坏,会造成谷胱甘肽合成基因表达降低,从而影响卵母细胞内的谷胱甘肽合成。     

丙酮酸和乳酸代谢对猪卵母细胞体外核成熟的作用

关于卵母细胞成熟过程中糖代谢的研究主要集中在糖酵解和PPP途径上,而对丙酮酸和乳酸代谢的报道较少。本研究据此探讨猪卵母细胞体外核成熟过程中丙酮酸和乳酸的代谢途径及对卵母细胞核成熟的影响。以不含能量物质的NCSU-23为基础培养基,添加不同浓度的丙酮酸钠或乳酸钠及单羧酸转运蛋白(MCT)抑制剂4-CIN、线粒体呼吸链抑制剂鱼藤酮或乳酸脱氢酶抑制剂草氨酸钠,培养猪卵丘-卵母细胞复合体(COCs)或裸卵(DOs),观察核成熟率。结果表明,添加15mmol/L丙酮酸钠时,COCs和DOs核成熟率最高,分别为(69.5±3.1)%和(54.7±2.6)%;同时添加4-CIN或鱼藤酮显著(P0.05)降低COCs和DOs核成熟率;添加3mmol/L乳酸钠时COCs和添加10mmol/L乳酸钠时DOs的核成熟率达到最高,分别为(72.1±1.7)%和(41.1±2.3)%;同时添加草氨酸钠显著(P0.05)降低COCs和DOs的核成熟率。以上结果说明:(1)猪COCs和DOs均能代谢丙酮酸和乳酸支持其核成熟;(2)丙酮酸通过MCT跨膜转运进入线粒体并经线粒体呼吸链代谢支持卵母细胞核成熟;(3)乳酸通过LDH催化生成丙酮酸和NADH来维持卵母细胞核成熟;(4)猪COCs比DOs对丙酮酸和乳酸的利用能力强,说明卵丘细胞对卵母细胞成熟至关重要。     

磷酸二酯酶抑制剂对水牛卵母细胞减数分裂成熟的影响

本研究探讨了磷酸二酯酶抑制剂米力农(milrinone)对水牛卵母细胞体外自发成熟和促性腺激素诱导成熟的影响,以便提高卵母细胞体外成熟质量。试验对水牛卵丘卵母细胞复合体(COCs)培养不同时间或采取不同处理后,取出卵母细胞剥光后固定,然后用间苯二酚蓝染色,观察卵母细胞核成熟情况。结果表明:(1)Milrinone对水牛COCs的自发成熟具有抑制作用,且具有剂量依赖关系;(2)Milrinone对水牛卵母细胞体外自发成熟的抑制作用随培养时间的延长没有减弱,可作为水牛卵母细胞成熟过程中的核成熟抑制剂;(3)Milrinone能显著抑制促卵泡激素(FSH)诱导的水牛COCs体外成熟,但是随着时间的延长,这种抑制作用可以部分被FSH克服。     

猪卵丘包裹层数与猪卵母细胞质量的相关性研究

为探讨如何从大量的未成熟卵母细胞中挑选出合适的卵母细胞用于体外成熟培养,本研究根据猪卵丘-卵母细胞复合体(COCs)的颗粒细胞层数和胞质情况,把挑选的COCs分成A、B、C3个等级;体外成熟培养42 ～44 h后,所获得的成熟卵母细胞做孤雌激活,比较孤雌胚的发育能力.结果表明:A、B、C3级卵母细胞的成熟率之间没有差异(P＞0.05),但是A级卵母细胞与B级卵母细胞的孤雌胚胎的囊胚率显著高于C级卵母细胞(P＜0.05).说明卵丘细胞包裹层数不会影响卵母细胞的成熟率,但会影响其潜在的发育能力.     

山羊卵母细胞体外成熟培养液体积筛选

研究在一定卵丘-卵母细胞复合体(COCs)与培养液体积比例条件下,不同体积的培养液对山羊卵母细胞体外成熟的影响。按照COCs 1枚/4μL培养液的比例,采用5种不同体积的培养液,即50,100,250,500和1 000μL,对山羊卵母细胞进行体外成熟培养和孤雌激活。结果:100μL和250μL两组的卵母细胞体外成熟培养24 h后,其卵母细胞成熟率分别为78.10%和74.62%,差异不显著(P>0.05),但高于50μL组(P<0.05)、500μL组(P<0.05)和1 000μL组(P<0.01)组。100μL组孤雌激活胚胎的卵裂率(68.37%)、桑葚胚率(48.78%)和囊胚率(27.61%)都优于其他各组,其卵裂率和囊胚率与250μL组相比差异不显著(P>0.05)。结果表明采用COCs 1枚/4μL培养液的比例条件下培养卵母细胞,宜选用100～250μL范围内的培养液体积进行卵母细胞成熟培养,其卵母细胞体外成熟率可以达到78.10%左右。     

卵丘细胞对猪卵母细胞体外成熟发育及GPX3、GPX4基因表达的影响

为了深入探讨卵丘细胞对猪卵母细胞成熟和胚胎发育的影响机制,试验设置裸卵(卵母细胞)组、共培养(卵丘细胞和裸卵母细胞)组和卵丘-卵母细胞复合体(COCs)组,将3组的猪卵母细胞体外成熟培养后,检测3组猪卵母细胞的存活率、第一极体排出率、卵裂率、囊胚率等指标,及每组卵母细胞内谷胱甘肽(GSH)含量,并利用RT-qPCR技术测定了每组卵母细胞内与谷胱甘肽合成代谢相关的关键基因GPX3、GPX4的表达水平,最终从生化和分子水平揭示卵丘细胞影响猪卵母细胞成熟和胚胎发育的机制。结果表明:COCs组的存活率、第一极体排出率、卵裂率及囊胚率均显著高于裸卵组(P0.05);共培养组第一极体排出率、卵裂率和囊胚率显著低于COCs组(P0.05),但卵裂率、囊胚率显著高于裸卵组(P0.05),存活率和第一极体排出率与裸卵组差异不显著(P0.05);共培养组卵母细胞谷胱甘肽含量显著低于COCs组(P0.05),但GPX3、GPX4基因的表达量与COCs组差异不显著(P0.05);裸卵组谷胱甘肽含量和GPX3、GPX4基因表达量均显著低于COCs组(P0.05)。说明在猪卵母细胞成熟过程中,卵丘细胞不仅影响卵母细胞内谷胱甘肽的含量,而且对谷胱甘肽合成代谢相关基因GPX3、GPX4的表达也有显著影响,进而影响卵母细胞成熟质量和胚胎发育效果。     

玻璃化冷冻对牦牛未成熟卵母细胞发育能力及COC转录组的影响

旨在探讨玻璃化冷冻-解冻对牦牛未成熟卵母细胞发育能力及卵丘-卵母细胞复合体(COCs)转录组的影响,为完善牦牛COCs冷冻保存技术提供理论依据。本研究将未经成熟培养的牦牛COCs进行玻璃化冷冻-解冻后分为2组,A组:COCs体外成熟(IVM)后用普通牛精子进行体外受精(IVF),获得的受精卵在G-1胚胎培养液中培养72 h后转入G-2培养液培养96 h;B组:IVF后,受精卵在G-1培养液培养120 h后转入G-2培养液培养48 h;以未进行冷冻处理的新鲜COCs作为对照组(C组):IVF后,受精卵在G-1培养液培养72 h后转入G-2培养液培养96 h。对牦牛新鲜COCs(n=3)和玻璃化冷冻-解冻的COCs(n=3)进行扩增、建库和转录组测序(RNA-seq)分析。结果发现,B组的卵裂率、囊胚率显著高于A组(P0.05),但A组和B组的卵裂率、囊胚率均显著低于C组(P0.05)。以|log_2(fold change)|≥2,Q0.05为阈值,牦牛冻融COCs相对于新鲜COCs共筛选出851个差异表达基因(DEGs),其中上调846个,下调5个。GO分析表明,DEGs主要富集于生物过程、细胞组分和分子功能3大类;KEGG注释结果表明,DEGs富集到258条通路,其中16条通路显著富集(P0.05)。研究表明,IVF后在G-1培养液中培养120 h可以提高牦牛玻璃化冷冻卵母细胞的后续发育能力;玻璃化冷冻影响牦牛COCs转录组,从而降低卵母细胞的发育潜力。该发现为完善牦牛COCs玻璃化冷冻技术提供了一定的理论基础。     

牦牛卵巢卵母细胞体外培养成熟条件的建立

研究了不同采集方法和不同培养液对牦牛卵母细胞体外成熟的培养效果。结果:在牦牛乏情期,每个卵巢平均回收卵数为(9.33±4.30),可用卵数为(5.63±4.19)。将牦牛卵丘卵母细胞复合体分别置于5种成熟培养液中培养,成熟率分别为75.56%、71.11%、81.33%、77.33%和77.78%,卵裂率分别为42.22%、33.33%、49.33%、46.67%和42.22%,其中C的成熟液效果最好。来自卵巢表面卵泡的COCs的成熟率(81.33(vs69.33(,P>0.05)高于来自卵巢内卵泡的COCs,卵裂率(49.33%vs34.67%,P<0.05)显著高于来自卵巢内卵泡的COCs。来自明亮卵泡的COCs的成熟率(81.33%vs33.33%,P<0.01)和卵裂率(49.33%vs3.33%,P<0.01)极显著高于来自混浊卵泡的COCs。     

绵羊裸卵与卵丘-卵母细胞共培养对体外成熟及孤雌发育的影响

本研究探讨了在绵羊卵母细胞体外成熟过程中裸卵(DO)与卵丘-卵母细胞复合体(COCs)共培养对成熟质量及后期发育的影响。试验分3组:对照组(COCs);COCs与DO共培养组(CODO)和裸卵组(DO)。结果表明:对照组中COCs与CODO组中COCs的活率和极体排出率差异均不显著(P>0.05),而CODO组中COCs的极体排出率却显著高于该组中的裸卵(P<0.05);CODO组中裸卵与DO组中裸卵在极体率方面差异不显著(P>0.05),但在活率方面CODO组中的裸卵却显著高于DO组(P<0.05)。虽然3组卵裂率之间差异均不显著(P>0.05),而就囊胚率而言,对照组中COCs与CODO组中COCs之间囊胚率差异不显著(P>0.05),但都显著高于CODO和DO 2组中的裸卵(P<0.05);此外,DO组裸卵的囊胚率显著低于CODO组中的裸卵(P<0.05)。总之,在体外成熟共培养过程中,裸卵对COCs的成熟和后期发育影响不大;而COCs则可以显著提高裸卵的成熟率和后期发育潜力。     

牛卵母细胞体外成熟技术研究

从两方面探讨了牛卵母细胞的体外成熟培养效果,即对不同级别和不同卵巢卵泡直径的卵丘卵母细胞复合体（COCs）进行成熟培养,测定其成熟率。COCs级别不同,培养成熟率之间存在很大差异,A级COCs成熟率为63．81％,B级为47．81％,显著高于C级和D级（P〈0．01）。卵母细胞的成熟率与采集COCs时的卵泡直径关系密切。中等卵泡的卵母细胞的成熟率为61．82％,显著高于小卵泡和大卵泡（P〈0．01）。试验结果表明：A级和B级COCs是卵母细胞体外培养的主要资源;在卵母细胞体外培养过程中,宜选择卵泡发育水平基本正常的中等卵泡采集COCs,而不宜选择发育过大或过小的卵泡。     

不同采集方法对猪卵母细胞的采集效率和成熟率的影响

本研究旨在开发出一种对COCs损伤小且采集效率和卵母细胞成熟率高的卵母细胞采集方法.从屠宰场采集来的卵巢运回实验室后随机分为3组,分别用抽吸法、解剖法和刀切过滤法3种方法采集COCs,然后进行体外成熟培养,通过对COCs采集效率、COCs完整性及卵母细胞体外成熟率的比较,研究解剖法、刀切过滤法和抽吸法3种采集方法对猪卵母细胞的采集效率和成熟率的影响.结果表明:每个卵巢采集COCs个数,刀切过滤法显著高于解剖法和抽吸法(P＜0.05),而解剖法仅为1.55个,显著低于抽吸法(P＜0.05);采集效率抽吸法最佳,采集和挑选单个COCs的时间显著低于解剖法和刀切过滤法(P＜0.05),刀切过滤法次之,但显著低于解剖法(P＜0.05);A、B级COCs比例,解剖法高达99.23%,显著高于其他2种方法(P＜0.05),刀切过滤法与抽吸法差异不显著(P＞0.05);卵母细胞的成熟率,解剖法和刀切过滤法都达到80%,二者间差异不显著(P＞0.05),但显著高于抽吸法(P＜0.05);100个成熟卵母细胞所需的卵巢数量,刀切过滤法最少,仅为17.4个,而解剖法和抽吸法分别高达80.6和90.3个;需要的总采集时间(采集和挑选的时间),刀切过滤法最低,仅为126.6 min,而解剖法最高,为758.9min.综上所述,与抽吸法和解剖法相比,刀切过滤法是一种高效、快速的卵母细胞采集方法.     

培养时间和表皮生长因子对兔卵母细胞体外成熟的影响

本试验旨在探讨培养时间和表皮生长因子(EGF)对兔卵母细胞体外成熟及受精的影响。分别用切割法和针刺挤压法取经超排后母兔卵巢表面的卵母细胞颗粒细胞复合体(COCs),将COCs分别在不同时间(24、30、36及40h)和在基础培养液中添加不同浓度表皮生长因子(0、50、100ng/mL)进行体外成熟培养并观察其第一极体排出率。结果表明:①针刺挤压法获得COCs数明显高于切割法(P0.05);②体外成熟培养时间30(36)h的第一极体排出率高于24(40)h(P0.05);③添加50和100ng/mLEGF组卵母细胞第一极体排出率明显高于对照组(P0.05)。因此,①兔卵巢卵母细胞的获得方法以针刺挤压法较好;②兔卵母细胞成熟时间以30～36h为宜;③EGF对兔卵母细胞体外成熟有促进作用,在基础培养液中添加100ng/mLEGF为宜。     

乙草胺对小鼠卵母细胞体外成熟的影响

【目的】研究乙草胺对小鼠卵母细胞体外成熟的影响,为研究体内乙草胺对卵母细胞质量的影响提供参考。【方法】将收集的卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes, COCs)置于含有不同浓度(0(对照组)、10、50、100、130、200μmol/L)乙草胺的体外成熟培养液中培养14 h,统计卵母细胞第一极体排出率,进行体外受精后,统计体外受精胚胎的囊胚率,筛选出适宜于卵母细胞体外培养的乙草胺浓度。将COCs在对照组和筛选出的适宜浓度的乙草胺组成熟培养液中培养14 h后,利用DCFH-DA检测卵母细胞活性氧(ROS)水平;利用CellTracker^TM蓝色染料检测卵母细胞谷胱甘肽(GSH)水平;利用JC-1染色法检测卵母细胞线粒体膜电位水平(mitochondrial membrane potential, MMP);利用实时荧光定量PCR检测卵母细胞内凋亡相关基因的表达水平,利用Hoechst 33342染色检测体外受精胚胎的囊胚细胞总数,用Fluorescein-dUTP染色法检测囊胚细胞凋亡率。【结果】与对照组相比,100、130、20...     

猪分级卵母细胞体外成熟时间规律的研究

试验根据猪卵丘－卵母细胞复合体（COCs）的颗粒细胞层数,把COCs分成A、B、C和D级,A、B级用于体外分别培养24、32、38、44、48和54 h,C级用于体外分别培养24、32、38、44、48、54和60 h,观察它们不同时间排出极体数,然后将排出极体的卵母细胞孤雌激活。结果发现,A和B级COCs培养48 h时成熟率最高（83.2%和78.0%）,明显高于同级水平培养24、32和38 h的成熟率;不同级别COCs体外培养相同时间,A与B级成熟率差异不显著（P＞0.05）,但二者与C级的成熟率差异显著（P＜0.05）;体外培养48 h COCs卵裂率最高（81.7%）,与培养38 h前的卵裂率差异显著（P＜0.05）。结果表明,A、B级卵母细胞更适于体外培养,能获得高的成熟率和卵裂率,COCs周围颗粒细胞对卵母细胞的成熟有显著影响;COCs培养38 h之前,部分虽能看到极体,但激活后卵裂率极低,说明卵母细胞并未真正成熟,通常通过排出极体判断卵母细胞成熟是不够准确的,COCs体外培养44～48 h是成熟的最佳时期,能为体细胞核移植提供大量优质的MⅡ期卵母细胞。     

卵母细胞成熟相关激素和生长因子受体在马扩展型和紧凑型卵丘-卵母细胞复合体表达的研究

旨在比较一些与卵细胞成熟相关的激素和生长因子受体在两种卵丘-卵母细胞复合体(Ex-COC和Cp-COC)中的表达以探究两种类型的马卵母细胞成熟和发育能力差异的原因。本研究在屠宰场采集蒙古马离体卵巢带回实验室回收COCs,并根据卵丘细胞形态区分Ex-和Cp-COCs;通过qPCR和免疫荧光检测FSHR、LHR、IGF1R、IGF2R、ESR1、ESR2,BMP15和GDF9受体BMPR1B、BMPR2和ALK5在两种COCs中的表达模式;将雌二醇、IGF2、GDF9和BMP15分别添加进马IVM培养体系中检测其对马卵母细胞体外成熟率的影响。结果显示,这些受体基因的表达量在Ex-和Cp-COCs的卵丘细胞和卵母细胞中均有差异,在Cp-COCs中,卵丘细胞的大部分受体基因表达量高于卵母细胞;而在Ex-COCs中,卵母细胞与卵丘细胞的基因表达水平相似或高于卵丘细胞。相较于Cp-COCs的卵母细胞,大部分的受体基因在Ex-COCs的卵母细胞中表现出更高表达水平。体外成熟培养试验表明雌二醇和IGF2的添加可能有利于提高马的卵母细胞体外成熟率。马扩展型和紧凑型COCs中FSH、LH、IGF1、IGF...     

牦牛卵母细胞的体外成熟

以屠宰场牦牛卵巢为材料,比较了抽吸加切割法和抽吸法2种卵母细胞离体采集方法的效率和5种成熟培养液的培养效果,并研究了卵泡位置、形态对卵母细胞体外成熟的影响。结果表明:在牦牛乏情期,平均每个卵巢用抽吸加切割法回收卵数极显著高于抽吸法(9.33±4.30VS4.70±2.62,P<0.01),可用卵数也极显著高于抽吸法(5.63±4.19VS4.37±2.32,P<0.01)。将牦牛卵丘卵母细胞复合体(COCs)分别置于5种成熟培养液中培养,其中M199(缓冲体系为Earles盐) 10% FBS 5.0mg/LLH 1.0mg/LE2 双抗(青霉素100IU/mL和链霉素100mg/L)的成熟液效果最好,成熟率为81.33%,卵裂率为49.33%。来自卵巢表面卵泡的COCs的成熟率和卵裂率均高于来自卵巢内卵泡的COCs(分别为81.33%VS69.33%,P>0.05;49.33%VS34.67%,P<0.05)。来自明亮卵泡的COCs的成熟率和卵裂率均极显著高于来自浑浊卵泡的COCs(分别为81.33%VS33.33%,P<0.01;49.33%VS3.33%,P<0.01)。     

AY9944A-7和FSH对绵羊卵母细胞体外成熟的影响

本试验旨在研究FSH和AY9944 A-7在抑制剂阻滞的绵羊卵母细胞体外成熟过程中的诱导作用并探究二者的互作效应。分别以次黄嘌呤(Hx,4 mmol/L)、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX,0.25 mmol/L)或者二丁酰环磷酸腺苷(dhcAMP,0.3 mmol/L)抑制绵羊卵丘-卵母细胞复合体(COCs)中卵母细胞自发成熟,通过单独或同时添加FSH(10μg/mL)和AY9944 A-7(20μmol/L)诱导其恢复减数分裂。结果表明:FSH能克服一定浓度Hx,IBMX和dbcAMP对绵羊卵母细胞自发成熟的抑制作用,诱导绵羊卵母细胞生发泡破裂,排出第一极体;AY9944A-7能够克服一定浓度Hx和IBMX的抑制,诱导绵羊卵母细胞恢复减数分裂;FSH和AY9944 A-7在克服Hx对绵羊卵母细胞成熟的抑制时,存在显著的协同效应(P0.05)。