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应用已克隆的鸡痘病毒282E4株基因组TK基因,在NcoI部位引入痘苗病毒P7.5启动子和P11启动子控制下的大肠杆菌LacZ基因,经酶切鉴定,成功地构建了用于FPV重组的载体粒。 相似文献
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鸡痘病毒282E4株2.2kbTK基因序列分析 总被引:7,自引:2,他引:5
将鸡痘病毒282E4弱毒株基因组中的3.7kbHindⅢ片段克隆到KS(-)质粒中,亚克隆后,获得含TK基因正反方向插入的2.2kbHindⅢ-ClaI片段的质粒pKFA和pKFB,进而构建出正反方向的系列嵌套缺失质粒。用T7、T3引物所做的核苷酸序列分析表明,2.2kbHindⅢ-ClaI TK基因序列长为2159bp,含有两个完整的读码框架(ORE)X和TK,并确证了TK基因内存在单一酶切点N 相似文献
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鸡痘病毒282E4弱毒株TK基因限制性酶切图谱分析 总被引:2,自引:1,他引:1
以限制性内切酶BamHI、Xbal、Clal、H1ndⅢ、Ncal对含有鸡痘病毒(FPV)282E4弱毒株3.7kbHindⅢTK基因片段的重组质粒pSL1进行单酶和它们之间双酶酶切。结果表明:3.7kbHindⅢTK基因片段上有2个Clal切点,2个Xbal切点,1个Ncal切点,没有BamHI切点。随后,用澳大利亚FPV2.2kbHindⅢ+ClalTK基因作探针,对各种酶切片段进行Southern印迹杂交,进一步确定TK基因位于2.2kbHindⅢ+Clal片段中。杂交结果与限制性酶切图谱分析结果相一致。该基因的限制性酶切图谱与澳大利亚FPV疫苗株的基本相同。 相似文献
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根据文献设计2对引物,PCR扩增FPV复制非必需区中外源基因插入位点两侧翼的片段,分别克隆到pUC19和pSK质粒中,并命名为pFP1和pFP2。根据文献设计引物,PCR扩增鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的GB基因的编码区。将GB基因克隆到质粒pFP1中获得重组质粒pFP1-GB;用酶切质粒pEGFP,得到GFP片段并克隆到质粒pFP2中,得到重组质粒pFP2-GFP。双酶切pFP1-GB得到FP1-GB片段,并克隆到质粒pFP2-GFP中,得到重组质粒pFP1GB-FP2GPF。酶切质粒pE/L-7.5,获得背向连接的2个鸡痘病毒启动子片段——PE/L-7.5,并将该片段克隆到重组质粒pFP1GB-FP2GPF获得重组质粒pGB-GFP,该质粒即为鸡痘病毒的转移质粒。在质粒pGB-GFP中,2个背向连接的启动子被克隆到的GB和GFP基因之间,分别启动GB和GFP基因的表达。经酶切和测序鉴定pGB-GFP,启动子PE/L和P7.5已分别正确地插入到GB和GFP基因之间,分别启动外源表达基因GB和筛选标记基因GFP的表达,从而证明已获得表达鸡传染性喉气管炎病毒GB基因重组鸡痘病毒转移载体pGB-GFP。该载体为下一步获得表达鸡传染性喉气管炎病毒GB基因的重组鸡痘病毒奠定基础。 相似文献
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用1羽份重组鸡痘病毒vFV282活疫苗对7日龄商品鸡分别进行刺种免疫和肌注免疫,28d时刺种进行二次免疫,通过不同时间阶段脾脏淋巴细胞转化指标分析表明,Con A刺激脾淋巴细胞增殖反应的净增值(OD570nm)于免疫后7d时明显升高0.092,28d时达到最高峰0.155,42d时下降至0.032,首次免疫后刺种组明显优于肌注组,二次免疫高于一次免疫组。 相似文献
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为了建立重组鸭瘟病毒技术,构建了鸭瘟病毒转移质粒。在对鸭瘟强毒和弱毒株TK基因进行测序分析后,将鸭瘟病毒TK-UL24DNA片段克隆于pUC18载体中,构建了质粒pTK;将PCR扩增的GFP真核表达盒插入pTK质粒的TK基因内部,获得转移载体质粒pTK-GFP。鸭瘟病毒TK-UL24测序分析表明鸭瘟强、弱毒株TK基因序列完全相同;转移载体携带Pcmv-GFP-SV40pA表达盒,测序验证其序列与源序列一致。pTK-GFP在脂质体介导下,转染鸭胚成纤维细胞和鸭肾细胞,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。质粒转染细胞后,绿色荧光蛋白得到了有效的表达,为进一步开展重组鸭瘟病毒的研究和构建具有遗传标记的鸭瘟疫苗奠定了基础。 相似文献
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山羊痘病毒通用转移载体的构建及鉴定 总被引:7,自引:0,他引:7
转移载体的构建是重组羊痘病毒构建的重要环节,在分析羊痘病毒基因组的基础上,以TK基因为插入靶序列,经PCR、酶切鉴定,获得了带有EcoRI、BamHⅠ酶切位点的TK基因片段。将此片段与经相同酶切的pUC119载体连接,构建转移载体pUC119-TK,并且以此为基础构建表达绿色荧光蛋白山羊痘病毒转移载体pTK-P7.5-GFP。将pTK-P7,5-GFP转染羊痘病毒感染的BHK21细胞,48h后报告基因得到表达,这为羊痘病毒载体系统的进一步开发奠定了基础。 相似文献
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牛传染性鼻气管炎病毒TK基因缺失株的构建 总被引:7,自引:1,他引:7
将含有牛传染性鼻气管炎病毒( I B R V) T K 基因的片段克隆于p Bluescript S K 中, 再用 Bg1 Ⅱ和 Sac I切去 T K 基因中347bp 的片段, 获得了含缺失 T K 基因的重组质粒, 然后插入 Lac Z 报告基因, 构建成转移载体。以脂质体转染法将此转移载体与 I B R V Bartha 株在牛肾细胞( M D B K) 上共转染, 经过蓝色蚀斑筛选和蚀斑克隆纯化, 获得了能稳定遗传的重组 I B R V。经 P C R 和 Southern 印迹杂交鉴定, 证实该重组病毒为 T K 基因缺失突变株。 相似文献