GlnA基因对刺糖多孢菌生长发育及多杀菌素合成的影响

谷氨酰胺合成酶（GS,glutamine synthetase）是由GlnA基因编码的生物体中最古老也是最广泛存在的酶,它参与许多生物体中的氮和碳代谢,是生物体氮代谢的关键酶之一,对微生物的生命活动起着重要作用。本文研究了GlnA基因对刺糖多孢菌Saccharopolyspora spinosa的生长发育及次级代谢产物合成的影响,从刺糖多孢菌基因组中克隆了glnA 基因的部分片段,将其与穿梭载体pOJ260连接,构建敲除载体pOJ260-glnA,通过接合转移将其导入刺糖多孢菌野生菌中,获得刺糖多孢菌敲除菌株S.spinosa-△glnA;同时,利用重叠延伸PCR将glnA基因置于红霉素强启动子P_ermE下,并将融合片段P_ermE-glnA与穿梭载体pOJ260进行酶切酶连,构建过量表达载体pOJ260-P_ermE-glnA,通过接合转移将其导入刺糖多孢菌中,获得了刺糖多孢菌过量表达菌株S.spinosa-glnA。表型分析发现,glnA基因的敲除对刺糖多孢菌的菌丝形态、孢子萌发等方面都有显著的抑制作用。HPLC检测分析发现,过量表达菌株中多杀菌素产量相比原始菌株提高到170%;该研究表明glnA基因对刺糖多孢菌的生长发育与多杀菌素的合成有一定的影响,为研究其在链霉菌次级代谢过程中的作用奠定了重要基础。     

植物油对刺糖多孢菌生长及其合成多杀菌素能力的影响

为研究不同种类植物油对刺糖多孢菌生长及其合成多杀菌素能力的影响,探索提高多杀菌素产量的方法,在发酵培养基中分别添加葵花油、花生油、大豆油、芝麻油、橄榄油和菜籽油,研究了其对菌体生长、脂肪酶活性和多杀菌素产量的影响,并利用RT-PCR对脂肪酶基因及多杀菌素合成相关基因的转录水平进行分析。结果表明:6种供试植物油对菌体生长和多杀菌素产量的影响程度不同,依次为菜籽油橄榄油花生油芝麻油葵花油大豆油,其中菜籽油有利于诱导脂肪酶的表达、延缓菌体的衰亡和延长产素期,脂肪酶活力、菌体生物量和多杀菌素产量分别提高310.09%、8.97%和33.94%;脂肪酶基因和多杀菌素合成基因的转录强度也有明显提高。因此,菜籽油是其最佳的辅助性脂类碳源。     

聚磷酸激酶基因的阻断对刺糖多孢菌生长及多杀菌素合成的影响

聚磷酸激酶基因(Polyphosphate kinase gene,ppk)是放线霉菌中的一种影响抗生素合成的全局性负调控因子,阻断该基因能显著提高其次级代谢产物产量。本文利用PCR扩增了刺糖多孢菌中的ppk基因中间片段,经酶切连接技术将其克隆到大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pOJ260上,构建阻断型载体pOJ260-ppk;通过接合转移将该功能质粒导入刺糖多孢菌中,获得了遗传性能稳定的重组菌株S.sp-△ppk。对工程菌株的PCR检测结果显示,ppk基因片段已整合到刺糖多孢菌染色体上并成功阻断了该基因的表达。摇瓶发酵结果显示,工程菌株多杀菌素产量较原始菌株提高了122%。阻断聚磷酸激酶基因的表达对刺糖多孢菌的菌丝形态及生长发育产生了影响,并有效地促进该菌多杀菌素的生物合成。     

多杀菌素低剂量处理西花蓟马对药剂敏感性的影响

用低剂量多杀菌素继代处理西花蓟马(Frankliniella occidentalis)40多代后,测定了处理种群对其他5种不同类型杀虫剂的敏感性。结果表明,西花蓟马用多杀菌素LC25的浓度继代处理,对多杀菌素的敏感性逐渐下降。处理47代后,该种群的LC50是敏感种群的6.7倍,达到了低水平抗性。在第41代,当处理种群对多杀菌素的敏感性下降为敏感种群的5.19倍时,对阿维菌素和甲氨基阿维菌素苯甲酸盐的敏感性也下降,分别为敏感种群的2.68倍和2.92倍。     

多杀菌素对甜菜夜蛾多酚氧化酶和羧酸酯酶的影响

报道了多杀菌素对甜菜夜蛾Spodopetera exigua(Hübner)多酚氧化酶(PPO)和羧酸酯酶(CarE)的影响, 多杀菌素对甜菜夜蛾表现了很高的毒力,对三龄幼虫的LC50值为0.80 mg/L。离体条件下,1.0×10-3~0.5 mg/L多杀菌素对甜菜夜蛾多酚氧化酶的抑制率超过50％,且表现为随药剂浓度的增加抑制能力增强的趋势。活体条件下,0.1~0.8 mg/L多杀菌素在处理的早期诱导虫体内多酚氧化酶的活性增加,但12 h后却显著抑制多酚氧化酶的活性。1.0×10-3~1.0 mg/L多杀菌素在离体条件下对羧酸酯酶不表现任何抑制作用,但活体条件下同样能诱导虫体内羧酸酯酶活性增强。     

多杀菌素对菜蛾绒茧蜂的致死和亚致死效应

以对多杀菌素高抗的小菜蛾纯合子品系作寄主饲养菜蛾绒茧蜂,用多杀菌素田间推荐使用浓度(25 mg/L)分别处理处于卵期、幼虫期和蛹期的绒茧蜂,其中卵期和幼虫期通过处理寄主幼虫间接处理,并测定该药剂对成虫的毒力,系统观察该杀虫剂对绒茧蜂各虫期的致死和亚致死作用。与对照相比,绒茧蜂卵期或幼虫期其寄主受药后,可导致蜂幼虫死于寄主体内或啮出寄主的过程中,使结茧化蛹率下降43% ~56%,成虫羽化率下降19% ~33%,成蜂雌性比下降11% ~25%,而成虫大小、寿命和寄生力未受显著影响;在蛹期受药使成虫羽化率下降10%,成蜂寿命缩短,但对成虫寄生力无显著影响;对成虫24 h的LC99为4.31 mg/L。结果表明,多杀菌素可进入寄主作用于其体内的蜂卵和幼虫,或直接作用于蜂蛹和成虫,从而对绒茧蜂各个虫态产生显著的致死和亚致死效应,尤以对成虫高毒。     

多杀菌素对小菜蛾体内多功能氧化酶和保幼激素酯酶活力的影响

采用生化分析方法,测定了不同浓度多杀菌素(spinosad)处理后小菜蛾体内多功能氧化酶(mixed-function oxidases/,MFO s)和保幼激素酯酶(juvenile hormone esterase,JHE)的活性,分析了酶活性的变化动态。结果表明,小菜蛾体内MFO s和JHE活性变化趋势受多杀菌素浓度影响。用LC50浓度处理后其保幼激素滴度变化趋势与对照相似,用LC80浓度处理后保幼激素滴度降低,并且滴度高峰出现时间比对照有所提前。不同浓度多杀菌素对氧化酶O-脱甲基活力的影响具有时间效应,用LC20浓度处理后的活力曲线上升拐点出现在24h,LC50浓度处理的则出现在12h。除LC80浓度处理在36h时活力值高于对照外,多杀菌素各处理都能抑制氧化酶N-脱甲基活力。高剂量(LC50、LC80)作用后小菜蛾体内保幼激素降解率与氧化酶N-或O-脱甲基活力有相似的变化趋势。     

多杀菌素亚致死浓度对小菜蛾解毒酶系活力的影响

采用多杀菌素亚致死浓度,以浸叶法分别处理小菜蛾Plutella xylostella (L.)敏感种群(SS)和亚致死选育种群 的3龄幼虫,分别测定饲喂处理6、12、24、48和72 h后小菜蛾体内羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽S-转移酶(GST) 和多功能氧化酶(MFOs)的活性,分析了酶活性的变化动态。结果表明,SS种群小菜蛾CarE的活性在不同时间段波动较大,经多杀菌素处理后,开始时段比活力增加,随着处理时间的延长,比活力逐渐被抑制,Sub-SS种群的GarE活力高于SS种群;多杀菌素对GST具有明显的诱导作用,亚致死浓度处理后GSTs比活力呈上升趋势,且具有一定的时间效应;对细胞色素P450酶系的O-脱甲基酶活性具有明显的抑制作用,多杀菌素亚致死浓度连续处理5代后,该酶活性更低。     

亚致死浓度多杀菌素对西花蓟马解毒酶系活力的影响

采用亚致死浓度(LC25)多杀菌素对西花蓟马Frankliniella occidentalis相对敏感(SS)种群进行连续选育,获得亚致死(Sub)种群。处理36代后,Sub种群对多杀菌素的敏感性下降到SS种群的5.2倍。用SS和Sub种群各自的LC10和LC25浓度多杀菌素分别处理两种群的2龄若虫,1、6 、12、24和48 h后测定羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽S-转移酶(GSTs) 和多功能氧化酶(MFOs)的比活力。结果表明,Sub种群对照组CarE和GSTs比活力在除第48 h外的其他时间段都高于SS种群对照组,且6 h时两者CarE比活力差异显著,Sub种群是SS种群的1.37倍;Sub种群对照组MFOs比活力在各时间段都高于SS种群对照组,在1 和6 h时差异显著,前者分别是后者的1.62和1.36倍。再经各自的LC10和LC25浓度多杀菌素处理后,在各时间段Sub种群的CarE比活力均高于SS种群;LC25浓度处理后,Sub种群的GSTs和MFOs比活力虽在短时间内低于SS种群,但随处理时间的延长其比活力均高于SS种群。说明SS种群经亚致死浓度多杀菌素选育36代后,其体内CarE、GSTs和MFOs比活力有上升趋势;继续用亚致死浓度多杀菌素处理,则Sub种群体内解毒酶活力的动态调节能力要强于SS种群。     

高效液相色谱-串联质谱法测定多杀菌素在甘蓝和土壤中的残留及消解动态

建立了高效、快速、灵敏的测定甘蓝及土壤中多杀菌素残留量的高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)检测方法,并研究了多杀菌素在甘蓝和土壤中的残留及消解动态。样品用乙腈提取,经 N -丙基乙二胺(PSA)分散固相萃取(DSPE)净化后用HPLC-MS/MS检测分析。该方法对甘蓝和土壤中多杀菌素的检出限(LOD)为6×10-12 g,定量限(LOQ)为0.005 mg/kg;在0.005~0.5 mg/kg添加水平下,多杀菌素在甘蓝中的平均回收率为87% ~95%,相对标准偏差(RSD)为6% ~10%,在土壤中的平均回收率为86% ~100%, RSD 为4% ~8%。2011年北京、安徽和湖南 3地的消解动态研究结果表明,多杀菌素在甘蓝和土壤中的消解符合一级反应动力学方程,半衰期分别为0.83~1.16 d和0.88~1.17 d。2011年和2012年的最终残留试验结果表明,在推荐剂量和1.5倍推荐剂量(有效成分26.25 和39.38 g/hm2)下,在甘蓝长至成果的1/2大小时施药2~3次,距末次药后1 d时甘蓝中多杀菌素的残留量远低于我国制定的最大残留限量(MRL)标准2.0 mg/kg。     

多杀菌素高产菌株的选育

采用原生质体紫外诱变、等离子束辐射、^60Co-γ射线等诱变处理，对多杀菌素产生菌出发菌株C121进行诱变，通过菌块一薄层层析法初筛、摇瓶发酵复筛和终筛，最终获得产素水平比出发菌株提高174％的高产菌株Co329。经HPLC测定其发酵效价达1260μg／ml。     

小菜蛾抗多杀菌素和敏感品系耐低温能力的比较

通过杂交筛选得到小菜蛾对多杀菌素敏感和高抗的纯合子品系，对二个品系在适温和经低温处理后的生长发育特性进行了比较，以探明其抗性是否伴有适合度的变化以及适合度变化与温度的关系。结果发现:高抗品系的卵经6℃低温处理14 d，孵化出的幼虫仅有7.7％正常化蛹，显著低于敏感品系61.4％的正常化蛹率；经6℃低温处理28 d，高抗和敏感品系的卵孵化率分别为27％和75％，二者差异显著；高抗品系的蛹经 5℃低温处理7～14 d后，蛹的 发育历期显著延长，其子代卵的存活力也显著下降。在适温25℃下，抗性和敏感品系之间多项生物学特性均无显著差异或差异很小。这些结果表明，小菜蛾对多杀菌素的抗性伴随有耐低温能力的适合度代价。     

嘧肽霉素高产菌株的选育

以不吸水链霉菌辽宁变种为出发菌株,经紫外线、亚硝酸诱变和紫外线与嘧肽霉素复合诱变,选育出了嘧肽霉素的高产菌株,抑菌圈直径由原来的20.5mm提高到36.4mm。传代培养5代表明,该高产菌株遗传特性稳定。     

两株对辣椒疫霉菌有拮抗作用的拮抗菌分泌蛋白的研究

用平板对峙生长法筛选到两株对辣椒疫霉菌具有较强拮抗作用的细菌,经鉴定为芽孢杆菌属。测定了无菌滤液的抑菌活性及两菌产生拮抗物的热稳定性。用硫酸铵沉淀法提取到对辣椒疫霉菌有拮抗作用的抗菌蛋白。发酵条件的研究表明,用Ｇ培养基、ｐＨ７、培养３２小时,ＸＡ１、ＸＦ１能产生具有较强拮抗作用的拮抗物。     

农药生产废水的综合治理

根据农药生产废水的特点，先采用物化处理，降低废水的CODcr浓度，提高废水可生化性，再进行双重生化处理。实践表明：采用此工艺，具有操作简单灵活，处理成本低，管理方便，出水水质高等特点。     

多杀菌素等新杀虫剂对粘虫的杀虫活性

浸叶法证明，多杀菌素(spinosad)、乙酰氨基阿维菌素和虫螨腈比阿维菌素对粘虫表现出更高的杀虫活性。其杀虫活性分别比阿维菌素高5倍、8倍和3．7倍。     

无致病力青枯菌株对番茄青枯病的防治效果

用紫外诱变法获得的青枯无致病力菌株ATm0 4 4和Asp0 6 1对致病菌没有直接的抑制作用 ;处理番茄后对青枯病产生抗性 ;两菌株可在番茄体内定殖并繁殖 ,移栽浸根是最佳的处理方法。盆栽试验结果表明 ,番茄经ATm0 4 4和Asp0 6 1处理后 ,分别较对照推迟 9和 7d发病 ,2 0d后的防效达 56 .7%和 53.4 %。田间小区试验结果表明 ,经ATm0 4 4和Asp0 6 1菌悬液浸根处理番茄 ,1 5d后对青枯病的防治效果分别为 53.8%和 37.7%。     

不同野生木霉菌拮抗作用的比较

通过对峙培养、非挥发性抑制物、挥发性抑制物、几丁质酶活性检测及活体接种试验,对4株初筛效果好的木霉菌株的拮抗活性进行分析比较。结果显示,在4株木霉菌中菌株YZ1303对黄瓜枯萎病菌的平板对峙效果较好,但是几丁质酶活性最低;菌株SH2303的非挥发性抑制物的抑菌效果最好,为41.33%,并且在盆栽试验中防效最高;菌株HF3407的几丁质酶活性较高,并且挥发性抑制作用和盆栽试验防效较好。总之,建立一种可全面反映木霉菌生防功能的拮抗菌株筛选技术体系非常重要。     

多杀霉素和甲氨基阿维菌素苯甲酸盐对小菜蛾的室内生测及田间药效评价

分别采用触杀毒力法和摄食毒力法测定了多杀霉素和甲氨基阿维菌素苯甲酸盐对小菜蛾的室内生物活性,研究结果表明：药后48h,甲维盐的触杀活性和胃毒活性均好于多杀霉素。另外,2种药剂的胃毒活性均好于触杀活性。田间药效试验结果表明,多杀霉素2.5%悬浮剂对小菜蛾幼虫表现出优良的防治效果。在小菜蛾发生期,以15.00～19.99ga.i./hm2兑水均匀喷雾,施药后7d,防治效果可达90%以上。用甲氨基阿维菌素苯甲酸盐2%乳油（对照药剂）常规使用剂量喷雾,最高防治效果达85%以上,稍逊于多杀霉素2.5%悬浮剂。