农杆菌介导甜高粱转Bt cry1Ah的研究

 【目的】建立一套高效、稳定的甜高粱农杆菌遗传转化体系,并在甜高粱中验证来源于苏云金芽胞杆菌新型杀虫基因cry1Ah表达产物的杀虫活性。【方法】以甜高粱幼穗愈伤组织为转化受体,通过农杆菌介导法将密码子优化过的Bt cry1Ah导入2个甜高粱品种“BABUSH”和“MN-3025”中。对获得的再生植株进行PCR检测、RT-PCR分析及除草剂抗性、目的蛋白表达水平和抗虫性鉴定分析。【结果】对336块幼穗愈伤组织块进行了农杆菌侵染,经双丙氨膦（Bialaphos）梯度筛选后共获得66株再生植株,PCR鉴定在8个转化事件中有22株为阳性植株,平均转化率为2.38%。RT-PCR检测结果表明,cry1Ah在T0甜高粱转基因植株中能够正常转录。Western blotting分析和ELISA定量测定显示,有5株可检测到Bt蛋白,但Bt蛋白含量差异较大,最高可达165.69 ng•g-1叶片鲜重（FW）,最低的仅为1.93 ng•g-1叶片鲜重（FW）,平均为87.50 ng•g-1 FW。饲虫试验表明,有2株转基因甜高粱植株对亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）表现为抗性。【结论】利用建立的以甜高粱幼穗为外植体的农杆菌遗传转化体系,可获得具有玉米螟抗性的转基因甜高粱植株,其后代遗传稳定性还有待于进一步的研究。     

转cry1C~*籼型抗虫节水抗旱稻的获得及鉴定

通过农杆菌介导的遗传转化方法,将cry1C*基因导入籼型节水抗旱稻品种‘旱恢3号’中。通过对Basta抗性植株的PCR筛选和Southern检测证实,cry1C*基因已整合到受体品种中;田间自然感虫试验显示,转基因植株对稻纵卷叶螟具有明显的抗性。     

转cry1Ab基因抗虫水稻的培育

采用农杆菌介导的遗传转化法,将cry1Ab基因导入优良三系恢复系明恢63,共获得了92个独立转化株,其中13株为单拷贝。通过发芽试验,获得了11个单拷贝转基因纯合系。ELISA检测结果表明:不同株系其Bt蛋白含量不一样,但杂种的Bt蛋白含量与其亲本一致。室内人工接虫试验及田间抗虫性试验初步表明:5个纯合株系表现高度抗性,且农艺性状与原品种没有显著差异。由此说明,所获得的这些单拷贝转基因株系可作为育种材料,用于抗虫水稻的培育。     

抗除草剂基因基因枪法转化粳稻的研究

优化了粳稻的组织培养体系;通过Gus基因的瞬间表达研究,明确了以DNA金弹到靶细胞距离为9cm,轰击2次时,PDS1000/He基因枪法转化水稻胚性愈伤组织的效率最高。应用基因枪法将抗除草剂基因(bar)转入吉林省主栽的水稻品种长白8号中,获得了可育的转基因水稻植株。经过Gus基因的组织化学分析,PCR和Southern杂交检测,证明抗除草剂基因已整合到水稻基因组中得以表达,使水稻产生对除草剂的抗性。转基因水稻中发现一例基因沉默现象。     

用基因枪法将抗除草剂bar基因导入小麦的研究

用基因枪法将含有抗除草剂bar基因的植物表达载体导入优良品种小麦幼胚愈伤组织,并通过GUS瞬时表达对沉淀剂、轰击距离、金粉用量等轰击参数进行了优化。用除草剂对轰击后的材料进行分化生根筛选,共获得33株再生苗。通过PCR检测和涂叶检测,初步证明其中4株已将bar。基因整合到小麦基因组中,平均转化率为0．33％。     

转cry2Ab4和vip3Aa11基因烟草对小地老虎杀虫效果研究

小地老虎严重危害农业生产,通过转基因技术提高作物对小地老虎的杀虫效果是一条切实可行的途径。cry2Ab4和vip3Aa11是从苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）中克隆到的两个杀虫基因。分别构建了pCS2Ab和pCSvip3A两种植物表达载体,利用农杆菌介导法转化烟草（Nicotiana tabacum L.）NC89,并得到32株和35株阳性转基因植株。通过对其进行RT-PCR分析、Western杂交分子检测证实两种外源基因在烟草植株中可以正常表达。人工饲喂初龄小地老虎幼虫,对两种转基因植株进行生物活性检测,结果显示饲喂转基因叶片的小地老虎幼虫死亡率在82%以上,抗虫能力比对照显著提高,转vip3A植株抗虫效果优于转cry2Ab植株。     

转Bt cry1Ah/cry1Ie双价基因抗虫玉米的研究

构建了含有人工改造的抗虫基因Bt cry1Ah、cry1Ie和耐除草剂基因2mG2-epsps的植物表达载体pMUHUESGM,利用基因枪法将表达盒片段转化玉米愈伤组织,以2mG2-epsps基因为筛选标记基因,经草甘膦异丙胺盐筛选获得24株T0代再生植株,其中PCR检测阳性植株有20株。T0和T1代植株的分子检测结果证明了外源基因已经整合到玉米基因组中并能够稳定遗传和表达,转基因株系在田间生物活性检测中表现出较好的抗虫性,这为培育抗虫玉米新品种提供了参考,同时本研究中采用了基因枪片段转化法,提高了转基因的生物安全性。     

基于GR79 EPSPS筛选标记的抗虫抗除草剂表达载体构建及抗性鉴定

虫害和草害是农业生产中两大主要危害。目前,尽管转基因抗虫和抗除草剂作物相继报道和应用,然而我国抗虫抗除草剂复合性状作物培育仍然明显滞后,而且多依靠传统杂交选育的手段,费事费力、周期长。根据苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）Cry1Ac蛋白结合结构域和毒性结构域特征,人工合成杀虫基因cry1Ac-2.5。同时,利用抗除草剂基因GR79 EPSPS替换卡那霉素筛选标记,构建基于草甘膦除草剂筛选标记的复合抗虫抗除草剂植物表达载体,并转化烟草。qRT-PCR结果表明转基因烟草cry1Ac-2.5和GR79 EPSPS基因转录水平均成功表达,经Bt和GR79试纸条检测表明上述基因在蛋白水平正确翻译。抗性实验表明,转基因烟草愈伤经草甘膦筛选,阳性率达到80%,且转基因烟草耐受100 mg/L草甘膦处理。抗虫实验表明,饲喂cry1Ac-2.5转基因烟草4 d后,棉铃虫幼虫死亡率为90%左右,表明人工基因cry1Ac-2.5具有显著的的抗虫效果。以上结果表明,构建的抗虫抗除草剂植物表达载体（Cry1Ac-2.5+GR79 EPSPS）将抗虫基因和抗除草剂基因有效合并,对于快速培育抗虫抗除草剂作物具有指导意义。     

利用农杆菌介导法获得转cry2A抗虫基因水稻的研究

稻纵卷叶螟等鳞翅目害虫对cry2A＊编码的Bt毒性蛋白有明显的排斥效应,从而可达到抗虫的效果。本研究利用农杆菌介导法,将载有cry2A＊基因的pC-2A质粒转入受体水稻品种镇稻88基因组内,获得转基因植株。由于cry2A＊与抗Basta基因紧密连锁,通过Basta抗性筛选,进而得到转cry2A＊基因阳性株。PCR和AGE分析结果表明,外源基因cry2A＊已成功整合到镇稻88基因组内。田间试验结果显示转基因阳性植株有明显的抗虫效果。     

Acquisition of Insect-Resistant Transgenic Maize Harboring a Truncated cry1Ah Gene via Agrobacterium-Mediated Transformation

A novel insecticidal gene cry1Ah was cloned from Bacillus thuringiensis isolate BT8 previously for plant genetic engineering improvement. Truncated active Cry1Ah toxin has a toxicity level similar to that of the full-length Cry1Ah toxin. In this study, plant expression vector pMhGM harboring truncated cry1Ah gene was transformed into maize (Zea mays L.) immature embryos by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation at which maize alcohol dehydrogenase matrix attachment regions (madMARs) were incorporated on both sides of the gene expression cassette to improve gene expression. A total of 23 PCR positive events were obtained with a transformation efficiency of 5% around. Bioassay results showed that events 1-4 and 1-5 exhibited enhanced resistance to the Asian corn borer (Ostrinia furnacalis). These two events were further confirmed by molecular analysis. Southern blot suggested that a single copy of the cry1Ah gene was successfully integrated into the maize genome. Western blot and ELISA showed that the foreign gene cry1Ah was expressed stably at high level in maize and could be inherited stably over generations. The results of a bioassay of T1-T4 transgenic maize plants indicated that the transgenic plants were highly toxic to the Asian corn borer and their resistance could be inherited stably from generation to generation. Thus, events 1-4 and 1-5 are good candidates for the breeding of insect-resistant maize.     

PtWRKY14 基因转化烟草及对 TMV 的抗性影响研究

PtWRKY14 是从毛白杨中获得的WRKY 基因,为研究PtWRKY14 基因对植物抗病性的影响,构建了毛 白杨PtWRKY14 基因的植物表达载体pBI121-W14,通过农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草,PCR 与Southern 杂交 进行转基因烟草鉴定。对获得的转基因烟草植株进行烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV）的接种试验,结果表 明PtWRKY14 基因的转化使烟草对TMV 的抗性增强。荧光定量PCR 检测结果表明,TMV 接种后,转基因烟草中 PtWRKY14 的表达量显著上调,同时转基因烟草中超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD）、过氧化物酶(Peroxidase,POD）、过氧化氢酶(Catalase,CAT）的表达量均高于对照组。因此,PtWRKY14 可能通过上调SOD、POD、 CAT 的表达从而增强植物抗病性。     

转cry1Ab13基因玉米新种质的创制

【目的】构建包含抗鳞翅目害虫基因cry1Ab13的重组植物表达载体,并利用其创制对玉米螟Ostrinia furnacalis具有优良抗性的转基因玉米Zea may L.新种质。【方法】利用同源重组法将cry1Ab13基因连接到表达载体pCAMBIA3300-Bar上,获得以抗除草剂Bar基因为筛选标记的植物表达载体pCAMBIA3300-cry1Ab13-Bar。通过农杆菌介导法转化玉米自交系H99幼胚,对再生植株进行逐代除草剂筛选、PCR检测及T2代植株的Southern blotting检测、实时荧光定量PCR检测,并对转基因植株进行田间及室内抗虫性鉴定。【结果】构建了cry1Ab13基因的植物表达载体,转化玉米获得3株高抗玉米螟和1株抗玉米螟的T2代转基因植株。Southern blotting证明cry1Ab13基因已经整合到玉米基因组中,实时荧光定量PCR结果表明cry1Ab13基因已经在玉米植株内表达。抗虫性鉴定结果表明,与对照相比转基因植株对玉米螟的抗性显著提高。【结论】将cry1Ab13基因导入玉米并成功表达,显著提高了转基因玉米对玉米螟的抗性,为抗虫玉米新种质的创制奠定了基础。     

Transgenic japonica rice expressing the cry1C gene is resistant to striped stem borers in Northeast China

Rice production and quality are seriously affected by the lepidopteran pest, striped stem borer (SSB), in Northeast China. In this study, a synthetic cry1C gene encoding Bacillus thuringiensis (Bt) δ-endotoxin, which is toxic to lepidopteran pest, was transformed into a japonica rice variety (Jigeng 88) in Northeast China by Agrobacterium-mediated transformation. Through molecular detection and the Basta resistance germination assay, a total of 16 single-copy homozygous transgenic lines were obtained from 126 independent transformants expressing cry1C. Finally, four cry1C-transgenic lines (JL16, JL23, JL41, and JL42) were selected by evaluation of the Cry1C protein level, insect-resistance and agronomic traits. The cry1C-transgenic lines had higher resistance to SSB and higher yield compared with non-transgenic (NT) control plants. T-DNA flanking sequence analysis of the transgenic line JL42 showed that the cry1C gene was inserted into the intergenic region of chromosome 11, indicating that its insertion may not interfere with the genes near insertion site. In summary, this study developed four cry1C-transgenic japonica rice lines with high insect resistance and high yield. They can be used as insect-resistant germplasm materials to overcome the problem of rice yield reduction caused by SSB and reduce the use of pesticides in Northeast China.     

籼型杂交水稻恢复系“752”抗除草剂转基因研究

用基因枪法对籼型杂交水稻恢复系“75 2”进行了bar基因的遗传转化 ,共获得可育的抗除草剂Basta的转基因株系 6个。PCR检测结果表明 ,抗性转基因植株表现为阳性 ,而非转化的对照表现为阴性 ,证明T0 代转基因水稻基因组中整合有bar基因。转基因植株的抗性能遗传至后代 ,在T1 代中观察到了抗、感分离现象     

雪花莲凝集素基因转化新疆甜瓜抗蚜虫的研究

采用农杆菌介导法对新疆甜瓜进行了遗传转化研究,对影响转化频率的不同因素,即:抗生素浓度、预培养有无及感染时菌液的不同处理、外植体与农杆菌的感染时间和共培养时间等进行了研究,通过农杆菌介导法将雪花莲凝集素基因导入四日龄甜瓜子叶外植体,获得了卡那霉素的抗性植株.移栽成活并生长良好.卡那霉素抗性鉴定及转化株总DNA的PCR分析表明,GNA基因已整合到甜瓜的基因组中.初步抗蚜虫实验证明,转基因甜瓜有一定的抗棉蚜幼虫效果.     

过表达酵母PAC1增强转基因大豆对大豆花叶病毒的抗性

【目的】大豆花叶病毒（soybean mosaic virus,SMV)病是中国大豆产区最主要的病害之一,严重影响大豆产量和籽粒品质。核糖核酸酶PAC1能够识别和降解植物RNA病毒或类病毒复制过程中产生的dsRNAs,从而有效抑制病毒在寄主中的复制与积累。PAC1的这一特点为广谱抗RNA病毒及类病毒转基因作物的创制和培育提供了有效的靶标基因。本研究利用转基因技术,将来源于粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)的PAC1导入栽培大豆,研究过表达PAC1对大豆SMV抗性的影响,为抗SMV转基因大豆新品种选育提供依据。【方法】采用酶切连接技术,将PAC1连接到双元表达载体pCAMBIA3300中,构建植物表达载体pCAMBIA3300-PAC1。目的基因启动子为组成型强启动子CaMV 35S,终止子为NOS,筛选标记为草铵膦抗性基因BAR。采用农杆菌介导转化法,将PAC1导入栽培大豆品种Williams82。在利用PAT/BAR试纸、PCR及除草剂（500 mg·L^-1 Basta）喷施检测基础上,通过Southern杂交技术进一步分析外源基因在转基因大豆中的整合情况和拷贝数。采用人工摩擦接种法,对T₂和T₃代转基因大豆株系进行田间抗SMV鉴定农艺性状调查,分析转基因大豆对SMV抗性及遗传稳定性。并利用qRT-PCR技术分析接种SMV 28 d后转基因大豆中SMV积累水平。【结果】共转化2 600多个外植体,获得耐草铵膦（5 mg·L^-1）大豆再生植株76株。PCR检测结果表明,其中65株能够扩增出目的条带,大豆遗传转化效率为2.48%。对T₁-T₃代转基因大豆株系喷施除草剂表明,在500 mg·L^-1 Basta处理7 d后,转基因植株表型没有明显变化,而对照（非转基因大豆）植株叶片则黄化枯死。Southern杂交结果表明,外源基因以低拷贝的方式(1-2个)整合至大豆基因组中。摩擦接种SMV SC-3鉴定表明,在接种35 d后,对照出现严重花叶、皱缩等典型SMV发病症状,而转基因大豆仅部分叶片表现出轻微的花叶症状,其病情指数降低至11.11-22.22,较对照（病情指数36.81-46.24）显著降低,且SMV抗性在转基因大豆不同代际间能够稳定遗传。qRT-PCR分析表明,在接种SMV SC-3株系28 d后,转基因大豆中SMV CP表达水平较对照极显著下降。农艺性状调查表明,在未接种SMV条件下,转基因大豆在叶形、花色、种皮色、种脐色、株高、节数、结荚高度、生育期及百粒重等方面与对照没有显著差异。【结论】PAC1过表达显著抑制了SMV的积累及症状发展,增强了转基因大豆对SMV的抗性水平。     

兼抗虫、除草剂、干旱转基因玉米的获得和鉴定

【目的】培育抗玉米螟、抗草甘膦、抗旱的转基因复合性状玉米种质。【方法】通过农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化法,把重组到同一植物表达载体的cry1AcM、epsps、GAT和ZmPIS转入玉米骨干自交系9801和齐319（Q319）,获得转基因植株。通过逐代除草剂筛选、分子检测和抗虫性鉴定,从大量转基因株系中优选出6个优良玉米株系。在此基础上,以非转基因自交系9801、Q319为对照,在严格控制条件下对6个转基因株系进行抗虫、抗除草剂和抗旱性检测。由于不同生长时期植株对玉米螟危害的敏感程度有差异,在抗虫性检测试验中,对不同生长阶段的转基因玉米的抗虫性,分别进行了田间和室内玉米螟接种试验,并以灌浆期玉米的籽粒和苞叶饲喂玉米螟幼虫检测其杀虫性。在草甘膦抗性鉴定试验中,对6叶期田间玉米植株喷洒大田除草用量的草甘膦溶液评估其应用价值;采用3倍应用剂量的草甘膦溶液喷施3叶期玉米植株测试其草甘膦耐受力。在抗旱性鉴定试验中,对10叶期玉米植株进行干旱胁迫处理,观测转基因植株的表型变化并测定光合作用和叶绿素荧光等参数。【结果】选择出6个遗传稳定的兼抗亚洲玉米螟、抗草甘膦和抗旱性提高的转基因玉米株系,其中株系L1-L3来自自交系9801,Q1-Q3来自自交系Q319。通过RT-PCR检测4个转基因的转录强度,证明它们在转基因植株中有效表达;利用Western blot方法检测cry1Ac蛋白的表达水平,确定其在玉米植株中稳定表达。植株抗虫性鉴定结果显示这6个株系在玉米营养生长期和灌浆期的抗虫能力均显著高于未转基因自交系。在草甘膦抗性测试中,转基因植株表现出明显高于未转基因自交系的草甘膦抗性。在干旱控水期间,转基因植株能维持较强的光合能力和光系统Ⅱ活性,对干旱胁迫的抗性显著高于对照植株。【结论】将cry1AcM、epsps、GAT、ZmPIS一同转入玉米,赋予了植株抗玉米螟、抗除草剂草甘膦特性,提高了植株的抗旱性,达到生产中应用标准。培育出具有优良复合性状的转基因玉米新材料。     

转抗鞘翅目害虫基因银腺杨的获得及其抗虫性的初步研究

培育抗鞘翅目害虫的杨树新品种是防治光肩星天牛等高危害蛀干害虫的有效方法之一.该研究通过根癌农杆菌介导法将抗鞘翅目害虫基因（Cry3A）导入银腺杨基因组中,获得了再生植株.PCR 及Southern点杂交的分析结果表明, 外源基因已整合到杨树基因组中.室内抗虫生物学鉴定表明,与对照相比,转基因株系BGA-5对光肩星天牛具有一定的毒杀和显著的生长抑制作用,其杀虫率达30%,对幼虫的生长抑制率达78.46%;其他转基因株系对光肩星天牛幼虫无明显的毒杀和生长抑制作用.      

大豆GmbZIP16的抗旱功能验证及分析

【目的】通过分析干旱条件下大豆的转录组数据,筛选获得大豆锌指蛋白GmbZIP16,对其进行功能验证,确定GmbZIP16参与大豆抵抗干旱的分子机理。【方法】大豆干旱转录组数据分析得到上调倍数较高的锌指蛋白GmbZIP16,以大豆cDNA为模板克隆获得GmbZIP16。并通过In-Fusion连接酶技术,构建pCAMBIA1302- GmbZIP16和pCAMBIA3301-GmbZIP16表达载体。通过液氮冷冻法将重组载体pCAMBIA1302- GmbZIP16和pCAMBIA3301-GmbZIP16分别转入农杆菌GV3101和大豆发根农杆菌K599的感受态细胞中,通过农杆菌侵染拟南芥花序以及大豆子叶节技术,产生过表达拟南芥植株以及过表达大豆毛状根复合体植株。通过半定量RT-PCR和qRT-PCR分析,确定GmbZIP16在转基因拟南芥和大豆毛状根中能够超表达。分别将正常条件下生长2周龄的转基因和野生型拟南芥植株转移至含有不同PEG浓度（6% PEG和8% PEG）的MS0培养基上继续培养7 d,观察转基因拟南芥和对照野生型拟南芥之间的生物量差异;利用qRT-PCR分析转基因拟南芥和野生型拟南芥植物体中胁迫相关的基因表达情况。将生长良好的转GmbZIP16大豆毛状根复合体施加25% PEG处理1周后,分别采取转GmbZIP16大豆毛状根复合体和转空载体大豆毛状根复合体的叶片,用酶标仪测定植株的脯氨酸、丙二醛和叶绿素的含量。【结果】通过PCR技术扩增得到正确的GmbZIP16序列,通过农杆菌转化技术得到2个稳定过表达的转GmbZIP16拟南芥株系。通过对转基因拟南芥的表型鉴定发现转基因拟南芥在干旱处理下的生物量（鲜重和根长）及存活率比野生型显著提高。在过表达GmbZIP16拟南芥植株中,一些与胁迫相关的基因的表达要高于在野生型,如RD29B、DREB2A和P5CS。转GmbZIP16大豆毛状根复合体植株在25% PEG处理1周后,大豆毛状根复合体叶片中叶绿素和脯氨酸的含量要显著高于转空载体大豆毛状根复合体叶片中叶绿素和脯氨酸的含量,而转GmbZIP16大豆毛状根复合体叶片中丙二醛的含量显著低于转空载体大豆毛状根复合体叶片中丙二醛的含量。【结论】在拟南芥中过表达大豆GmbZIP16提高了转基因拟南芥的抗旱性。过表达GmbZIP16可以提高转基因大豆毛状根复合体对干旱的抗性。GmbZIP16提高植物的抗旱性主要是通过影响与抗逆相关基因的表达来实现的。