食品中呋哺妥因代谢物酶联免疫检测试剂盒的研制

目的:开发研制快速检测呋喃妥因代谢物的酶联免疫检测试剂盒.方法:依据直接竞争ELISA原理,采用棋盘包被法确定最佳抗体包被浓度和酶标抗原工作浓度、包被条件、反应时间、底物显色时间等,并对试剂盒的各项技术指标进行确认.结果:成功的组装了呋喃妥因的酶联免疫检测试剂盒,并建立了肌肉、肝脏、水产、蜂蜜等的前处理方法,检测限均远低于1μg／kg.该试剂盒线性检测范围为0～4.05ng／mL,IC50浮动范围0.30～0.60ng/mL,样品的板内、批内、批间的变异系数均小于15％,平均回收率在65％～90％之间,与其同类药物的交叉反应率均小于0.2％.结论:本研究研制的试剂盒重复性、再现性、特异性、稳定性各项指标均符合技术要求,可用于动物源性食品中呋喃妥因代谢物残留的检测.     

动物源性食品中齐帕特罗一步法ELISA试剂盒的研制

本研究依据直接竞争ELISA原理建立了齐帕特罗一步法ELISA试剂盒。以齐帕特罗与载体蛋白偶联物作为免疫原免疫新西兰大白兔制得齐帕特罗多克隆抗体,棋盘包被法确定其最佳抗体包被浓度、酶标抗原工作浓度、包被条件、反应时间、底物显色时间等,并对试剂盒的各项技术指标进行确认。结果表明,成功组装了齐帕特罗一步法ELISA试剂盒,并建立了尿液、饲料、奶粉和奶汁,以及组织等样品的前处理方法,检测限均远低于1 μg/kg。该试剂盒线性检测范围为0.15～10 ng/mL,IC₅₀浮动范围0.43～0.79 ng/mL,样品板内、批内、批间的变异系数均小于15%,平均回收率在70%～110%之间,与其同类药物的交叉反应率均小于0.1%。提示,本试验研制的试剂盒重复性、特异性、稳定性等各项指标均符合技术要求,可用于动物源性食品中齐帕特罗药物残留的检测。     

恩诺沙星ELISA快速检测方法的建立

采用活酯法合成酶标记半抗原（ENR-HRP），紫外扫描分析和ELISA方法鉴定，结合比为1．6：1。选择ENR-HRP与游离ENR相竞争的模式建立检测ENR残留的ELISA检测方法，其最佳工作条件为：二抗的包被浓度为2μg／mL，抗体工作浓度1：1000，酶标半抗原工作浓度1：500。标准曲线在0．423～1000ng／mL之间线性关系良好，其IC50为33．76ng／mL，回归方程为Y=-0．07769lnx＋0．770801，相关系数r=0．99153，最低检测限0．423ng／mL。单抗对达氟沙星、培氟沙星、麻保沙星有少许交叉，特异性较好。ELISA检测方法批内平均变异系数为5．75％，批间平均变异系数为10．69％，重复性较好。     

三种氯霉素ELISA检测试剂盒评价

本试验选择三种氯霉素检测试剂盒(分别产于美国(A)、英国(B)和德国(G))及不同的前处理方法对牛奶及鸡肝组织中的氯霉素残留进行检测。从B／Bo-50％抑制浓度、检测范围、标准溶液浓度梯度、板内变异、板间变异、样品添加试验、实际样品检测等方面对三种试剂盒及前处理方法进行对比试验，结果表明试剂盒A、B、G对缓冲液配制的药物标准液的50％抑制浓度均低于1ng／mL；三种试剂盒的检测范围分别为0．1—2．0ng／mL(A)，0．14—21．0ng／mL(B)，0．05—4．05ng／mL(G)；板内变异系数均小于11．3％，板间变异系数均小于17．4％；样品回收率在70％-120％之间。     

酶联免疫法检测动物源性食品中甲羟孕酮的残留

本试验旨在利用酶联免疫技术对鸡肉和鱼肉中的甲羟孕酮药物残留进行检测。经过测试,该试剂盒对鸡肉和鱼肉样本的检测限均为ug／kg;当药物添加浓度为1、2、4ug／kg时,其平均回收率范围是65．5％～94．6％,批内、批间相对标准偏差均小于10％;交叉反应率试验表明该试剂盒的特异性良好：酶联免疫法与仪器法的验证结果一致。     

呋喃妥因代谢物化学发光酶联免疫检测方法的研究

对呋喃妥因代谢物1-氨基乙内酰脲(AHD)进行半抗原改造,采用活化酯法将半抗原与卵清蛋白(OVA)偶联为包被原,与标准品竞争AHD单克隆抗体的抗原结合位点,加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗,建立了AHD间接竞争化学发光酶联免疫(CLEIA)检测法,并对化学发光液、包被原与抗体最优稀释度、包被条件、封闭液和竞争时间五项参数进行优化。结果表明:该方法具有良好的特异性,IC50为0.753 ng/m L,在鸡肉组织中的检测限为0.028μg/kg,添加回收率在80.54%~102.64%之间,变异系数均小于10%。与国标中液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)和我国出入境行业标准中酶联免疫检测法(ELISA)相比,不仅降低了检测限,而且操作简便,为动物源性食品中呋喃妥因代谢物的残留提供了准确、便捷的分析检测手段。     

鸡肉和鸡蛋中金刚烷胺与金刚乙胺残留检测UPLC-MS/MS法研究

建立了鸡肉和鸡蛋中金刚烷胺与金刚乙胺残留检测的超高效液相色谱-串联质谱方法（UPLC-MS／MS）。样品在酸性条件下乙腈提取后,用正己烷去除脂肪,高速离心去除蛋白质等杂质,上机测试。液相色谱条件：色谱柱为BEHC18（50×2．1mm,1．7μm）,流动相为0．1％甲酸乙腈溶液＋0．1％甲酸水溶液,流速0．3mL／min,柱温30cI二,进样量10μL。质谱条件：电喷雾离子源（ESI^＋）,多反应监测（MRM）方式进行采集。结果表明：金刚烷胺与金刚乙胺在2～100ng／mL浓度范围内均呈现良好的线性关系,相关系数（R。）分别为=0．9977和0．9988;鸡蛋和鸡肉中金刚烷胺与金刚乙胺残留检测方法检测限均为1ng／g,定量限均为2ng／g。从鸡肉组织在2、5和10ng／g三个添加浓度检测结果可以看出,金刚烷胺与金刚乙胺的平均回收率分别为79．6％～107．5％和78．4％～101．2％,批内和批间RSD均小于15％。从鸡蛋在2、5和10ng／g三个添加浓度检测结果可以看出,金刚烷胺与金刚乙胺的平均回收率分别为90．8％～111．1％和75．4％～87．4％,批内和批间RSD均小于15％。该方法具有简便快捷、灵敏度高、定性准确等特点。     

酶联免疫检测试剂盒应用于牛奶中四环素残留的测定

为了加强牛奶中四环素残留量的监控，以四环素-卵清白蛋白为包被抗原，四环素-牛血清白蛋白免疫的产生的抗血清为抗体，辣根过氧化物酶-羊抗兔IgG为酶标记物，研制了四环素快速酶联免疫分析试剂盒，在3．9-2000ng/mL四环素标准浓度范围内，呈线性相关，相关系数为0．9882，批内误差小于批间误差，但其变异系数均在10％以下。与土霉素、金霉素的交叉反应分别为24.31％、6．22％。该试剂盒具有快速、灵敏、准确的特点，适用于牛奶中四环素残留量的快速筛选测定。     

猪、牛、鱼组织中四环素类药物残留的测定

以本实验室研制的四环素类药物多残留检测试剂盒为基础，建立了猪、牛、鱼组织中四环素、土霉素、金霉素和多西环素4种药物残留的酶联免疫检测方法。该方法在猪、牛、鱼组织中的检测限均低于13μg/kg，4种四环素类药物最高残留限量浓度添加回收率范围为47．5％～119．4％，批内、批间变异系数在25％以内。检测各种组织中四环素类药物的临界值分别为猪肉49．2μg／kg、猪肝138．7μg／kg、牛肉52．1μg／kg、牛肝124．4μg／kg、鱼肉44．1μg／kg。     

鸡传染性支气管炎ELISA抗体检测试剂盒的研究

利用鸡传染性支气管炎M41株病毒研制了检测鸡传染性支气管炎抗体的ELISA试剂盒。抗原最佳包被浓度为0．973ug／ml，被检血清最佳稀释度为1：200，酶标结合物最适工作浓度1：1200，血清样品阴阳性临界值为0．184。本试剂盒和Aflfinitech的IB试剂盒同时检测56份血清样品，比较结果表明本试剂盒的特异性和敏感性分别为100％和88％。试剂盒保存期试验结果表明，试剂盒可保存6个月。     

新城疫间接ELISA抗体检测试剂盒的研究

利用新城疫Clone30株病毒研制了检测新城疫抗体的ELISA试剂盒。抗原最佳包被浓度为1．086μg／ml，被检血清最佳稀释度为1：100，酶标结合物最佳工作浓度1：800，血清样品阴阳性临界值为0．34。本试剂盒和HIPRA的ND试剂盒检测64份血清相比较，结果表明本试剂盒的特异性和敏感性分别为90％和93．2％。试剂盒保存期试验结果表明，试剂盒可保存3个月。     

高效液相色谱-串联质谱法检测猪肝中苯并咪唑类药物及其代谢物残留

建立了猪肝中阿苯哒唑及其代谢物阿苯哒唑砜、阿苯哒唑亚砜、2-氨基阿苯哒唑砜,噻苯哒唑及其代谢物5-羟基噻苯哒唑,甲苯哒唑及其代谢物氨基甲苯哒唑、5-羟基甲苯哒唑,芬苯哒唑及其代谢物芬苯哒唑砜、等效物奥芬哒唑,氟苯哒唑及其代谢物2-氨基-氟苯哒唑共14种苯并咪唑类药物及其代谢物残留检测的高效液相色谱-串联质谱方法。样品用乙酸乙酯提取,MCX固相萃取柱净化。WatersXterraC18色谱柱（2．1mm×150mm,5μm）分离,流动相A相为0．1％甲酸乙腈溶液;B相为0．1％甲酸水溶液,梯度洗脱,外标法定量。结果表明,14种苯并咪唑类药物及其代谢物标准溶液在10～1000ng／mL的浓度范围内呈现良好的线性关系,尺。均大于0．99,方法检测限为5斗g／kg,定量限为10μg／kg,14种苯并咪唑类药物及其代谢物在10—200μg／kg添加浓度范围内回收率均70％～120％之间。批内、批间相对标准偏差均小于20％。本方法灵敏、准确,满足食品安全检测法规的要求。     

链霉素酶联免疫检测试剂盒的稳定性研究

通过对自制链霉素酶联免疫检测试剂盒和关键试剂的加速试验以及2～8℃保存6个月试验，考察试剂盒的稳定性。试验表明，加速试验后，试剂盒的标准曲线图形良好，呈双S曲线；2～8℃保存试验后，0浓度点OD值较高，100μg／L添加牛奶样品回收率在60％以上。结果说明，链霉素酶联免疫检测试剂盒可以保存6个月。     

UPLC-MS/MS法检测动物性食品中肝脏、肾脏组织中氯霉素残留量

建立了动物性食品中肝脏、肾脏组织氯霉素残留检测的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS／MS）分析方法。样品用β-葡萄糖醛酸苷酶酶解后乙酸乙酯提取,C18（500mg／3cc）固相萃取柱净化,液相色谱-串联质谱负离子模式测定,内标法定量。结果表明：氯霉素在0．5～10．0ng／mL的系列浓度范围内均呈良好线性关系,相关系数r均大于0．990。样品中氯霉素的检测限为0．1μg／kg,定量限为0．2μg/kg。本方法氯霉素在0．2、0．4、2μg／kg的添加浓度范围内,平均回收率均为70％～120％,相对标准偏差（RSD）均小于20％。该方法具有操作简便快捷、结果灵敏度高、准确度高等优点。     

黄曲霉毒素直接竞争法ELISA试剂盒的研制及其在花生和花生制品中的应用

本实验基于在黄曲霉毒素单克隆抗体基础上,建立酶联免疫(ELISA)直接法检测花生及其制品中黄曲霉毒素(B1、B2、G1、G2)的含量。应用黄曲霉毒素抗体和酶标记的黄曲霉毒素建立酶联免疫直接竞争法。试剂盒最低检出浓度为0.5ng/mL,标准曲线的线性范围为0.5～10.0ng/mL;对花生和花生粕的添加回收率为70.0%～110.0%,变异系数小于20%。本实验制备的黄曲霉毒素试剂盒能够应用于花生及其制品的检测,酶联免疫直接法是一种简单、快速、灵敏、准确的检测方法。     

猪肝和猪尿中沙丁胺醇和克伦特罗残留的酶联免疫吸附检测法研究

采用混合酸酐法将沙丁胺醇与牛血清白蛋白偶联，并免疫家兔制备抗沙丁胺醇抗血清。以间接ELISA法测定血清效价，测得抗血清最佳工作浓度为1：6400，该抗沙丁胺醇抗血清对克伦特罗有110％的交叉反应性。建立了能够同时检测SAL和CL的间接竞争ELISA方法，该方法对沙丁胺醇的检测范围为0．48ng／mL～8．0μg／mL，对克伦特罗的检测范围为0．43ng／mL～7．3μg／mL，对沙丁胺醇的检测灵敏度为o．48ng／mL，对克伦特罗的检测灵敏度为0．43ng／mL。在猪肝和猪尿中添加1～50ng／g(ng／mL)的沙丁胺醇，添加回收率为72．2％～84．8％，变异系数为4．2％～28．3％，在猪肝脏和猪尿中添加1～50ng／g(ng／mL)的克伦特罗，添加回收率为84．3％～103．4％，变异系数为O．3％～35．5％。     

酶联免疫法检测饲料中呋喃唑酮含量的探讨

呋喃唑酮酶联免疫反应测试盒是利用竞争性酶联反应原理,广泛应用于水产、养殖及动物肉制品（如鸡肉、牛肉和猪肉组织）、尿样、血清、鸡蛋和蜂蜜中呋喃唑酮（AOZ）残留的定量检测。经试验证明,该试剂盒具有快速提取被测样品中违禁药物呋喃唑酮,提取时间仅需4h;高灵敏度能够检测到标准曲线中0．05ng／mL浓度的呋喃唑酮;低检测下限,能够检测到被检测饲料样品中0．1μg／kg含量的呋喃唑酮,而这个含量要低于欧盟标准要求的1μg／kg;检测过程时间短,只需要2h左右;高重复性,离散系数（CV值）≤3．5;标准曲线r≥0．9965;能够达到80％～95％以上的回收率等特点。     

肉品中莱克多巴胺残留的酶联免疫快速检测方法的建立

用自主制备的莱克多巴胺特异性抗体建立了猪肉样品中莱克多巴胺药物残留的间接竞争酶联免疫检测方法,对该检测体系的灵敏度、准确度、精密度、特异性等性能进行了测定,并将该检测系统与高效液相色谱法(HPLC)进行了对比分析。结果显示:莱克多巴胺药物残留的酶联免疫检测体系的检测范围为1～100 ng,灵敏度为0.12 ng/mL,检测限为1 ng/mL,回收率为80%～100%,与同类药物如盐酸克仑特罗、硫酸特布他林及硫酸克仑特罗的交叉反应率均小于0.01%;采用HPLC方法进行莱克多巴胺药物残留的检测时,其检测范围为10～200μg/mL,检测限为1μg/mL,回收率为83%～100%。该方法与高效液相色谱法相比灵敏度较高,特异性强,检测结果准确度相近,但是在检测结果稳定性方面逊于HPLC方法。     

猪肉和牛奶中10种磺胺类药物残留检测超高效液相色谱法研究

建立了猪肉和牛奶中磺胺嘧啶（SD）、磺胺噻唑（ST）、磺胺二甲嘧啶（SM2）、磺胺甲氧嗪（SMP）、磺胺氯哒嗪（SPD）、磺胺间甲氧嘧啶（SMM）、磺胺甲基异嗯唑（SM2）、磺胺氯吡嗪（Esb3）、磺胺地索辛（SDM）和磺胺喹嗯啉（SQ）共10种磺胺类药物残留检测的超高效液相色谱（UPLC）法。色谱条件：色谱柱为Acquity UPLC BEH C18柱（2．1mm×50mm,1．7μm）;流动相为50％甲醇乙腈溶液-2％乙酸水溶液,梯度洗脱;紫外检测波长270nm;柱温30℃;进样量4μL;外标法定量。结果表明：10种组分在20～1000ng／mL浓度范围内,呈良好线性关系,相关系数R^2均大于0．998;方法检出限为20ng／g,定量限为50ng／g;在猪肉和牛奶中添加浓度分别为50、100、200ng／g时,平均回收率为75．1％～99．8％,批内、批间平均RSD均小于13．2％。     

猪尿中6种β-受体激动剂残留的超高效液相色谱-串联质谱法同时测定

建立了猪尿中苯乙醇胺A、莱克多巴胺、克仑特罗、西马特罗、特布他林、沙丁胺醇等6种β-受体激动剂在多反应监测模式下超高效液相色谱．串联质谱同时检测的方法。尿样经酶解,调至酸性,经固相萃取技术（SPE）净化富集。6种受体激动剂在0．2-5ng／mL的浓度范围内线性关系良好。方法的检出限和定量限分别为0．2ng／mL和0．5ng／mL。考察了0．5ng／mL、1ng／mL和2ng／mL三个添加浓度的回收率。6种化合物的加标回收率为87．2％-106．6％：RSD为1．2％-13．8％。该方法精密度好,灵敏度高,重现性好,能简便、快速、准确地测定猪尿中六种β-受体激动剂。