猪流行性腹泻病毒湖北株的分离鉴定及其s1基因进化分析

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是猪的肠道传染病病原,主要引起仔猪呕吐、腹泻和脱水,对一周龄内的哺乳仔猪危害最为严重,死亡率可达50%~100%。利用Vero86细胞从湖北某猪场腹泻仔猪小肠病料中分离到一株病毒,经RT-PCR检测、序列比对后确定其为PEDV,命名为HB201503株。设计PEDV s1基因的全长扩增引物,获得该株病毒的s1基因全长序列并进行了进化分析,结果表明该毒株与近年来在Gen Bank登陆的PEDV s1基因核苷酸序列相似性在91.4%~99.2%,与疫苗株CV777相似性较低,仅为91.8%。通过s1基因进化树分析表明HB201503以及近几年国内分离毒株主要集中在第I个亚群,且HB201503株与KM406183(2014,四川)和KM609206(2015,江苏)同源性较高。此外,s1蛋白氨基酸序列比对显示,HB201503与近几年分离毒株及疫苗株CV777均在55-74、157-163位氨基酸出现了连续4个以上氨基酸的缺失或替换,而且HB201503株与CV777及近几年分离毒株相比,还在270-283位氨基酸上出现了1个氨基酸的缺失和10个氨基酸的替换。     

猪流行性腹泻病毒S2基因的克隆与遗传进化分析

为了解猪流行性腹泻病毒(PEDV)新流行毒株的遗传变异情况,本研究对2014—2018年间采集的205份PEDV疑似阳性样品进行RT-PCR检测、扩增PEDV S2基因并进行遗传转化分析。RT-PCR结果显示,205份疑似阳性样品中有191份扩增出单一条带,片段大小为1 887 bp,符合S2基因的扩增预期。试验样品阳性检出率为93. 17%。测序分析表明,试验共获得25株S2基因序列,与参考毒株之间核苷酸的同源性为94. 3%～99. 6%,氨基酸的同源性为86. 4%～96. 2%。遗传进化分析结果显示,试验得到的PEDV毒株分属于G1、G2亚群。本研究为PEDV防控以及疫苗毒株筛选奠定基础。     

猪流行性腹泻病毒CH-HeNXX-2017株全基因组序列测定与分析

为了解猪流行性腹泻病毒在河南流行毒株全基因组遗传进化水平,应用RT-PCR方法从疑似猪流行性腹泻病毒感染的病料中扩增出全基因组序列,并将PCR产物纯化后连接pMD20-T载体,转化JM109感受态细胞,挑选单克隆进行测序,获得的序列经过DNA STAR中Edit Sequence软件对全基因组序列进行拼接。结果表明,猪流行性腹泻病毒CH-He NXX-2017株全长28 038 nt(除去poly A);进化树分析显示,该毒株与IA1,USA Colorado2013,MN和PC22A等毒株亲缘关系较为接近,与国内外早期分离株如CV777,LZC,DR13等毒株亲缘关系较远。揭示猪流行性腹泻病毒一直处于不断的进化中,需要一直密切监控病毒进化趋势,为临床诊断以及疫苗研发等提供理论参考。     

猪流行性腹泻病毒SHpd/2012株S1和S2基因片段的真核表达

为探究猪流行性腹泻病毒(PEDV)的新毒株SHpd/2012在感染细胞时与细胞的相互作用机制,根据已得到的序列设计引物,克隆了S1和S2基因片段,构建了pCAGGS-S1和pCAGGS-S2真核表达质粒。间接免疫荧光和Western-blot实验表明,转染后S1和S2都能在Vero细胞内表达,且转染48h后的表达量较高;其中S1蛋白分子量约为90kDa,S2蛋白分子量约为60kDa。流行毒株SHpd/2012的S1与S2两肽段的成功表达,为之后进一步研究PEDV与Vero细胞的相互作用奠定了基础。     

上海地区新发猪流行性腹泻病毒的鉴定及分析

目前,仔猪腹泻病严重危害我国生猪养殖业,利用核酸分析技术我们对今春导致上海地区多个猪场仔猪腹泻病的病原体进行了鉴定,结果显示,猪腹泻病病毒(PEDV)是致病元凶.在此基础上,我们利用PEDV特异性引物,克隆了上海地区流行毒株的结构蛋白基因S、N和M,并根据保护性抗原S1基因序列比对,分析了此病毒株与其他相关毒株的亲缘关系.结果表明,上海地区PEDV流行株与2010年来我国各地发生的多数猪腹泻病毒亲缘关系接近,而与传统病毒株如CV777和周边日本和韩国近年来流行的毒株存在一定的差异.另一方面,分析还表明,近年来我国不同地区流行的PEDV存在着异质性,亲缘关系存在差异.通过这些分析,提示当前急需研制新的疫苗尤其是减毒活疫苗对PEDV予以预防.     

猪流行性腹泻病毒的鉴定及其S基因的序列分析

为确诊河南某猪场仔猪腹泻的病原,进一步了解该猪场PEDV流行毒株S基因的变异情况,对临床采集疑似PED的病料进行检测,并对检测结果为PEDV阳性的毒株进行S基因序列分析。结果显示,采集的病料均为PEDV阳性,S基因的进化分析显示,该猪场PEDVS基因推导的氨基酸序列之间的同源性高达99%,与国内其他毒株均位于G2-b进化分支,研究结果为进一步掌握该地PEDV的流行毒株及毒力变异情况提供理论依据。     

猪流行性腹泻病毒SHpd/2012株S蛋白的表达鉴定

猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种可致仔猪严重腹泻的高度接触性肠道传染病。S蛋白在病毒感染和入侵宿主细胞的过程中具有重要作用。为了研究S蛋白的特点,本研究扩增了PEDV新流行毒株SHpd/2012的纤突蛋白S基因分段片段S11、S12、S13、S21和S22,将得到的目的片段导入原核表达载体pGEX-6P-1中,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行表达、鉴定,获得了正确的PEDV S的分段蛋白S11(24-277aa)、S12(272-571aa)、S13(560-797aa)、S21(793-1109aa)及S22(1102-1384aa),为后续单克隆抗体的制备和致病机制的研究奠定了基础。     

乳酸菌表面表达PEDV S1蛋白的研究

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)可引起猪的急性腹泻和脱水,具有较高的致死率.为了研究基因工程疫苗来预防此病,从pQE-S质粒为模板,PCR扩增了PEDV抗原决定簇基因片段sl基因,并将其克隆到大肠杆菌中.克隆质粒鉴定后,将其连接到pLA载体上,并转化到干酪乳杆菌中,用SDS-PAGE和Western blot方法进行了鉴定.实验结果显示,S1蛋白可在干酪乳杆菌中正确表达,并为PEDV抗血清所识别.     

猪流行性腹泻病毒陕西渭南株的遗传变异

从陕西省渭南某规模化猪场采集疑似猪流行性腹泻(PED)仔猪病料进行病毒检测,旨在从基因遗传变异方面分析疾病发生的可能原因。通过RT-PCR从疑似仔猪20份小肠样品中检测到9份PED病毒阳性样品,并扩增出PED病毒M、ORF3和S基因的部分序列。序列分析结果表明,与CV777疫苗株对比,样品渭南(WN)株PEDV M基因高度保守,同源性为98.2%;ORF3基因存在11处碱基突变,同源性为98.2%;S基因突变较大,存在4个插入区域,分别是164~166、177~179、181~186和416~418nt,内分核心中和表位区(COE,499~638位氨基酸)存在9个氨基酸突变位点。遗传分析显示,WN株M基因与中国近期分离毒株亲缘关系较近;ORF3基因与同处在G1群中的中国毒株亲缘关系较近,而与CV777疫苗株亲缘关系较远;S基因与中国早期分离毒株及CV777疫苗株亲缘性较远,与当前的流行株亲缘关系密切。这些结果表明,WN株与CV777疫苗株相比,有明显的遗传变异倾向,可能导致目前PEDV疫苗免疫效果下降,PED疫情大规模流行。     

福建省猪流行性腹泻病毒的ORF3基因序列分析

为探讨福建省猪流行性腹泻病毒(PEDV)ORF3基因遗传变异情况,于2014-2015年从福建省不同地区猪场扩增8株PEDV的ORF3基因,并进行序列比对及遗传进化分析。结果表明:8株分离株均为野毒株;与近年来国内及其周边国家的分离株亲缘关系较近,其核苷酸同源性及推导的氨基酸同源性最高高达100%;与经典株CV777亲缘关系较远,其核苷酸及推导的氨基酸同源性达96.0%~96.9%与92.5%~94.7%;表明近年来福建省PEDV流行株较以往的经典株已经发生了改变。     

一起猪流行性腹泻病毒与博卡病毒混合感染病例分析

陕西渭南某猪场发生了一起仔猪腹泻病例,通过临床症状观察、病理解剖、细菌分离以及病原RT-PCR检测,确诊为一起流行性腹泻病毒混感博卡病毒病例。针对发病原因提出了防治措施,为防控仔猪腹泻提供参考。     

牛病毒性腹泻病毒山东株的分离与鉴定

牛病毒性腹泻病毒是牛病毒性腹泻-黏膜病的重要病原体,该病毒病是极为复杂、呈多临床类型表现的传染病,给世界养牛业造成了巨大的经济损失。本研究从疑似牛病毒性腹泻-黏膜病的粪便中分离得到一株病毒能使MDBK细胞产生细胞病变,经RT-PCR检测及扩增产物测序进一步证实,该病毒为牛病毒性腹泻-黏膜病病毒,TCID50测定该病毒的滴度为107.15TCID50/ml。该病毒株的分离鉴定为牛病毒性腹泻病毒疫苗的研制奠定了基础。     

牛病毒性腹泻-粘膜病病毒地方株的分离及RT-PCR鉴定

自疑似牛病毒性腹泻-粘膜病的流产奶牛粪便及血液中分离得到一株不产生细胞病变的病毒,经双抗体夹心ELISA检测及RT-PCR扩增进一步证实该病毒为牛病毒性腹泻-粘膜病病毒。     

2014—2018年猪流行性腹泻病毒N基因遗传变化分析

为了解猪流行性腹泻病毒(PEDV)N基因的分子流行病学情况,采用RT-PCR方法对2014—2018年采集到的河南、河北、山东、山西、甘肃、湖北、江西以及上海8省市共205份疑似PEDV阳性病料进行PEDV检测,使用RT-PCR方法扩增得到PEDV的N基因片段,回收PCR产物并与pMD20-T载体进行连接,挑选阳性克隆进行测序,分析研究PEDV遗传变异情况。结果显示,205份样品中,有191份样品为PEDV阳性,共得到19株PEDV的N基因序列,N基因全长均为1 326 bp,没有碱基的缺失和插入;将检测到的PEDV的N基因序列与国内外分离株进行比对发现,核苷酸的同源性为94.8%～99.5%,氨基酸的同源性为95.0%～99.3%。进化树分析发现,得到的19株N基因序列与CV777、CH-S等国内外毒株亲缘关系较远;其中,16株与MN、USA-Indiana-2013、USA-Iowa107-2013等近年分离株在一个分支上,为G2a亚群;CH-HENWZ-2015、CH-HENPY-2014、CH-HENZMDPY-2017这3株序列形成另一个分支,为G2b亚群。综上可知,我国PEDV流行广泛,病毒变异频繁。研究结果可为新型疫苗研发以及检测方法的建立奠定基础。     

猪流行性腹泻病毒5株安徽流行株M基因的克隆与序列分析

为了解安徽省猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的遗传变异,对5株PEDV安徽流行株M基因进行RT-PCR扩增、序列测定和分析。结果表明,5株PEDV安徽流行毒株M基因的全长均为681 bp,编码226个氨基酸,核苷酸同源性为99.1%～99.9%,其与国内外PEDV参考毒株核苷酸同源性为96.9%～100%。进化树分析显示,5株流行毒株与CV777、attenuated DR13、LZC和CHS亲缘关系较远,与2011年后国内外PEDV分离株的亲缘关系较近。     

猪传染性胃肠炎病毒福建株的分离鉴定

采集福建省某猪场爆发的疑似病毒性腹泻的病死仔猪病料,利用ST细胞从病死仔猪空肠及肠系膜淋巴结材料中分离获得1株病毒,对该病毒进行快速金标检测、电镜形态学观察、中和试验及RT-PCR鉴定后,证实该分离株为TGEV,命名为TGEV福建分离株(TGEV-FJ)。该分离毒在ST细胞上的毒价约为10-6.75.(100μL)-1。TGEV-FJ株N基因全长1 149bp,编码382个氨基酸,将该基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列与GenBank中TGEV参考毒株进行比较分析,两者核苷酸的同源性为95.4%～99.8%,氨基酸同源性为96.1%～100%。     

猪流行性腹泻病毒ORF3基因的克隆及序列分析

为研究2015年重庆市荣昌部分腹泻猪场是否有猪流行性腹泻病毒的感染与流行,对猪流行性腹泻病毒ORF3(Open reading flame 3)基因进行克隆及序列分析研究。通过从疑似流行性腹泻病毒感染的猪场采集小肠组织,采用RT-PCR方法对猪流行性腹泻病毒的ORF3基因进行克隆。结果表明,所获得的ORF3基因ORF长675bp,编码223个氨基酸。通过DNAMAN软件分析,表明本研究中克隆的ORF3基因与CV777标准株(AF353511)的ORF3基因相似性为96.45%,与中国的NJ(KJ642645)的相似性最高,为99.41%,与attenuated DR13疫苗株(EU054930)相似性90.52%,而与CV777疫苗株(GU372744)相似性仅79.07%。系统进化树分析表明,该基因与中国毒株、韩国毒株以及美国分离株USA/Illinois 201/2014(KR265795)处于同一进化分支上,而attenuated DR13疫苗株、CV777 truncated疫苗株和欧洲的CV777标准株处于另一个进化分支上,说明该基因与中国毒株、韩国毒株的遗传距离最近。通过B细胞抗原表位预测分析,发现其氨基酸第65~68、114~116、137~140和150~154区域可能有潜在的优势抗原表位。成功克隆了猪流行性腹泻病毒ORF3基因,说明2015年重庆市荣昌部分腹泻猪场存在猪流行性腹泻病毒的感染。     

利用玉米作为生物反应器表达PEDV中和表位抗原蛋白

以玉米为生物反应器,将猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）主要中和抗原表位（core neutralizing epitope, COE）基因导入玉米自交系,获得了高效表达PEDV\|COE的转基因玉米稳定株系。首先,根据玉米密码子的偏好性,设计合成优化的COE编码基因,构建了植物表达载体pBAC9036。然后,利用PDS1000/He基因枪转化玉米幼胚,经过愈伤组织诱导、分化再生培养,获得71株转化再生植株,进而通过田间草甘膦抗性筛选,获得2个T1代转基因玉米稳定株系。通过PCR、RT\|PCR、间接ELISA和Western blot等鉴定结果显示,COE基因已成功整合到玉米基因组并进行了转录和蛋白表达。并且种子中COE蛋白占可溶性总蛋白的0.122％和0.078％。最后,提取转基因玉米稳定株系的种子可溶性蛋白,与佐剂混合皮下注射免疫小鼠并取可溶性蛋白灌胃免疫小鼠,均可产生针对PEDV抗原的特异性抗体。获得的转基因玉米可有效表达COE蛋白,表达产物具有显著的免疫原性,为进一步研制PEDV\|COE转基因玉米疫苗奠定了基础。