禾谷镰刀菌蔗糖转运蛋白FgSut1和FgSut2的鉴定及功能研究

小麦赤霉病是以禾谷镰刀菌为优势种的镰刀菌复合种群引起的一种影响小麦产量和粮食安全的重大真菌病害。蔗糖转运蛋白在禾谷镰刀菌中的功能尚不明确。本研究通过与裂殖酵母蔗糖转运蛋白Sut1的氨基酸序列同源比对鉴定到禾谷镰刀菌蔗糖转运蛋白FgSut1和FgSut2,通过基因敲除获得禾谷镰刀菌的Fgsut1、Fgsut2突变体和Fgsut1Fgsut2双敲突变体。研究表明：Fgsut1、Fgsut2突变体和Fgsut1Fgsut2双敲突变体的营养生长、产孢、有性生殖和产毒过程均没有出现缺陷。在葡萄糖为单一碳源的培养基上Fgsut1突变体的生长速率减缓,Fgsut1Fgsut2双敲突变体生长速率下降更显著。Fgsut1Fgsut2双敲突变体在果糖和麦芽糖为碳源的平板上生长速率减缓,说明FgSut1和FgSut2对碳源的利用存在功能的分化和冗余。在小麦穗和小麦胚芽鞘接种实验中,Fgsut2突变体和Fgsut1Fgsut2双敲突变体的致病力降低,说明FgSut2可能在禾谷镰刀菌侵染过程中发挥主要作用,FgSut1和FgSut2在侵染过程存在功能冗余。本研究将禾谷镰刀菌在生长发育过程中对碳源吸收、毒素合成及...     

禾谷镰刀菌缺氧诱导脱氢酶参与发育和致病性

缺氧诱导脱氢酶(hypoxia-induced dehydrogenase,HorA)参与辅酶Q(coenzyme Q,CoQ)的生物合成.在禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)基因组中确定了一个缺氧诱导脱氢酶基因,命名为FgHorA.通过同源重组的方法获得FgHorA敲除突变体.研究发现,FgHor...     

FAC1基因对禾谷镰刀菌的菌丝膨大处细胞核分裂的影响

 与大多数丝状真菌一样,禾谷镰刀菌中也存在依赖cAMP信号调节的蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)信号通路-cAMP-PKA信号通路。前期研究发现,该信号通路在脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol, DON)的合成中扮演着重要角色。FAC1作为cAMP-PKA信号通路上游基因,它的缺失可导致DON无法合成。本研究发现,FAC1的缺失可严重影响DON合成相关基因TRI1在转录水平和翻译水平上的表达。显微观察发现,Tri1定位在细胞核周围,并且与野生型菌株PH-1相比,fac1突变体在产毒培养基内菌丝膨大结构的形成增多。此外,与未膨大菌丝相比,野生型菌株PH-1菌丝膨大结构处细胞核分裂明显增多,该位点多于4个细胞核的比例达到65.4%,而fac1突变体中菌丝膨大结构处核分裂数仅为0~3个,其中0~2个的占90.7%。研究结果表明,在产毒培养基中特有形成的菌丝膨大结构与DON合成之间并没有必然联系, DON毒素的合成应与菌丝膨大结构处细胞核分裂密切相关。     

禾谷镰刀菌脂质转运蛋白Vps13的功能分析

 Vps13蛋白家族是真核生物中高度保守的一类脂质转运蛋白,其在丝状真菌中的功能尚不清楚。小麦赤霉病主要由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)引起,是小麦最重要病害之一。禾谷镰刀菌含有酿酒酵母VPS13的一个同源基因FgVPS13。通过同源重组的方法获得禾谷镰刀菌FgVPS13敲除突变体。研究表明,FgVPS13敲除突变体出现生长、产孢和有性生殖的缺陷。FgVPS13敲除突变体在小麦胚芽鞘和麦穗上的致病力下降,产生的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)毒素含量也明显降低。而且,FgVPS13抑制线粒体自噬。总之,FgVPS13参与调控禾谷镰刀菌菌丝生长、无性和有性生殖、致病力和线粒体自噬。     

脱氧雪腐镰刀菌烯醇( DON) 在小麦籽粒中的积累分析

 镰刀菌产生的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)污染小麦后对人畜具有较大的毒害作用。为明确DON毒素在小麦籽粒中的积累数量及其与镰刀菌菌株、接菌数量、小麦品种和病害严重度的关系,试验采用单花滴注方法在5个抗病性不同的小麦品种上分别接种9 个禾谷镰刀菌菌株,每个菌株接种1 × 106 、1 × 105 和1 × 104 个/ mL 3 个分生孢子浓度,并利用ELISA 法测定收获麦粒中DON 毒素含量。结果表明,麦粒中DON 毒素含量差异主要是由于不同禾谷镰刀菌菌株产生毒素能力不同所致。接种菌株8003、4020 的所有麦粒中DON 毒素含量均显著高于相同条件下接种其他7 个菌株的小麦。当接种产毒素能力强的菌株时,小麦抗病品种表现出在一定程度上降低DON 毒素积累的能力。不同接菌浓度对小麦赤霉病的发病程度和麦粒中DON 毒素含量有显著影响,在相同条件下,接菌浓度越高,病害严重度越高,DON 毒素含量也越高;反之,接菌浓度越低,病害严重度越低,DON 毒素含量也越低。     

禾谷镰刀菌蛋白激酶FgSid1的功能研究

 实验室前期已经对禾谷镰刀菌中116个蛋白激酶进行了鉴定,发现FgSID1基因(FGSG_07344)敲除突变体在有性生殖过程中存在严重缺陷,但其在禾谷镰刀菌中的具体功能却未被详细报道。本研究通过表型分析和亚细胞定位等实验明确了FgSid1在营养生长、有性发育和致病性等方面的功能。本研究发现FgSID1基因敲除突变体菌落生长速度显著变慢,分生孢子隔膜数量减少且产孢量下降;在有性生殖阶段,FgSID1基因敲除突变体的子囊壳形态和大小均正常,但子囊畸形且子囊孢子形成有缺陷;此外,FgSID1基因敲除突变体只能侵染接种小花,而无法扩展到穗轴及临近的小穗,且接种点的小麦籽粒DON毒素含量显著下降;研究还发现FgSID1基因敲除突变体的分生孢子、营养菌丝和子囊孢子的分隔中均含有多个细胞核;本研究又通过亚细胞定位实验发现FgSid1定位于微管组织中心。因此,蛋白激酶FgSid1可能通过参与禾谷镰刀菌无性和有性阶段的细胞分裂影响禾谷镰刀菌的营养生长、分生孢子和子囊孢子的发育以及侵染能力。     

禾谷镰刀菌内吞蛋白FgSyp1的功能研究

内吞作用在细胞的营养吸收和信号转导过程中起重要作用。在真核生物中Syp1和Ede1是网格蛋白介导内吞的早期蛋白成员。禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)引起的小麦赤霉病严重影响小麦产量和品质。禾谷镰刀菌含有酿酒酵母SYP1的一个同源基因FgSYP1。酵母双杂交表明禾谷镰刀菌FgSyp1与FgEde1存在互作关系。利用同源重组的方法得到ΔSyp1突变体和ΔΔSyp1/Ede1双敲突变体,通过生长、产孢和致病性等实验测定禾谷镰刀菌FgSyp1功能。研究表明FgSyp1在禾谷镰刀菌菌丝生长、无性生殖和致病性发挥重要作用,ΔΔSyp1/Ede1双敲突变体在无性和有性生殖方面表现出比ΔSyp1突变体更显著的效果。     

小麦品种对禾谷镰刀菌毒素的抗性研究

 黄化小麦芽鞘生物测定法是一种敏感的生物测定方法,可用于探测禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)所产生的毒素的生物活性和不同小麦品种对这些毒素的反应。不同毒素的生物活性与不同小麦品种对毒素的反应均有显著差异,以deoxynivalenol的生物活性最强,抗赤霉品种望水白对供试7种毒素的敏感性最低。试验对毒素与品种之间的相互作用也作了初步研究。     

禾谷镰刀菌和稻瘟病菌基因组中的微卫星序列比较

利用禾谷镰刀菌Fusarium graminearum和稻瘟病菌Magnaporthe grisea基因组测序结果,对这两种植物病原真菌基因组中的微卫星(SSR)序列进行了系统地分析和比较.结果表明,在禾谷镰刀菌基因组中,共发现4679个SSR序列,总长度为96.2kb,占基因组全长的0.27%.平均7.7kb碱基中有一个大于15 bp的SSR序列.在稻瘟病菌基因组中共发现16398个SSR系列,其总长度达到330kb,约占整个基因全长的0.85%,平均2.36kb碱基中就分布有1个SSR序列.在禾谷镰刀菌基因组中,数量最多的是五碱基重复序列,其次是六碱基重复序列;稻瘟病菌基因组中数量最多的是单碱基重复序列,其次为三碱基重复序列和五碱基重复序列.两基因组中数量最少的都是二碱基重复序列.尽管这两种植物病原真菌都属子囊菌,基因组大小也十分接近,但无论是在SSR的总体数量上,还是在各类SSR的分布上,两种植物病原真菌都存在十分显著的差别.     

RNA-Seq解析cAMP促进禾谷镰孢菌DON毒素产生的分子基础

 禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)引起的小麦赤霉病(Fusarium head blight)不仅造成小麦产量损失,而且病菌在侵染过程中会释放大量真菌毒素,导致小麦籽粒污染,严重威胁人畜健康。实验室前期研究发现外源添加环磷酸腺苷(cAMP)可以促进禾谷镰孢菌脱氧雪腐镰孢菌烯醇毒素(Deoxynivalenol, DON)产生,但其分子机制尚不清楚。本研究利用转录组分析了cAMP处理后禾谷镰孢菌基因的表达情况,探究了cAMP促进DON毒素合成的潜在机制。研究发现响应cAMP处理的差异表达基因有4 470个,其中1 818个基因上调,2 652个基因下调。负责DON毒素合成TRI基因簇的所有基因在cAMP处理下均上调表达,表明cAMP通过诱导TRI基因簇表达促进DON毒素合成。进一步分析了cAMP下游依赖性蛋白激酶A(PKA)的敲除突变体Δpka的转录组数据,发现几乎所有TRI基因簇基因均下调表达,并且cAMP处理上调表达而Δpka突变体中下调表达的基因中显著富集真菌毒素代谢相关的基因,该结果进一步表明cAMP通过PKA通路调控DON毒素合成。此外,cAMP处理后,可诱导DON毒素产生的γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid, GABA)合成相关基因上调表达,而GABA分解相关基因下调表达。这表明禾谷镰孢菌可通过调节细胞内的GABA水平促进DON毒素合成。     

禾谷镰孢菌FgCYP51B蛋白Y137H影响分生孢子及子囊孢子发育

<正>小麦赤霉病(Fusarium Head Blight,FHB),主要是由镰刀菌属真菌引起的一种流行性毁灭性病害。在世界各小麦种植区尤其是温暖潮湿和半潮湿地区发生最为严重~([1,2])。它不仅能够降低小麦产量,其染病麦粒中还会产生对人畜健康严重危害的真菌毒素~([3])。在不同的地区由于气候因素和地理环境的不同,分布着不同的致病菌株。在我国,     

FgLEU1在禾谷镰刀菌亮氨酸生物合成及产毒致病中起关键作用

为挖掘新型药剂的潜在靶标,利用靶向基因敲除和互补技术研究赤霉病病原菌禾谷镰刀菌Fusarium graminearum中必需氨基酸亮氨酸合成酶编码基因FgLEU1的功能,并测定禾谷镰刀菌的生物学表型。结果表明,FgLEU1编码亮氨酸合成途径中的3-异丙基苹果酸脱水酶,其敲除突变体表现亮氨酸营养缺陷。生物学表型测定结果显示,与野生型菌株相比,FgLEU1敲除突变体的产孢量和孢子萌发率显著下降,产孢量仅为野生型菌株的20.96%,培养4 h后孢子萌发率下降了49.45%,且合成脱氧雪腐镰刀烯醇（呕吐毒素）能力丧失,在麦穗上的致病力下降,仅能侵染接种小穗,赤霉病症状不能扩展。外源添加一定量的亮氨酸、FgLeu1催化产物或导入含启动子的全长FgLEU1基因可以恢复敲除突变体表型缺陷。表明FgLEU1基因在禾谷镰刀菌亮氨酸合成、菌丝孢子形成及产毒致病过程中发挥着重要作用,可作为新型安全杀菌剂的潜在研发靶标,用于持续有效控制麦类赤霉病和镰刀菌毒素。     

禾谷镰刀菌中硝基单加氧酶的功能分析

 硝基单加氧酶(nitronate monooxygenase, NMO)将硝基烷烃氧化成相应的羰基化合物和亚硝酸盐。尽管硝基单加氧酶的生化特性在少数真菌中得到了深入解析,但是在植物病原真菌中关于其生物学功能的报道很少。本研究通过同源比对,在禾谷镰刀菌(Fusarium graminearium)中鉴定到了5个硝基单加氧酶,利用基因敲除获得了相应的单敲突变体。通过表型分析发现,基因缺失突变体ΔFgNMO1-5的生长速率、菌落形态以及致病力与野生型相比均未发生明显变化,说明硝基单加氧酶之间存在部分功能冗余。突变体ΔFgNMO1、ΔFgNMO4和ΔFgNMO5的分生孢子产量降低了约50%。通过融合绿色荧光蛋白进行功能回补发现,禾谷镰刀菌中这5个硝基单加氧酶在细胞内发挥催化功能的场所存在差异。     

禾谷镰刀菌中硝基单加氧酶的功能分析

硝基单加氧酶(nitronate monooxygenase, NMO)将硝基烷烃氧化成相应的羰基化合物和亚硝酸盐。尽管硝基单加氧酶的生化特性在少数真菌中得到了深入解析,但是在植物病原真菌中关于其生物学功能的报道很少。本研究通过同源比对,在禾谷镰刀菌(Fusarium graminearium)中鉴定到了5个硝基单加氧酶,利用基因敲除获得了相应的单敲突变体。通过表型分析发现,基因缺失突变体ΔFgNMO1-5的生长速率、菌落形态以及致病力与野生型相比均未发生明显变化,说明硝基单加氧酶之间存在部分功能冗余。突变体ΔFgNMO1、ΔFgNMO4和ΔFgNMO5的分生孢子产量降低了约50%。通过融合绿色荧光蛋白进行功能回补发现,禾谷镰刀菌中这5个硝基单加氧酶在细胞内发挥催化功能的场所存在差异。     

Development of PCR assays to Tri7 and Tri13 trichothecene biosynthetic genes, and characterisation of chemotypes of Fusarium graminearum, Fusarium culmorum and Fusarium cerealis

Fusarium graminearum, Fusarium culmorum and Fusarium cerealis are major causal agents of Fusarium Head Blight (scab) which is a disease of global significance in all cereal growing areas. These fungi produce trichothecene mycotoxins, principally nivalenol (NIV) and deoxynivalenol (DON). Genes Tri13 and Tri7 from the trichothecene biosynthetic gene cluster convert DON to NIV (Tri13) and NIV to 4-acetyl-NIV (Tri7). We have developed positive–negative PCR assays based on these two genes, which accurately indicate a DON or NIV chemotype in F. graminearum, F. culmorum and F. cerealis. These assays are useful in assessing the risk of trichothecene contamination, and can be informative in epidemiological studies. All NIV chemotype isolates studied have functional copies of both Tri13 and Tri7, and all DON-producing isolates have both genes disrupted or deleted. We have identified several mutations in these genes, which are conserved across F. graminearum lineage, RAPD and SCAR groupings and between the three species. There appears to be evidence of inter-species hybridisation within the trichothecene biosynthetic gene cluster.