KLF3基因3'-UTR区双荧光素酶报告载体及其突变载体的构建与活性鉴定

试验旨在构建锌指蛋白3（KLF3）基因3'-UTR区双荧光素酶基因报告载体及其突变载体,初步分析可能调控KLF3基因表达的miRNAs。首先通过PCR方法扩增KLF3基因的3'-UTR序列,将其克隆到经Xho Ⅰ、Not Ⅰ双酶切的双荧光素酶报告载体中;运用Targetscan软件预测可能与KLF3基因3'-UTR相互作用的miRNA;使用脂质体2000转染试剂将miRNAs mimics与构建好的KLF3基因3'-UTR段双荧光素酶报告载体或突变载体共转染于常规培养的293T细胞中,检测荧光素酶活性。结果表明,KLF3基因3'-UTR可能是miR-21的作用靶位点;双荧光报告显示,miR-21 mimics组（0.6900±0.0144）比突变组（1.000±0.0688）和空白对照组（1.000±0.0159）KLF3基因3'-UTR双荧光素酶基因报告载体和突变载体的活性降低了31%（P<0.01）。本试验成功构建了含有KLF3基因3'-UTR段双荧光素酶基因报告载体与突变载体,初步证实miR-21对KLF3基因有调控作用。     

绵羊INHBB、SMAD4和FGF18基因的双荧光素酶载体构建及其与miR-370-3p的靶向验证

为研究绵羊输卵管功能相关的oar-miR-370-3p与抑制素亚基βB （inhibin subunit beta B,INHBB）、SMAD家族成员4（SMAD family member 4,SMAD4）和成纤维细胞生长因子18（fibroblast growth factor 18,FGF18）基因之间的靶向关系,本研究对多个物种（绵羊、人、小鼠、大鼠、猕猴、豚鼠和兔）中miR-370-3p的序列进行了比对,利用RNAhybrid程序预测绵羊miR-370-3p与INHBB、SMAD4和FGF18基因的3'UTR可能存在的结合位点,随后分别构建INHBB、SMAD4和FGF18基因3'UTR的野生型和突变型双荧光素酶载体,并将其与miR-370-3p mimics、mimics NC共转染至HEK293T细胞,检测双荧光素酶活性。结果表明,绵羊miR-370-3p序列与其他6个物种不同,但具有一定的保守性。RNAhybrid程序预测到oar-miR-370-3p与INHBB、SMAD4和FGF18基因的3'UTR存在结合位点。PCR扩增结果和测序结果表明,INHBB、SMAD4和FGF18基因3'UTR的野生型和突变型载体构建成功。共转染INHBB、SMAD4和FGF18野生型载体和miR-370-3p mimics的双荧光素酶活性极显著或显著低于相应的对照组（P<0.01;P<0.05）;而3种突变型载体和miR-370-3p mimics共转染的双荧光素酶活性均与相应的对照组无显著差异（P>0.05）。表明INHBB、SMAD4和FGF18基因的3'UTR区域均能与miR-370-3p结合并抑制双荧光素酶活性,验证了INHBB、SMAD4和FGF18基因均是miR-370-3p的靶基因,为进一步研究oar-miR-370-3p影响绵羊输卵管功能与绵羊繁殖力的分子机制提供依据。     

miR-302d的载体构建及其与Tle4基因的靶向关系验证

试验旨在探究精原干细胞（SSCs）形成过程中的关键miR-302d行使功能的分子机制。试验克隆mi R-302d前体序列并连入PGMLV-CMV-MCS-EF1-Zs Green1-T2A-Puro构建mi R-302d过表达载体（mi R-302d mimics）;合成mi R-302d的干扰靶点并连入PGMLV-SC5载体构建mi R-302d干扰载体（mi R-302d inhibitor）。通过生物信息预测获得mi R-302d靶基因并构建其3′UTR的野生型（WT）和突变型载体（MT）;将mi R-302d过表达载体分别与WT和MT载体共转染DF-1和293T细胞,检测靶基因3′UTR的活性。同时检测在DF-1细胞中过表达或干扰mi R-302d后靶基因的表达变化。结果显示：成功构建mi R-302d的过表达和干扰载体;预测结果显示Tle4为mi R-302d的潜在靶基因,且该基因为ESCs分化为SSCs过程的重要基因;双荧光素酶活性检测结果显示不论是在DF-1还是293T细胞中,与转染WT+mi R-NC组相比,转染WT+mi R-302d组的双荧光素酶活性显著下降（P&l...     

猪VEGFA 3′UTR生物信息学分析及其与miR-361-5p的靶向验证

为了扩增并分析猪卵泡颗粒细胞中血管内皮生长因子A(VEGFA)基因3编码区(3′UTR)序列、构建VEGFA 3′UTR荧光素酶报告质粒以及利用双荧光素酶报告基因验证miR-361-5p与VEGFA 3′UTR的靶向关系,试验通过RT-PCR扩增VEGFA 3′UTR,并用生物信息学方法分析预测其保守性及潜在的互作miRNA,最后将扩增的VEGFA 3′UTR序列克隆至荧光素酶报告载体中,与miR-361-5p mimics(试验组)或NC mimics(对照组)共同转染293细胞,通过双荧光素酶报告系统检测两组细胞的荧光素酶活性,从而鉴定miR-361-5p与VEGFA 3′UTR的靶向关系。结果表明:在猪卵泡颗粒细胞中成功扩增了VEGFA基因3′UTR序列,其在哺乳动物中保守性较高,有多个潜在miRNA结合位点;成功构建了VEGFA基因3′UTR荧光素酶报告质粒,证明了miR-361-5p可以直接作用于VEGFA基因3′UTR,抑制其荧光素酶活性。     

荧光素酶基因报告载体的构建

为筛选和验证人工锌指核酸酶的活性,本研究基于SSA原理,采用LA-PCR法和基因工程操作技术构建了1个荧光素酶基因报告载体.经菌落PCR、限制性内切酶鉴定及DNA测序验证表明,锌指核酸酶筛选验证的报告载体构建成功,为进一步开展锌指核酸酶技术研究提供了试验平台.     

猪E2F3基因3′UTR双荧光素酶报告基因质粒构建及其与miR-10a-5p的靶向验证

为了鉴定miR-10a-5p与猪E2F3基因的靶向关系,试验从生物信息miRNA Base数据库查询miR-10a-5p的相关信息,并运用MEGA 6.0软件分析其保守性,通过Target Scan生物信息学网站预测其潜在的靶基因及结合位点,然后PCR扩增E2F3基因3′非编码区(3′UTR)片段,构建E2F3的野生型(E2F3-3′UTR-wt)和突变型(E2F3-3′UTR-mut)双荧光素酶报告基因质粒,并分别与miR-10a-5p mimics、mimics NC共转染至293T细胞中,检测双荧光素酶活性变化。结果表明:miR-10a-5p在7个物种间具有高度保守性,成熟序列均为UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGU;Target Scan生物信息学网站预测到miR-10a-5p具有包括E2F3基因在内的共241个潜在的靶基因;E2F3基因片段经PCR扩增获得大小约1 288 bp的清晰条带,测序结果与预期一致;转染miR-10a-5p mimics能显著降低猪E2F3基因野生型质粒双荧光素酶活性(P0.05)。说明猪E2F3基因3′UTR双荧光素酶报告基因质粒构建成功,且其与miR-10a-5p之间存在靶向关系。     

肉牛肝脏miR-23a的靶基因及生物学功能预测

通过探究运输应激肉牛肝脏中miR-23a的表达变化,探究肉牛肝脏miR-23a与应激可能存在的关系,并对其进行生物学功能预测,深入探析miR-23a生物学功能.将10头肉牛随机分为运输0 h组、和运输6 h组,80 km/h的速度进行公路运输刺激.运用高通量测序技术筛选差异表达的肝脏miRNAs,采用生物信息学分析方法...     

细毛羊皮肤毛囊miR-1298-5p的靶基因预测及验证

为探讨miR-1298-5p及其靶基因与细毛羊毛囊生长发育的关系,本实验以乾华肉用美利奴羊不同发育时期皮肤毛囊组织为材料,通过生物信息学方法预测miR-1298-5p的靶基因,采用RT-PCR和Western Blot对miR-1298-5p及其靶基因进行定量检测;扩增靶基因3'UTR区,构建野生型和突变型靶基因表达载体后与miR-1298-5p mimics共同转染到HEK293T/17细胞中,利用双荧光素酶报告基因实验验证miR-1298-5p与靶基因的靶向关系。结果表明:FGF_2基因3'UTR区含有miR-1298-5p结合位点,FGF_2为miR-1298-5p潜在靶基因,通过核酸水平和蛋白水平定量表达规律发现miR-1298-5p与靶基因FGF_2呈负相关,初步确定FGF_2为miR-1298-5p的靶基因。双荧光素酶报告基因实验显示,miR-1298-5p mimics能够抑制野生型FGF_2的靶位点报告载体的荧光素酶活性;但当靶基因结合位点突变后,FGF_2被抑制的荧光素酶活性能够得到恢复。综上,miR-1298-5p与FGF_2有靶向关系,miR-1298-5p能通过负调控FGF_2的表达调控羊毛囊发育。     

PGL3-insulin Luciferase质粒的构建与功能鉴定

糖尿病是一种由于胰岛素分泌绝对或相对不足而导致的以高血糖为特征的全球性疾病。近年来随着基因重组和基因转移技术的迅速发展,基因研究成为研究糖尿病发病机理的一条新途径。用质粒PGL3-Basic作为载体,将胰岛素2启动子(insulinⅡpromoter)插入其中,构建带有荧光素酶报告基因的质粒,转染入胰岛β细胞MIN6中进行葡萄糖诱导试验,以利用双荧光素酶报告基因系统检测胰岛素分泌情况。结果表明,葡萄糖浓度依赖性的诱导胰岛素报告基因的表达。该灵敏的胰岛素报告基因载体的成功构建,为研究胰岛素的分泌提供了一个有力的工具,有利于糖尿病等疾病的研究和治疗。     

兔microRNA-18b生物信息学分析及其与CDK19的靶向验证

为探究miR-18b对兔卵巢颗粒细胞增殖凋亡的作用及潜在调控靶点,利用生物信息学技术预测兔miRNA-18b(ocu-miR-18b)的靶基因及其可能参与的生物学过程。预测结果发现靶基因的功能注释分析显著富集在细胞增殖和凋亡的调控等过程,而其中CDK19可能是miR-18b的潜在靶基因。为验证假设,将扩增的野生型及突变型的CDK19 3'UTR序列分别克隆至荧光素酶报告载体中,与miR-18b的mimics(试验组)或mimics NC(对照组)共同转染至HEK293T细胞。通过双荧光素酶报告系统检测细胞的荧光素酶活性,鉴定miR-18b与CDK19 3'UTR的靶向关系。并且通过qRT-PCR检测miR-18b对靶基因的调控作用。结果表明:成功构建了CDK19基因3'UTR荧光素酶报告质粒,证明了miR-18b可以作用于CDK19基因3'UTR,抑制其荧光素酶活性。此外,qRT-PCR分析表明,miR-18b与CDK19表达模式相反。从而证明了miR-18b与CDK19的直接靶向关系,为更深入研究miR-18b与卵巢颗粒细胞的关系奠定基础。     

DKK2基因质粒的构建及其在敖汉细毛羊成纤维细胞中表达量的研究

本研究旨在探究DKK2基因过表达后在敖汉细毛羊成纤维细胞中的表达量变化.采集40日龄敖汉细毛羊胎羊皮肤组织作为实验样品,首先参照GenBank中绵羊的DKK2基因序列信息进行引物设计,通过PCR反应对DKK2基因进行扩增,并与pGM-T载体进行连接反应,构建了pGM-T-DKK2重组质粒;将克隆载体转化DH5α大肠杆菌...     

miR-61与PIK3R5在绵羊尾部脂肪中的表达及其靶向关系验证

本课题组前期通过高通量测序发现miR-61在湖羊和藏羊的尾部脂肪组织中差异表达,推测其可能在绵羊尾部脂肪沉积的过程中发挥着重要作用。本研究旨在对miR-61的靶基因进行生物信息学预测和分析,验证了miR-61与PIK3R5之间的靶向关系并对miR-61和PIK3R5在绵羊尾部脂肪中的表达进行了分析。结果表明,miR-61启动子区有CEBPA、RUNX2、CEBPB、CTCF和CCAAT等多个转录因子结合位点;靶基因富集分析结果涉及到PI3K-Akt、EMC-receptor Interaction和Focal Adhesion等8个信号通路。双荧光素酶报告基因的结果表明miR-61和PIK3R5之间存在靶向关系。RT-qPCR结果显示,miR-61在湖羊的尾部脂肪组织中的表达显著高于藏羊,此结果与高通量测序结果一致;靶基因PIK3R5在藏羊的尾部脂肪组织中的表达显著高于湖羊;Western Blot结果显示PIK3R5在湖羊中的表达显著高于藏羊。由此推测,miR-61受到CEBPA、RUNX2、CEBPB、CTCF和CCAA等多种转录因子的调控,并通过靶向调控PI3K-Akt信号中的P...     

肉牛肝脏miR-31对运输应激的响应及生物学功能预测

旨在探究运输应激肉牛肝脏中miR-31的表达变化,并对其进行生物学功能预测,从多个方面探讨运输应激与miR-31间的关系。试验将10头体况相似的健康肉牛分为运输0 h组和运输6 h组,以速度为80 km/h进行公路运输应激。运用qRT-PCR方法检测肉牛肝脏组织中miR-31的表达,采用生物信息学分析方法对miR-31进行生物学功能预测。结果表明,与运输0 h组相比,运输6 h组肝脏中miR-31表达量极显著升高(P<0.01)。应用Targetscan、miRWalk、miRDB和miRTarBase 4款软件对miR-31靶基因进行预测,分别预测到427,1 261,122,307个靶基因。通过GO富集分析发现miR-31主要参与细胞过程,生物调节,代谢过程,多细胞生物过程,对刺激的反应等生物过程。其中,RAB27A,PPP2R2A,ARID1A可能是与应激联系密切的靶基因。结果提示,运输应激肉牛肝脏miR-31的上调能够对细胞生长发育、增殖和凋亡等方面产生重要影响。     

牦牛Smad 4基因3′UTR区双荧光素酶载体构建及与bta-miR-146a的靶向验证

旨在鉴定牦牛Smad4基因与bta-miR-146a的靶向关系,为探究它们在牦牛卵巢卵泡发育过程中的可能分子调控机制提供理论基础。利用miRBase数据库和MEGA 6.0软件分析miR-146a在不同物种中的保守性,同时利用TargetScan软件预测其潜在靶基因,通过构建psiCHECK2双荧光素酶报告基因载体进行靶向验证。生物信息学分析结果显示,miR-146a成熟序列在脊椎动物中具有高度的保守性,并预测到178个与卵巢卵泡发育相关的潜在靶基因,从中选取Smad4基因分析发现其3′非编码区域(3′UTR)与bta-miR-146a存在结合位点;进一步成功构建牦牛Smad4基因3′UTR野生型及突变型psiCHECK2双荧光素酶报告质粒,荧光素酶活性检测结果显示,bta-miR-146amimic对牦牛Smad4基因3′UTR野生型报告质粒荧光活性有明显的下调作用,分别与突变型及NC对照组差异显著(P0.05)。本研究初步证实,牦牛Smad4基因是bta-miR-146a的靶基因,从而提示btamiR-146a可能通过调控Smad4基因在牦牛卵巢卵泡发育过程中的表达发挥作用。     

北京黑猪DKK3和CCR1基因多态性检测及其与背膘厚的关联分析

旨在探讨DKK3和CCR1基因多态性及其对北京黑猪背膘厚的影响,以期能够筛选出可用于提高北京黑猪背膘厚性状的分子标记,为北京黑猪优良性状定向选育提供依据。本研究以413头健康的北京黑猪为试验材料,对其进行DNA提取、PCR扩增、基因测序筛选候选基因的SNPs,同时利用SAS 9.2软件对突变位点的不同基因型分别与北京黑猪的六七肋背膘厚和腰荐部背膘厚进行关联分析。结果显示,在北京黑猪DKK3基因的外显子区共检测到10个SNPs,包含1个可变剪切突变、1个错义突变和8个3'UTR突变,其中有4个3'UTR突变位点均与腰荐部背膘厚显著关联(P<0.05),分别为g.47443779 T>C、g.47444258 C>T、g.47444912 G>T和g.47445304 T>C,其余位点与六七肋背膘厚和腰荐部背膘厚均不显著关联(P>0.05)。在CCR1基因的外显子区共检测到3个SNPs,包含2个同义突变和1个错义突变,其中1个同义突变位点g.29229037 G>A与六七肋背膘厚显著关联(P<0.05)。对DKK3的10个SNPs进行连锁不平衡分析,结果显示,g.47443779 T>C和g.47443783 C>T处于完全连锁状态(D’=1),g.47443783 C>T和g.47443858 C>T处于完全连锁状态(D’=1),g.47444258 C>T和g.47444275 C>T呈现高度连锁状态(D’=0.98)。综上所述,DKK3和CCR1基因的SNPs分别与北京黑猪的腰荐部背膘厚和六七肋背膘厚有显著关联性,可为北京黑猪背膘厚的早期分子选育提供参考。     

miR-137-3p靶向MAX基因对前脂肪细胞3T3-L1成脂分化的影响

【目的】研究miR-137-3p在前脂肪细胞(3T3-L1)分化过程中的功能及作用机制。【方法】收集诱导分化第0、2、4、6和8天的3T3-L1细胞,利用实时荧光定量PCR检测miR-137-3p相对表达量;将miR-137-3p的模拟物(mimics)、抑制物(inhibitor)和阴性对照(NC)分别转染3T3-L1细胞并诱导成脂分化,油红O染色观察脂滴形成情况,利用实时荧光定量PCR检测成脂标志基因CAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)、C/EBPβ、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和脂肪酸结合蛋白4(FABP4)相对表达量,用Western blotting检测C/EBPβ、PPARγ和FABP4蛋白表达水平;利用TargetScan在线网站预测miR-137-3p的靶基因,比对候选靶基因3′-UTR区与miR-137-3p结合位点在不同物种间的序列保守性。分别将miR-137-3p mimics、NC与3′-UTR-WT和3′-UTR-Mut载体共转染HEK293T细胞,利用双荧光素酶报告试验检测miR-137-3p与MYC相关因子X(MAX)基因的靶向关系。将s...     

猪miR-23a靶向调控Smad3基因表达的研究

为了确定miR-23a是否靶向调控Smad3基因,试验利用NotⅠ和XhoⅠ酶构建包含Smad3-3′-UTR的野生型(psiCHECKTM-2-W-Smad3-3′-UTR)和突变型双荧光酶报告载体(psiCHECKTM-2-M-Smad3-3′-UTR),并在PK-15细胞中转染miR-23amimics、miR-23ainhibitor及其阴性对照,采用双荧光酶检测试剂盒检测荧光素酶活性,用实时荧光定量PCR和Western blotting法分别检测Smad3基因的mRNA和蛋白表达水平。结果表明,将含Smad3-3′-UTR的野生型和突变型双荧光酶报告载体与miR-23amimic共转染PK-15细胞,野生型报告质粒表达的荧光素酶活性显著低于其阴性对照组(P<0.05);转染miR-23amimics能显著下调Smad3基因mRNA及其蛋白表达水平(P<0.05);而转染miR-23ainhibitor组与miR-23ainhibitor阴性对照组相比,Smad3基因蛋白表达差异不显著(P>0.05)。综合上述结果可知,猪miR-23a可靶向作用于Smad3基因。     

miR-148a-3p靶向PPARγ基因抑制鹅颗粒细胞孕酮的合成

旨在探究miR-148a-3p是否通过靶基因PPARγ调节鹅卵泡颗粒细胞中类固醇激素的合成。本研究选用12只健康的处于产蛋高峰期的天府肉鹅母系母鹅分别用于组织样品采集和颗粒细胞培养。利用qPCR检测miR-148a-3p在鹅不同阶段卵泡颗粒层中的表达;通过MEGA 7软件分析miR-148a-3p在不同物种的保守性,预测miR-148a-3p的靶基因,采用双荧光素酶报告试验验证miR-148a-3p与靶基因的靶标关系;在鹅颗粒细胞中转染miR-148a-3p mimics和inhibitor,qPCR检测miR-148a-3p对靶基因及其下游基因表达水平的影响;同时利用ELISA技术检测激素含量的变化。结果表明,miR-148a-3p在不同物种中高度保守;在鹅卵泡发育过程中,miR-148a-3p的表达量随卵泡直径的增加呈先升高后下降的趋势。在鹅卵泡颗粒细胞体外培养过程中,miR-148a-3p mimics能显著下调3β-HSD的表达（P<0.05）,抑制孕酮的合成（P<0.05）;而miR-148a-3p inhibitor的作用则相反（P<0.05）。生物信息学分析和双荧光素酶报告试验证实,PPARγ为miR-148a-3p的靶基因。在颗粒细胞中,miR-148a-3p mimics能显著降低PPARγ的表达（P<0.05）,而miR-148a-3p inhibitor能显著上调PPARγ的表达（P<0.05）。当干扰PPARγ后,3β-HSD的表达量显著降低（P<0.05）,孕酮的含量也降低。这些结果表明,在鹅等级卵泡颗粒细胞中,miR-148a-3p可靶向结合PPARγ来抑制3β-HSD的表达,从而降低颗粒细胞孕酮的合成。     

敖汉细毛羊DKK1基因重组质粒的构建及其在成纤维细胞中表达量的研究

本研究旨在构建敖汉细毛羊DKK1基因的重组质粒,并对其转染成纤维细胞后基因的表达量变化进行研究。试验采集敖汉细毛羊肱二头肌提取基因组DNA,参照GenBank中DKK1基因序列设计1对引物,PCR扩增获得DKK1基因片段,连接到pEASYTM-T1载体,构建pEASYTM-T1-DKK1重组质粒并转化大肠杆菌（E.coli）DH5α感受态细胞,提取质粒进行酶切鉴定,鉴定正确后构建PmaxGFP-DKK1重组质粒,转化大肠杆菌（E.coli）DH5α感受态细胞;对敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将构建的重组质粒PmaxGFP-DKK1转染成纤维细胞,利用实时荧光定量PCR技术检测DKK1基因在成纤维细胞中的表达量变化。结果显示,经酶切、测序鉴定发现,重组质粒PmaxGFP-DKK1构建成功,大小为3 956 bp,并成功瞬时转染成纤维细胞,转染细胞后DKK1基因的表达量明显升高,且转染组的表达量极显著高于对照组（P<0.01）。试验成功构建了敖汉细毛羊DKK1基因重组质粒,并成功转染成纤维细胞,为进一步研究DKK1基因的功能奠定基础。