水稻MOC1 mRNA TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

TA克隆构建含MOC1基因cDNA片段的重组质粒,作为TaqMan定量检测水稻分蘖基因MOC1 mRNA的标准品,建立了检测方法。采用RT—PCR。的方法,从水稻分蘖芽总RNA中逆转录扩增总cDNA,PCR扩增MOC1基因中设计的目的片段,将纯化的目的片段与pMD19-T Simple载体连接,转化宿主菌JM-109,提取重组质粒DNA,PCR鉴定并测序分析。纯化质粒并检测260nm吸光值,确定重组质粒原液的拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品。对重组质粒进行实时荧光定量PCR实验。建立了MOC1基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法,特异性好,检测灵敏度达10^2拷贝,线性范围为10^2-10^7拷贝,阈值循环数与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系（r=0．999）,扩增效率高（E=92．8％）。成功建立了MOCI基因实时荧光PCR定量标准品,且TaqMan荧光定量RT—PCR的方法可对水稻分蘖基因MOC1 mRNA的表达进行准确定量。     

结核杆菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立及应用

针对结核杆菌CFP10基因序列设计并合成了1对引物,以构建的含有该引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测CFP10基因的SYBR GreenⅠreal-time PCR方法。检测结果显示,该方法线性关系好,标准曲线的相关系数达到0.997,对初始模板的检出下限为1 ×101copies/μL,比常规PCR方法高100倍。表明建立的real-time PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可以用于结核杆菌CFP10的病原检测及定量分析。     

瘤胃脂肪分解菌实时荧光定量PCR方法的构建

为定量测定瘤胃脂肪分解菌,试验构建了脂肪分解菌实时荧光定量PCR的标准品及标准曲线。提取瘤胃微生物总DNA,以脂肪分解菌16S r DNA特异性引物进行PCR扩增,回收PCR产物,与PMD19-T Vector连接并转化大肠杆菌。阳性重组质粒经PCR和测序鉴定后,将提取的质粒DNA进行梯度稀释并作为模板,利用荧光定量PCR反应做出标准曲线。结果显示:PCR产物与目的基因的相似性大于99%,以不同稀释度的重组质粒为模板获得的荧光定量PCR扩增曲线差异明显,构建了相关系数接近1的标准曲线,且熔解曲线峰值单一。试验建立的实时荧光定量PCR方法可用于瘤胃脂肪分解菌的定量检测,为进一步研究该菌在反刍动物瘤胃发酵中的分子机理奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒Real-time PCR检测方法的建立

为定量检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）载量,建立PEDV的Real—timePCR方法。用RT-PCR方法扩增PEDV的M基因片段,构建含有M基因片段的重组质粒,用该重组质粒进行SYBRGreen I Real—timePCR,来建立检测PEDV的荧光定量PCR方法。结果显示：在（5．56×10^2-5．56×10^7）拷贝／皿范围内,所建立方法具有优良的线性关系,其决定系数为0．9996,扩增效率为99．5％,扩增产物的熔解曲线只有一个特异性峰,无引物二聚体峰,熔解温度为（81．18±0．21）℃。该方法对猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒II型等猪源病毒均检测不到扩增产物,重复性试验的变异系数小于3％,对临床样品的检出率高于常规PCR方法。研究结果表明：建立的Real-timePCR检测方法特异性强、重复性好、灵敏性高,可用于PEDV的定量检测及其早期感染的快速诊断。     

猪Th1/Th2型细胞因子重组质粒实时荧光定量PCR标准曲线的建立

依据GenBank登录的猪Th1型细胞因子(IL-2、IL-2、IFN-γ)、Th2型细胞因子(IL-4、IL-6、IL-10)的核苷酸序列设计特异性引物,经RT-PCR技术从猪外周血单个核细胞中扩增和克隆了上述因子的101 bp核苷酸片段.测序鉴定后,将重组质粒10倍系列稀释后作为标准模板,通过实时荧光定量PCR方法,建立了它们各自的标准曲线及直线回归方程.结果表明,该方法具有线性关系好,特异性、敏感性、重复性高等特点,为猪体内IL-2、IL-12、IFN-γ、IL-4、IL-6和IL-10的mRNA水平的定量检测,提供了必要的技术手段.     

猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点的克隆及原核表达载体的构建

【研究目的】对猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点进行克隆和原核表达载体的构建。【方法】参考GenBank上公布的TGEV S基因A抗原位点序列,应用Primer6.0设计一对含酶切位点的引物,用于RT-PCR扩增A抗原位点目的片段,将扩增产物连接于paesy-T克隆载体上构建克隆载体,用EcoR I和Xhol I对表达载体PET-32a（+）和重组质粒进行酶切,将酶切产物亚克隆至PET-32a（+）多克隆位点上,连接、转化至BL21(DE3),构建A位点的原核表达载体,并对阳性重组质粒进行酶切、PCR和测序鉴定。【结果】所扩增的目的片段的大小为534bp,与原核表达载体连接后,经核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因与其它猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性,说明成功地构建了TGEV S 基因A抗原位点的原核表达载体。【结论】TGEV S 基因A抗原位点原核表达载体的成功构建,填补了中国国内单独针对此位点进行研究的空白,也为TGEV诊断方法的建立提供良好的技术基础。     

SYBR Green I荧光定量PCR检测类猪圆环病毒因子P1

该研究旨在建立快速、敏感和特异的检测类猪圆环病毒因子 P1的 SYBR Green I 荧光定量 PCR 法,用于 P1 的早期诊断.以感染 P1 的猪血清DNA提取物为模板,采用 PCR 扩增 P1 101 bp 的基因片段,将其克隆至 pMD18-T 载体,重组质粒测序并进行同源性分析;以阳性质粒为模板,建立 SYBR Green I 荧光定量PCR检测方法,并进行敏感性和特异性检测.经测序证实扩增片段属于 P1,所建立的 SYBR Green I 荧光定量 PCR 检测 P1 的反应在 101 ～108拷贝/μL 之间具有良好的线性关系,反应的检出下限为10拷贝/μL,而对猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等的检测为阴性,表明该方法敏感、特异.成功建立了 SYBR Green I 荧光定量 PCR 检测 P1 载量的方法,为 P1 致病机制和机体免疫保护机制的研究提供了技术平台.     

三七根腐病菌尖孢镰刀菌的Real-time PCR检测方法

为了建立一种准确、快速检测三七根腐病病原真菌尖孢镰刀菌的实时荧光定量PCR方法,基于尖孢镰刀菌脂肪酸ω-羟化酶基因设计了实时荧光定量PCR的特异性引物对Fo-QF和Fo-QR,制备了该基因的重组质粒标准品,建立了尖孢镰刀菌的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。从三七种植区采集到14个具有根腐病、黑斑病典型症状的三七病株及三七种植土壤样品,并提取了这些样品的总DNA,运用本研究建立的荧光定量PCR方法进行了检测。结果显示,本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法特异性强,脂肪酸ω-羟化酶基因只以尖孢镰刀菌DNA为模板扩增出特异的PCR产物。此外,该方法灵敏度高,检测模板浓度可低至0. 35 pg/μL。构建的荧光定量PCR标准曲线Ct值与模板浓度呈良好的线性关系,熔解曲线的吸收峰单一,扩增效率好。利用该定量检测体系,能从几种不同的三七病株中快速检测出携带尖孢镰刀菌的根腐病病株,从而达到准确诊断的目的。本方法不仅能明确三七种植土壤以及三七病株中尖孢镰刀菌数量的动态变化,并且可以为三七土壤处理、根腐病的早期诊断和动态监测以及带病三七种子、种苗的快速分子检测提供技术支持。     

猪圆环病毒II型PCR检测方法的研究

【目的】建立快速、简便、特异的检测猪圆环病毒II型的PCR方法;【方法】根据已发表的猪圆环病毒II型基因序列设计合成了一对引物,用酚-氯仿法抽提可疑病料中的病毒DNA,应用PCR技术对猪圆环病毒进行基因扩增,PCR产物进行序列测定;以猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒为对照,进行特异性试验;取部分病料进行重复性试验;【结果】PCR方法扩增出了长度为702bp的片段,扩增产物经测序和序列分析表明扩增的序列为PCV2序列;猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒的PCR扩增均为阴性,与预期结果一致;部分病料PCR重复检测5次,检测结果完全一致;【结论】PCR检测方法可以对猪圆环病毒病作出敏感、特异、准确地诊断,该方法检测的基因最低模板量为2×10-5 ng/ml     

猪圆环病毒Ⅱ型PCR检测方法的研究

【目的】建立快速、简便、特异的检测猪圆环病毒II型的PCR方法;【方法】根据已发表的猪圆环病毒II型基因序列设计合成了一对引物,用酚-氯仿法抽提可疑病料中的病毒DNA,应用PCR技术对猪圆环病毒进行基因扩增,PCR产物进行序列测定;以猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒为对照,进行特异性试验;取部分病料进行重复性试验;【结果】PCR方法扩增出了长度为702bp的片段,扩增产物经测序和序列分析表明扩增的序列为PCV2序列;猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒的PCR扩增均为阴性,与预期结果一致;部分病料PCR重复检测5次,检测结果完全一致;【结论】PCR检测方法可以对猪圆环病毒病作出敏感、特异、准确地诊断,该方法检测的基因最低模板量为2×10-5ng/ml。     

猪Musclin基因片段克隆与序列分析

【研究目的】克隆并分析猪musclin基因；【方法】肌肉组织提取总RNA，利用设计的引物进行RT-PCR，PCR产物与pMD19-T连接后转化E. coli DH5α，检测阳性克隆并测序；【结果】克隆的猪musclin基因片段与人、大鼠、小鼠同源性分别为86%、78%、75%，预测的氨基酸序列含有“KKKR”结构和与小鼠ANP、BNP、CNP蛋白的同源性区域；【结论】克隆了猪musclin基因片段并注册GenBank (Accession.EF369511)。     

TaqMan探针实时荧光定量PCR诊断犬瘟热病毒方法的建立

根据犬瘟热病毒核蛋白基因的保守序列分别设计一对引物及其相应的Taqman探针建立荧光定量PCR。构建FQ-PCR绝对定量的标准品,并对反应体系进行优化, 建立绝对定量的标准曲线。利用十倍稀释法检验方法的灵敏度并与普通RT-PCR法进行比较;特异性检验后进行临床标本的检验。结果显示：实验成功构建了绝对定量的参照质粒,标准曲线相关系数为0.994。犬瘟热病毒FQ-PCR检测反应的灵敏度为10 TCID50;5种非犬瘟热病毒病原体检测均为阴性;说明本实验建立的FQ-PCR具有快速、灵敏和稳定的特点,适用于临床样品的检验。     

奶牛血浆蛋白质组学研究中双向凝胶电泳条件的优化

摘要：【研究目的】血浆蛋白组成复杂、信息含量丰富。血浆蛋白质结构和数量的改变,对疾病诊断和治疗具有重要的意义;【方法】双向电泳技术是蛋白质组研究中比较常用的一种蛋白质分离技术。根据血浆蛋白动态范围大,高丰度蛋白对分析存在干扰的特点,设计了两种实验方案,并比较了这两种方案的优缺点,;另外对双向电泳过程中的血浆样品的采集,样品制备,等电聚焦,聚丙烯酰胺电泳和图像分析步骤的注意事项进行讨论,为血浆作为诊断蛋白质组的应用提供参考。【结果】使用热SDS法处理样品可分离出230个可以重复的蛋白点。Aurum Affi-Gel Blue Mini columns除白蛋白柱处理样品分离了156个可重复的蛋白点;【结论】热SDS法处理血浆样品联合pH4-7的IPG胶条的方案,步骤简单,分离效果好。     

水杨酸诱导黄瓜幼苗抗冷性的基因表达

摘要 ：【研究目的】水杨酸 (Salicylic acid,SA) 能诱导植物提高抗生物胁迫和非生物胁迫(冷胁迫等)的能力。为研究SA对非生物胁迫下植物基因表达的影响,【方法】以黄瓜 (“新优30”) 幼苗为试材,用SA (3mmol/L,pH6.0) 溶液和蒸馏水处理后,经7℃冷胁迫48h,提取叶片总RNA并反转录cDNA,【结果】利用mRNA差异显示技术分离出12个差异表达cDNA片段,经反向斑点杂交验证其中2个（SICCL_1 和SICCL_2）为高差异表达片段。序列测定和Blast分析表明,SICCL_1与甜瓜中黄瓜花叶病毒 (Cucumber Mosaic Virus, CMV) 相关基因AM734282有88%同源性;SICCL_2与毛柽柳中NaHCO3胁迫相关基因THL24h-106有86% 同源性。【结论】由此推测,SA诱导植物抵抗生物胁迫和非生物胁迫的能力可能是通过诱导植物某些相同基因的表达来实现的。     

与大白菜抗霜霉病基因连锁的分子标记研究

【研究目的】 研究与大白菜抗霜霉病基因紧密连锁的DNA分子标记。【方法】利用高抗自交系‘660’和高感自交系‘654B’及其杂交F2群体162个单株为材料,采用构建抗、感病池,利用BSA法筛选了87对SSR引物,35对拟南芥抗霜霉病相关基因的特异引物,其中特异引物RPP13P2和RPP131-2R在抗感病亲本和抗感病池中扩增出一条多态性片段RPP13MK,利用这对引物对F2代单株构建的分享群体进行扩增,验证标记RPP13MK与目的基因的连锁关系,Mapmaker 3.0软件计算遗传距离。【结果】通过F2单株验证后证明RPP13MK与抗霜霉病基因紧密连锁,其遗传距离为5.6 cM。【结论】获得了一个与大白菜抗霜霉病基因紧密连锁的分子标记RPP13MK。     

茄科作物青枯病原菌的脂肪酸鉴定

【研究目的】采用脂肪酸鉴定技术对茄科作物青枯病原菌进行鉴定,以期为青枯病的预防与防治提供技术支持。【方法】采用选择性培养技术对茄子、番茄和辣椒病株进行青枯病原菌的分离和纯化,而后对青枯病原菌进行脂肪酸鉴定。【结果】经选择性培养分离得到的36株青枯病原菌中,有33株鉴定为典型的青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）,占91.67%;茄子、番茄和辣椒上的青枯病原菌被鉴定为青枯雷尔氏菌的比例分别为100%、90%和89.47%。【结论】脂肪酸鉴定技术具有快速性、准确性,并可通过计算机的运用使分类达到数据化、自动化,可在茄科作物青枯病的检测中得到广泛的应用。     

牛病毒性腹泻病毒HB-DCZ株NS2-3区基因克隆及序列分析

【目的】对牛病毒性腹泻病毒HB-DCZ株NS2-3区基因进行克隆及序列分析，为阐明本病致病机理，更好的控制BVDV感染、流行提供理论依据。【方法】以牛病毒性腹泻病毒河北分离株（HB-DCZ）基因组RNA为模板，扩增BVDV HB-DCZ株基因组NS2-3片段cDNA。将PCR产物克隆后进行PCR及双酶切鉴定。克隆产物进行序列测定及分析。【结果】HB-DCZ cDNA体外扩增获得特异性条带，大小约为665bp，表明该分离毒株基因组中无插入序列。PCR产物克隆，提取重组质粒，扩增获得特异性的DNA条带，长度约为665bp，用EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切，获得两条DNA片段，长度分别为2600bp和702bp左右，与理论值相符。序列测定结果表明，克隆得到的NS2-3重要区扩增片段共665核苷酸，NS2-3重要区的蛋白质由208个氨基酸残基组成。HB-DCZ毒株NS2-3重要区核苷酸序列与已公开发表的BVDV其他毒株相比的同源性依次为184株99.1%，ZM195株97.4%，Osloss株92.3%，C24V株77%，NADL株76.4%。HB-DCZ在NS2-3扩增区域中既没有外源序列的插入，也没有基因重组、重排或缺失，但存在某些核苷酸的替换。【结论】HB-DCZ与Osloss株、国内的184株、ZM195株遗传距离较近，与C24V株、NADL株遗传距离较远。HB-DCZ株应为BVDV Ib基因亚型。