用灭活哈维弧菌菌苗浸泡免疫大黄鱼的研究

用经福尔马林灭活的哈维弧菌 (Vibrioharveyi)菌苗对大黄鱼 (Pseudodciaenacrocea)幼鱼进行浸泡免疫接种 ,分别以 1.0× 10 8cells/mL、1.0× 10 7cells/mL和 1.0× 10 6cells/mL的菌液浓度 ,浸泡处理鱼体 1min、10min和 6 0min后 ,放入设置在象山港内的网箱中饲养 ,并且在浸泡免疫接种后的 12 6d内 ,定期检测试验鱼的免疫保护力 (RPS)。结果表明 ,在浸泡免疫接种后的 5 6～ 77d内 ,受免鱼的RPS达到了 95 %～ 10 0 % ,随后RPS稍有下降 ,但是 ,直到免疫浸泡接种后第 112～ 12 6天时 ,供试鱼的RPS仍达到 70 %～ 80 %。从设置在野外的网箱中供试鱼的统计结果看 ,与对照组相比 ,免疫鱼疾病发生较少 ,发病时期推迟 ,病程缩短 ,成活率提高 (80 .0 %～95 .0 % ) ,明显高于对照组。对不同日龄大黄鱼幼鱼进行浸泡免疫的试验结果表明 ,4 0日龄、75日龄和 10 0日龄的大黄鱼幼鱼均能在免疫接种后获得特异性免疫保护力。在第 1次免疫接种 5 6d后以同样方式加强免疫 ,试验鱼在 112d内保持了很高的RPS水平 ,明显地高于同期的 1次免疫接种鱼体。     

哈维氏弧菌的血清型与菌苗抗原性的关系

采用不同血清型哈维氏弧菌Vibrio hanwyi624、809和106等3个菌株，制备成福尔马林灭活菌苗，注射接种大黄鱼4周后，通过血清中凝集、交叉凝集抗体效价测定以及活菌攻毒试验，证明了3个菌株制备的菌苗抗原性存在差异。     

哈维氏弧菌外膜蛋白OmpU的克隆、表达与免疫原性研究

根据已发表的哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)外膜蛋白OmpU的基因序列设计1对特异性引物,应用聚合酶链式反应(PCR)方法,自哈维氏弧菌致病菌株基因组中扩增获得一段约1 000 bp的序列,构建重组载体pMD18-T-OmpU;测序结果表明,该基因与已发表的哈维氏弧菌外膜蛋白OmpU序列存在98%以上的相似性,该序列在GenBank上的登录号为FJ919231.构建表达质粒pET-30a(+)-OmpU后转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3),在IPTG诱导下实现高效表达,SDS-PAGE显示重组蛋白分子质量约为41 ku,与预期基本相符.重组蛋白以包涵体形式表达.以脲素法得到初步纯化的重组蛋白,以50 μg/mL的剂量注射免疫大黄鱼幼鱼,经间接ELISA法检测了4~8周后特异性抗体的效价,同时检测了注射后4周的免疫保护率.结果表明,4~8周内特异性抗体效价持续升高,达到log2 8.0以上,4周时的相对免疫保护率为85%.试验结果显示了重组哈维氏弧菌外膜蛋白OmpU具有良好的免疫原性,可作为亚单位疫苗的开发对象.     

异育银鲫对嗜水气单胞菌灭活菌苗的免疫应答

采用神尔马林灭活的嗜水气单胞菌（Aeromondas hydrophila)菌苗免疫接种异育银鲫，通过测定受免鱼血清中凝集抗体效价，溶菌酶活性，血液中吞噬细胞的吞噬活性，杀菌活性并通过鱼体攻毒试验，探讨了异育银鲫对福尔马林灭活的嗜水气单胞菌菌苗的免疫应答状况，结果表明，接种28d后，受免鱼血清中凝集抗体效价和溶菌酶活性均值分别为1：18.89和156.36U/dml，相应的对照组则为1：0.83和138.68dU/ml；受免鱼血中白细胞吞噬百分比和吞噬指数分别为63.38%和6.02，而对照组的分别库存47.95%和5.08；免疫组和对照组白细胞的杀菌指数分别为1.59和1.15，受免鱼的免疫保护力达到73.7%。     

同腹异育银鲫对鱼类3种致病弧菌粗脂多糖的免疫应答

用从鳗弧菌（Vibrio anguillarun)，哈维氏弧菌（Vibrio harveyi)和副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus)等3种弧菌中提取的菌体粗脂多糖（LPS）作为免疫原，分别经胸鳍基部接种同腹异育银鲫（Carassius auratus gibelio)后，通过测定受免鱼的凝集抗体效价，明和血液中吞噬细胞的吞噬活性和杀菌活性，检测3种弧菌的粗LPS对异有银鲫免疫应答的试验结果。结果表明，3种弧菌的粗LPS对异育银鲫均具有较强的免疫原性，受免鱼的血清中出现对3种弧菌的福尔马林灭活菌体（FKC）的交叉凝集抗体；与对照鱼相比，受免鱼头肾和血液中吞噬细胞的吞噬活性和杀菌活性明显上升，证明在3种弧菌的粗LPS上存在共同保护性抗原，而且这些共同保护性抗原对异育银鲫具有较强的免疫原性。     

哈维氏弧菌粗脂多糖的化学成分分析

从鱼类致病菌中提取的脂多糖(lipopolysac-charide,LPS)作为免疫原接种供试鱼,能诱导受免鱼产生较强的特异性与非特异性免疫应答[1-3],这是因为革兰氏阴性致病菌的LPS上存在菌体的有效抗原并具有佐剂性的缘故[4]。研究结果还证明了因致病菌的种类[1.2]、菌株培养时间[5]、菌株的血清     

利用LAMP法快速检测致病性哈维氏弧菌

从浙江宁波的发病鲈鱼(Lateolabrax japonicus)分离到1株致病性哈维氏弧菌(Vibrio harveyi) LY-1。从该菌的DNA样本中成功扩增出大小为873 bp的ToxR基因片段。DNA序列分析表明:该序列与已登录哈维氏弧菌(Vibrio harveyi) ToxR基因同源性为96.57%,与副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、鳗弧菌(V.anguilarum)、创伤弧菌(V.vulnificus)、费氏弧菌(V.fisheri)、溶藻胶弧菌(V.alginolyticus)、霍利斯弧菌(V.hollisae)、拟态弧菌(V.mimicus)、河弧菌(V.fluvialis)的ToxR基因相似性为27.62%~72.49%。选择哈维氏弧菌ToxR基因种内保守区段,设计1套环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术的特异引物,对扩增条件进行优化实验,在65℃孵育45 min的条件下即可完成哈维氏弧菌特异性扩增,成功建立了海水致病菌-哈维氏弧菌的LAMP快速检测方法。结果分析表明:该方法对哈维氏弧菌DNA的最小检出量为1 fg,比PCR法灵敏度高3个数量级。利用LAMP方法快速检测哈维氏弧菌,目前在国内外还未见报道。     

仔猪水肿病多价油乳剂灭活菌苗在猪体内的免疫原性研究

用自制的仔猪水肿病多价油乳剂灭活菌苗肌肉注射20日龄未接种同类疫苗的长杂健康仔猪，14d后用攻毒菌株（湖北地方分离株及O138、O139、O1413个菌株）攻毒。结果表明每头免疫剂量为0.50mL(含30亿CFU）免疫效果最好，免疫2周后血清抗体几何凝集效价为1:640，保护率达到100%。     

哈维氏弧菌的主要致病因子及其特性分析

从大黄鱼致病菌哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)GYC1108-1株提取外膜蛋白(OMP)、脂多糖(LPS)和胞外产物(ECP),并进行毒性实验,以研究哈维氏弧菌的主要致病因子及其特征.结果表明:OMP、LPS致病性较弱,而ECP可导致鱼死亡,初步得出哈维氏弧菌GYC1108-1株的主要致病因子为胞外产物,其对鱼的半数致死量(LD50)为3.5 μg·g-1;该蛋白酶与底物偶氮酪蛋白(azocasein)作用的最适pH为8.0,最适温度28℃,对热敏感,分子质量为55 ku;该酶活性被碘乙酸抑制,也被SDS和HgCl2完全抑制,PMSF和ZnCl2能部分抑制该蛋白酶活性,而CuCl2、CaCl2、MgCl2对该酶活性影响不大,2-巯基乙醇、DTT、L-半胱氨酸、EDTA和EGTA对该酶活性有促进作用,表明其为半胱氨酸蛋白酶;研究发现ECP具有酪蛋白酶、明胶蛋白酶、淀粉酶、卵磷脂酶和脂肪酶活性,无脲酶活性;免疫印迹结果发现GYC1108-1的ECP能与大黄鱼抗GYC1108-1血清发生免疫发应,分子质量为55 ku的半胱氨酸蛋白酶是具有免疫原性的物质.     

哈维氏弧菌硫氧还蛋白还原酶在大肠杆菌中的表达及对大菱鲆的免疫保护作用

从致病性哈维氏弧菌Vibrio harveyi SF1基因组中扩增获得含硫氧还蛋白还原酶(trxR)基因的1 133bp目的片段,连接至载体pMD19-T Simple。测序结果表明,目的片段含有960 bp trxR基因阅读框,编码为319个氨基酸残基的蛋白质。Blast分析结果显示,硫氧还蛋白还原酶蛋白氨基酸序列与哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌、副溶血弧菌、灿烂弧菌、弗氏弧菌的硫氧还蛋白还原酶蛋白序列的相似性分别为99%、98%、96%、94%、92%。构建表达质粒pET-28a(+)/TrxR后转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析显示,重组蛋白的相对分子质量为34 000。用Ni琼脂糖亲和层析柱分离得到纯化的重组蛋白,将该蛋白以50μg/尾的剂量肌肉注射免疫大菱鲆Scophthalmus maximus,用ELISA法检测免疫1～4周内鱼血清中特异性抗体的效价。结果表明,特异性抗体效价持续升高,第2周则达到1∶128。免疫4周后用哈维氏弧菌SF1对大菱鲆进行人工感染,对照组鱼的死亡率为100%,免疫组鱼的死亡率为25%,相对免疫保护力为75%。试验表明,哈维氏弧菌TrxR蛋白具有较好的免疫原性,可作为潜在的亚单位疫苗用于哈维氏弧菌病的免疫预防。     

三种群银鲫的RAPD分析初报

利用２０个随机引物对产于方正、彭泽和淇河地区的三个银鲫种群进行了ＲＡＰＤ检测结果显示１４个引物的扩增效果良好,单一引物扩增的ＤＮＡ片段数在２￣１３条之间,片段长度在３００￣４０００ｂｐ之间。根据ＲＡＰＤ结果,进行了银鲫种群内、种群间的遗传差异分析。１４个引物中,引物ＯＰＶ－０７、ＯＰＶ－１４和ＯＰＶ－２０等对三种群银鲫扩增出的指纹图谱差异显著,可作为银鲫种群鉴定的分子标记。     

三种群银鲫的RAPD分析初报

利用２０个随机引物对产于方正、彭泽和淇河地区的三个银鲫种群进行了ＲＡＰＤ检测结果显示１４个引物的扩增效果良好,单一引物扩增的ＤＮＡ片段数在２￣１３条之间,片段长度在３００￣４０００ｂｐ之间。根据ＲＡＰＤ结果,进行了银鲫种群内、种群间的遗传差异分析。１４个引物中,引物ＯＰＶ－０７、ＯＰＶ－１４和ＯＰＶ－２０等对三种群银鲫扩增出的指纹图谱差异显著,可作为银鲫种群鉴定的分子标记。     

异育银鲫饲料中适宜脂肪需求量研究

研究异育银鲫（Carassius auratus gibelio）饲料中脂肪的适宜需要量,以鱼粉豆粕为蛋白源、鱼油作为添加的脂肪源,分别添加0、2％、4％、6％和8％的鱼油,配制成5组饲料。对平均体质量每尾（17．00±0．15）g的异育银鲫进行为期45d的养殖试验。结果表明各试验组的饵料系数、蛋白质效率差异不显著（P〉0．05）,饲料中脂肪含量6．04％的试验组饵料系数最低（2．00）、蛋白质效率最高（1．19）、其增重率与饲料中脂肪水平为4．08％的比较差异不显著（P〉0．05）,但与其余各试验组的差异显著（P〈0．05）;饲料中主要营养物质的表观消化率以添加6．04％试验组最高,且粗脂肪、钠及饲料总消化率显著高于对照组（P〈0．05）,但与脂肪水平为4．08％的试验组差异不显著（P〉0．05）。试验表明异育银鲫饲料中脂肪的适宜需求量为4．08％-6．04％。     

壳聚糖对异育银鲫生长和饲料消化率的影响

采用单因子试验设计方法,试验分成4组进行,对照组和3个试验组,每组3个重复.对照组投喂基础饲料,3个试验组分别投喂在基础饲料中添加0.25%壳聚糖、0.50%壳聚糖和1.00%壳聚糖的试验饲料,自然水温下饲养异育银鲫Carassius auratus gibelio 50尾/池[初始体质量为(78.31±2.15)g].64 d后,采用国标常规方法测定异育银鲫肌肉的营养成分,采用国标间接法(以Cr2O3为外源指示剂)测定饲料能量和营养成分消化率,并计算特定生长率、饲料系数、蛋白质效率、蛋白质沉积率、白肌RNA/DNA,旨在探讨壳聚糖对异育银鲫生长、饲料营养成分和能量消化率及利用率的影响.结果表明,饲料中添加0.50%以上的壳聚糖可以显著提高异育银鲫的特定生长率(P<0.05)、蛋白质消化率(P<0.05)和白肌RNA/DNA(P<0.05),显著降低异育银鲫对饲料脂肪的消化率(P<0.05).添加0.50%壳聚糖可以显著降低异育银鲫的饲料系数(P<0.05),显著提高蛋白质效率和肌肉中的蛋白质沉积率(P<0.05),显著提高异育银鲫对饲料能量的消化率(P<0.05).添加0.25%和0.50%壳聚糖可以显著提高鱼体肌肉中的灰分含量(P<0.05).由此看来,在饲料中添加0.50%壳聚糖可以提高蛋白质和能量的消化率和利用率,从而降低饲料系数、促进异育银鲫的生长.     

菜籽粕对异育银鲫免疫应答能力的影响

试验鱼以投喂饲料的不同和是否注射抗原共分为10组,即免疫组:A、B、C、D、E组,免疫对照组:a、b、c、d、e组,饲料对照组:A、a组.饲料试验组B、C、D、b、c、d、e组.其中,饲料对照组以豆粕和鱼粉为基础蛋白源,饲料试验组分别以双低菜籽粕和普通菜籽粕等氮替代对照组中50%(B、b;D、d)和100%(C、c;E、e)的豆粕蛋白,测定异育银鲫血液白细胞和头肾吞噬细胞的吞噬活性、血清溶菌酶活性、血清补体(C3,C4)含量、血清凝集抗体效价及免疫保护率.结果表明:从免疫后21 d开始,饲料试验组E、e、C、c组的各项免疫指标都显著低于相应饲料对照组;在49 d,D、d组的部分免疫指标也显著低于相应饲料对照组;B、b组和相应饲料对照组之间没有显著的变化.免疫组的各项免疫指标均显著高于相对应的投喂相同饲料的免疫对照组.     

精子膜蛋白在异精雌核发育银鲫中的作用

通过对雄性银鲫的新鲜精液进行分级抽提得到精子的不同组份,包括精浆、精头的膜、鞭毛和脱膜精头等,在荷包红鲤和雌性银鲫杂交时加入其中的可溶性精头膜蛋白组分,研究精子膜蛋白在雌核发育银鲫异源受精中的作用。研究发现,加入同源精子膜蛋白后的雌核发育银鲫异源受精卵的孵化率比对照组低很多,并且在子代培育过程中,发现了生长速度快、表型和父本相似、基因型基本和父本基因型相同的特殊子代。在某种程度上表明：精子膜蛋白可能是雌核发育银鲫卵子进行雄核发育的关键因素。     

精子膜蛋白在异精雌核发育银鲫中的作用

通过对雄性银鲫的新鲜精液进行分级抽提得到精子的不同组份，包括精浆、精头的膜、鞭毛和脱膜精头等，在荷包红鲤和雌性银鲫杂交时加入其中的可溶性精头膜蛋白组分，研究精子膜蛋白在雌核发育银鲫异源受精中的作用。研究发现，加入同源精子膜蛋白后的雌核发育银鲫异源受精卵的孵化率比对照组低很多，并且在子代培育过程中，发现了生长速度快、表型和父本相似、基因型基本和父本基因型相同的特殊子代。在某种程度上表明：精子膜蛋白可能是雌核发育银鲫卵子进行雄核发育的关键因素。     

大蒜渣对异育银鲫生长·消化酶活性及免疫功能的影响

[目的]为大蒜渣的合理利用和异育银鲫的健康养殖提供科学指导。[方法]用大蒜渣粉含量分别为0%、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%和5.0%的浮性膨化颗粒饲料饲喂异育银鲫,研究饲料中添加不同比例大蒜渣对异育银鲫生长性能、主要消化酶活性和非特异性免疫功能的影响。[结果]饲料中添加适量的大蒜渣可显著促进异育银鲫生长、降低饲料系数,提高蛋白酶、淀粉酶、溶菌酶和过氧化氢酶活性,降低丙二醛含量。[结论]饲料中大蒜渣的适宜添加量为0.5%～2.0%。