猪源新城疫病毒HN基因的克隆及序列分析

本试验采用RT-PCR方法对猪源新城疫病毒(NDV)SP13株的HN基因进行了扩增与克隆,测定出HN基因的核苷酸序列,发现其包含一个1734bp的开放阅读框,编码包含577个氨基酸的HN蛋白,该蛋白有5个潜在的糖基化位点和12个Cys残基。通过比较分析表明SP13的HN基因与LaSota、Clone30和源自印度鹦鹉的NDV毒株有着较高的同源性。     

新城疫病毒F48E9株HN基因核苷酸序列

本研究采用 Ｓａｎｇｅｒ＇ｓ 双脱氧末端终止法测定了新城疫病毒国内标准强毒株 Ｆ４８ Ｅ９ 血凝素神经氨酸酶基因 ｃ Ｄ Ｎ Ａ 的核苷酸序列,推导出其氨基酸序列。 Ｆ４８ Ｅ９ Ｈ Ｎ 基因编码区全长为 １７１３ｂｐ,单一的开放阅读框编码５７１ 个氨基酸的糖蛋白。含有６ 个潜在的与天门冬酰胺（ Ｎ）连接的复合寡聚糖和高甘露糖寡聚糖结合位点,其中有 ５ 个簇集在蛋白分子的 Ｃ末端一半内,有１３ 个半胱氨酸残基。发现６ 个 Ｆ４８ Ｅ９ 特有的氨基酸残基,３７ 位 Ｆ（ Ｌ）、３８ 位 Ｓ（ Ａ）、６０ 位 Ｌ（ Ｐ）、１０５ 位 Ｓ（ Ｎ）、４４３ 位 Ａ（ Ｔ）、５７１ 位 Ｉ（ Ｖ）,这些位点除了 ６０ 位的 Ｐ有两株为 Ｓ以外,其它的在 １３ 株已知序列中均为高度保守序列。     

鸽源新城疫病毒的鉴定及HN基因遗传演化分析

根据发病鸽群的临床症状、病理剖检、组织病理学变化,并结合RT-PCR方法对武汉地区某鸽场疑似鸽新城疫进行了确诊,同时对分离的2株鸽源新城疫病毒(NDV)进行了HN基因结构特征及其与已知毒株的遗传相关性分析。结果表明:两株鸽源NDV分离株HN基因片段均含有6个保守的糖基化位点。2株NDV分离株HN基因序列与参考株同源性在80.0%~97.2%,与湖北株(AY225110.HB92)、印度株(KM056357.ndv61/B1)、江苏株(GQ245832.YC-24-07-CH)、陕西株(JF795531.HX01)在同一分支上,为基因II型。研究为武汉地区鸽新城疫的防控提供了理论依据。     

野禽新城疫病毒F和HN基因的遗传变异趋势

野禽携带的新城疫病毒是新城疫流行传播的重要的潜在传染源.结合本实验室克隆测序的鸽NDV(PB9601)、企鹅NDV(QE01)以及GenBank下载的44株野禽(包括野鸭、鹦鹉、鸽子、天鹅、鸳鸯、雁、火鸡等)的NDV毒株的融合蛋白(Fusion gene,F)基因和血凝素蛋白(Hemagglutinin-neuraminidase gene,HN)基因分别进行了F蛋白裂解位点、基因分型以及F和HN基因氨基酸全长的遗传距离分析.结果表明:野禽感染NDV F基因的基因型以Ⅶ和Ⅵ为主,同时I、II、V和IX多种基因型并存.同一种属、同一地区的毒株间的遗传距离较近,具有明显的种属性和区域性,且绝大多数分离株与经典毒株LaSota、V4、B1、TEX-48等的遗传距离相对较远;对HN基因的遗传进化关系分析得出了相似的结论.     

新城疫病毒HN基因分子遗传变异及其功能性研究进展

新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）（PMV-1）是一种高致病性病毒，对禽类危害较大，是世界公认的两大重要禽病之一。新城疫（Newcastle disease，ND）于1926年首次暴发于印尼爪哇121和英国新城，在此之前．中欧亦有类似报道。     

野禽新城疫病毒F和HN基因的遗传变异趋势

野禽携带的新城疫病毒是新城疫流行传播的重要的潜在传染源。结合本实验室克隆测序的鸽NDV(PB9601)、企鹅NDV(QE01)以及GenBank下载的44株野禽(包括野鸭、鹦鹉、鸽子、天鹅、鸳鸯、雁、火鸡等)的NDV毒株的融合蛋白(Fusion gene,F)基因和血凝素蛋白(Hemagglutinin-neuraminidase gene,HN)基因分别进行了F蛋白裂解位点、基因分型以及F和HN基因氨基酸全长的遗传距离分析。结果表明:野禽感染NDV F基因的基因型以Ⅶ和Ⅵ为主,同时Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ和Ⅸ多种基因型并存。同一种属、同一地区的毒株间的遗传距离较近,具有明显的种属性和区域性,且绝大多数分离株与经典毒株LaSota、V4、B1、TEX-48等的遗传距离相对较远;对HN基因的遗传进化关系分析得出了相似的结论。     

新城疫病毒F48E9株HN基因的克隆与酶切分析

为深入探讨新城疫病毒（ＮＤＶ）的结构与功能的关系，扩增和克隆了Ｆ４８Ｅ９株ＮＤＶ的ＨＮ基因。首先以提取的Ｆ４８Ｅ９株ＮＤＶ基因组ＲＮＡ为模板逆转录合成第一链ｃＤＮＡ，然后用ＨＮ基因特异性引物作ＰＣＲ扩增ＨＮｃＤＮＡ，结果得到１条分子量约１．８ｋｂ的ＤＮＡ带，与ＮＤＶＨＮ基因的大小一致。Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交进一步证实其为ＨＮ特异性ｃＤＮＡ。随后采用平端连接法将其克隆到ｐＳＶ·Ｓｐｏｒｔｌ质粒中，应用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ、ＳｃａⅠ、ＭｌｕⅠ、ＡｐａⅠ、ＰｓｔⅠ、和ＳｍａⅠ对ＮＤＶＦ４８Ｅ９株ＨＮｃＤＮＡ重组质粒作单酶或双酶切，结果表明，ＮＤＶＦ４８Ｅ９株ＨＮ基因较ＨｉｔｃｈｎｅｒＢ１株的ＨＮ基因缺少１个ＭｌｕⅠ位点（７０５ｂｐ左右），多１个ＰｓｔⅠ位点（８０２ｂｐ左右）。     

新城疫病毒F基因重要功能区和HN基因单核苷酸多态性研究

对广泛应用的新城疫疫苗株La Sota进行了全基因组测序,并对来自9个不同基因型新城疫病毒株的血凝素神经氨酸酶(haemagglution-neuraminidase,HN)基因和融合蛋白(fusion protein,F)基因47～435 nt区域进行了用单核苷酸多态性(SNP)分析.结果表明:在F基因47～435nt间和HN基因中都存在高密度的SNP位点,Tajima's D检验结果表明这些核苷酸变化符合中性突变假说,Pi(a)/Pi(s)分析暗示F蛋白编码基因N端的一些区段和HN蛋白编码基因中散在的部分区域受到了正向选择.但F基因和HN基因在整体上却都受到了强大的负向选择压力的影响.     

一株基因Ⅶb亚型新城疫病毒F和HN基因的序列分析

为分析从某鹅病料样品中分离鉴定的一株新城疫病毒(NDV) (Goose/Foshan/2010)F和HN基因的序列特征,本研究采用RT-PCR方法扩增该病毒的F和HN基因的ORF序列,并进行序列测定.经序列比对、进化分析表明,Goose/Foshan/2010株属于基因Ⅶb亚型病毒株,F蛋白裂解位点序列为112RRQKRF117,-HN蛋白由571个氨基酸残基组成,具有强毒株分子特征.对F和HN蛋白分析表明,其HN蛋白存在E347D和K495E两个点突变;此外,HN蛋白缺失了538位～540位的糖基化位点.该分离株为我国首次报道的鹅源基因Ⅶb亚型NDV分离株,与秘鲁及马来西亚早期基因Ⅶb亚型分离株进化关系密切,表明我国目前新城疫的流行情况十分复杂.     

辽宁省新城疫病毒F基因和HN基因的分子特征与致病性

采用RT-PCR对新城疫病毒辽宁分离株的F基因和HN基因进行扩增并测序,初步研究其分子特性分析和致病性。结果表明,分离株CY1株、DD2株、YK1株和TL4株的致死鸡胚平均时间(MDT)分别为50.6 h、76.3 h、62.9 h和81.3 h,CY1株具有强毒特征。F基因分型显示,CY1株属于Ⅶ型,其F蛋白多肽裂解位点的序列为112RRQKRF117,符合NDV强毒氨基酸基序特征,与流行株js02株的亲缘关系非常近,与疫苗株LaSota、Queensland V4亲缘关系均较远。DD2株、YK1株和TL4株均属于基因Ⅱ型,其F蛋白多肽裂解位点的序列为112GRQGRL117,符合NDV非强毒氨基酸基序特征,与LaSota株亲缘关系最近。本研究将为本省新城疫防制对策的制定提供参考。     

新城疫病毒地方分离株HN基因的克隆及遗传变异分析

对河北省保定地区两个NDV分离株用RT-PCR技术扩增其HN基因片断,产物经转化、克隆和测序,参照国内外已发表新城疫代表株绘制NDV系统发育进化树并分析其遗传关系,结果表明,两个分离株HN基因在遗传上同源性高达99.7%,两个分离株HN基因核苷酸序列与国内外报道的相关序列同源性为82.8%～93.2%,推导氨基酸序列同源性为90.0%～96.0%,由系统发育树可见,与现今流行于国内的Ⅶ型病毒株有密切联系.     

抗新城疫病毒HN蛋白单抗可变区基因的克隆与序列分析

提取抗新城疫HN蛋白单克隆抗体C3-B7杂交瘤细胞总RNA,进行RT-PCR,扩增出轻重链可变区基因。凝胶回收纯化后与pMD-18T载体连接,重组载体转化于宿主菌DH5α,筛选出阳性重组子,菌液PCR鉴定后进行测序。结果显示,VH基因全长357 bp,编码119个氨基酸;VL基因全长332 bp,编码110个氨基酸。这为单链抗体的构建及表达奠定了基础。     

新城疫病毒西藏分离株HN基因克隆与序列分析

为确定西藏新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)分离株HN基因结构特征及其与已知毒株的遗传相关性,本试验应用RT-PCR技术对西藏NDV分离株HN基因进行扩增,然后克隆至pMD18-T载体测序,并与国内外代表性毒株和当前疫苗株进行比对及系统发育分析。结果表明,NDV分离株HN基因片段长度为1734 bp, 编码577个氨基酸;推导的氨基酸序列均有5个糖基化位点, XZ10和XZ17有12个半胱氨酸残基,XZ20只有11个半胱氨酸残基。NDV西藏分离株HN基因与国内代表性毒株核苷酸同源性在81.1%~93.0%之间,氨基酸同源性在81.1%~93.6%之间;与疫苗株核苷酸同源性在87.8%~98.7%之间,氨基酸同源性在88.0%~98.9%之间。系统进化分析结果表明,NDV西藏分离株HN基因均属于Ⅱ型。     

应用Bac to Bac 系统表达NDV长春株HN蛋白基因

将质粒pKSHNC利用BamHI和XbaI双酶切后回收。将转座载体pFast BacI同样方法酶切、回收。将回收的HNC与pFastBacI连接，使目的基因亚克隆到pFast BacI上的ocu基因启动子下游的MCS上，然后转化E.coliDH5α，以LB／AMP＋GM平板筛选阳性重组子，经酶切鉴定，再转化至Ecoli DH10Bac感受态细胞中，经抗性培养和蓝白斑筛选，挑取白色菌落为阳性重组表达载体，经酶切鉴定后，命名为Bacmid HNC。经小量提取后，转染sf-9细胞，27℃培养72h，应用SDS－PAGE和Western-blot检测和鉴定表达的HN蛋白。结果表明，本研究成功地构建了BacmidHN重组表达载体，本研究成功地构建了BacmidHN重组表达载体，并在sf-9昆虫细胞中表达了NDV长春株HN基因，SDS－PAGE出现一条特异性泳带，约74kDa，Western-blot结果出现一条杂交带，分子量与之相同，进一步证明我建的重组表达载体表达了NDV长春株HN基因。     

新城疫病毒HN基因与鸡贫血病病毒VP3基因对小鼠黑色素瘤的联合抑制效应

在 C57BL/6小鼠的左后肢肌肉注射脂质体包裹的含新城疫病毒 HN基因和鸡贫血病病毒 VP3基因的重组质粒。 2周后 ,在左后肢相同部位皮下接种 B16黑色素瘤细胞 2× 10 5个 ,致瘤 2、10 d后 ,分别肌注相同的重组质粒 .通过细胞毒 T淋巴细胞和自然杀伤细胞 (NK)以及小鼠血清中唾液酸含量的测定 ,探讨新城疫病毒抑瘤的机制以及新城疫病毒 HN基因与鸡贫血病病毒 VP3基因的协同抑瘤效应。结果表明 ,与对照组相比 ,注射含 HN基因和 VP3基因的重组质粒可使荷瘤鼠的肿瘤体积缩小。用新城疫病毒或含新城疫病毒 HN基因重组质粒治疗的荷瘤鼠 ,NK活性、CTL 活性明显高于对照组 (P <0 .0 5 ) ,血清中唾液酸含量低于对照组 ,但差异均不显著 (P >0 .0 5 )。从而证明新城疫病毒 HN基因能够增强小鼠对移植瘤的免疫杀伤力 ,是新城疫病毒发挥抗肿瘤作用的主要功能性基因。     

CTAB脂质体介导鸡新城疫病毒核酸免疫研究

用CTAB／DOPE脂质体包裹新城疫病毒血凝素神经氨酸酶（HN）基因的真核表达质粒pcHNM免疫5周龄仔鸡，1周后免疫鸡血清中的特异性HI抗体开始升高，至第6周空白对照组抗体2．06，裸DNA免疫鸡4．09，脂质体DNA免疫组为5．20；此时用新城疫强毒F48E9攻击，未免疫组鸡的存活率为27．28％，裸DNA免疫组81．82％，CTAB脂质体DNA免疫组100．00％，表明该质粒DNA被脂质体包裹后，不仅增加了动物的特异性抗体产生能力，而且增加了动物对新城疫强毒的抵抗力。     

新城疫病毒昌黎株与国外毒株HN蛋白基因核苷酸及氨基酸差异性分析

参考国外发表的新城疫病毒 ( NDV)的 HN基因序列设计了 1对特异性引物 ,应用 RT-PCR对 NDV昌黎株 (野毒 )的 HN基因进行了扩增 ,扩增产物克隆后测序。扩增出的 HN基因核苷酸长度为 1 74 2 bp,编码 571个氨基酸 ,序列中有 6个糖基化位点 ,1 3个半胱氨酸残基 ,与国外发表的强毒株序列相符。核苷酸同源性在 88.5%～ 92 .9%,推导的氨基酸序列同源性在 90 .0 %～ 94 .2 %之间。     

新城疫病毒分离株F基因的克隆与序列分析

应用RT-PCR分别扩增出新城疫病毒(NDV)青海株(QH3)、黑龙江株(HLJ)和甘肃株(A4)的融合蛋白(F)基因的全长核苷酸,再克隆到pMD18-T载体中.经酶切和质粒PCR鉴定,获得阳性重组质粒后,进行序列测定并推导出其氨基酸序列,同时进行分析和比较.序列分析结果表明,所获得的3个分离株F基因完整的开放阅读框长度为1 662 bp,共编码F蛋白的553个氨基酸;3个毒株之间的核苷酸序列同源性为88.0%～90.6%;与常用疫苗株之间核苷酸序列同源性只有85.3%～91.6%.三者F基因的裂解位点均为112R-R-Q-K/R-R-F117,符合强毒株裂解区氨基酸组成的特征.以1 bp～374 bp的核苷酸序列绘制系统发育树分析表明,QH3株NDV为基因Ⅷ型,A4株NDV为基因Ⅵ型,HLJ株NDV为基因Ⅸ型.     

NDV 江苏分离株F基因的克隆与序列分析

为比较NDV江苏分离株的遗传变异特征,应用RT-PCR扩增出新城疫病毒（NDV）江苏徐州株（JSXZ）、江苏宿州株（JSSZ）、江苏连云港株（JSLYG）和江苏淮安株（JSHA）的融合蛋白F基因的全长核苷酸,将其分别克隆至pMD18-T载体中。将获得的阳性重组质粒进行序列测定后,推导出其氨基酸序列,进行分析和比较。结果表明,所获得的4个分离株F基因完整的开放阅读框长度为1662bp,共编码F蛋白的553个氨基酸;4个毒株与常用疫苗株之间核苷酸序列同源性只有69．3％～80．8％。JSXZ株和JSSZ株F基因的裂解位点为112-RRQK／RRF-117,符合强毒株裂解区氨基酸组成的特征。以lbp～374bp的核苷酸序列绘制系统发育树分析表明,JSXZ和JSSZ株NDV为基因Ⅷ型,JSLYG和JSHA株NDV为基因Ⅸ型。