猪肺炎支原体黏附因子P97基因抗原区的克隆与表达

根据Genbank中猪肺炎支原体J株模式株（ATCC 25934或NCTC 10110）,设计一对特异性引物,通过聚合酶链式反应（PCR）扩增出猪肺炎支原体168株特异性蛋白P97基因序列的R1R2区序列。经测序确认后,克隆入原核表达载体PET-32a（＋）的ECORI和Xho I位点之间,转化宿主菌8L21,将筛选出的阳性克隆用IPTG诱导,通过SDSPAGE电泳进行鉴定,结果表明。P97蛋白基因获得了表达。这为猪肺炎支原体免疫检测与诊断以及新型疫苗的研制提供了重要条件。     

广西陆川猪猪肺炎支原体P97基因R1区克隆及序列分析

本试验通过深入了解广西陆川猪猪肺炎支原体(Mhp)地方流行毒株的黏附因子P97基因R1区的序列特征、基本结构及遗传变异等特点,为广西地方品种陆川猪猪支原体肺炎(MPS)有效的综合防控措施提供理论依据,并为进一步研究广西陆川猪Mhp地方流行毒株特性打下坚实的基础。参考Mhp基因组序列设计扩增P97基因R1区的1对引物,以 2011年-2014年广西陆川猪MPS阳性病料为研究对象,提取基因组DNA,PCR扩增P97基因R1区,对PCR产物进行测序,将广西陆川猪Mhp不同地方流行毒株的P97基因R1区序列的碱基组成和推导的氨基酸序列进行比对。DNAStar软件分析结果表明,所获得的15株广西陆川猪Mhp毒株(GXLC-1、GXLC-2、GXLC-3、GXLC-4、GXLC-5、GXLC-6、GXLC-7、GXLC-8、GXLC-9、GXLC-10、GXLC-11、GXLC-12、GXLC-13、GXLC-14、GXLC-15)和3株广西其他品种猪Mhp毒株(GX227、GX595、GX674)的P97基因R1区的多处碱基发生变异。通过推导氨基酸序列统计P97 R1区五氨基酸(AAKPV/E)重复数为9~18,平均值为12,TN重复数为1~4,结果发现广西陆川猪Mhp流行毒株变异使其毒力和黏附能力增强,再加上陆川猪呼吸道短小狭窄的特殊结构,更易导致广西陆川猪MPS的发生。     

猪肺炎支原体P216基因片段的表达及黏附活性研究

本研究旨在研究猪肺炎支原体P216蛋白的黏附活性并初步建立猪肺炎支原体蛋白黏附模型。根据软件分析和文献报道从P216全基因中选取亲水性、抗原性、黏附性较好的目的片段,利用PCR从Mhp NJ株扩增P216基因片段,克隆到表达载体pET-32a(+)中,获得重组质粒pET-32a(+)/P216,经IPTG诱导获得重组蛋白,通过Western blot和间接免疫荧光试验检测重组蛋白的免疫原性及黏附活性。结果表明,PCR扩增的目的基因大小为l 636bp;SDS-PAGE检测重组蛋白相对分子质量为80.1ku;Western blot检测表明重组蛋白能与Mhp阳性血清发生特异性反应;间接免疫荧光试验表明该蛋白对猪肺炎支原体黏附SJPL细胞产生占位抑制作用。结果提示,P216蛋白具有良好的黏附活性,能黏附SJPL细胞,从而为猪肺炎支原体其他黏附因子的研究奠定基础。     

猪肺炎支原体黏附蛋白的研究进展

猪肺炎支原体是导致猪慢性肺炎的致病因子,其致病过程主要由表面黏附蛋白介导完成。综述了肺炎支原体表面黏附蛋白（P36、P46、P65、P97、P102、P110、P159和P216）的研究进展,为猪慢性肺炎的治疗和诊断研究奠定了基础。     

猪肺炎支原体对猪气管上皮细胞的黏附作用

采用气管结扎、链霉蛋白酶灌注冷消化法分离猪气管上皮细胞,并以对数生长期的猪肺炎支原体(Mhp)感染猪气管上皮细胞,通过间接免疫荧光技术定性定量研究不同滴度的猪肺炎支原体对猪气管上皮细胞的黏附及相同滴度的猪肺炎支原体随时间变化对猪气管上皮细胞的黏附。结果表明,分离的猪气管上皮细胞存活率为95%以上,广谱角蛋白染色阳性;Mhp野毒株XLW-1与猪气管上皮细胞37℃作用30min就能看到少量的支原体黏附,作用4h以上时黏附更明显,并且,二者作用1、2、4、6、10h,XLW-1对猪气管上皮细胞的黏附与阴性对照相比差异极显著(P0.01);1×107、2.5×106 CCU/mL的XLW-1与猪气管上皮细胞37℃作用6h,能看到支原体黏附于细胞表面,并且与阴性对照相比差异极显著(P0.01),而其他低滴度的XLW-1则看不到黏附。     

猪细小病毒NS1基因的克隆及表达

根据Bergeron等报道的猪细小病毒基因组序列设计引物，在下游引物中引入BglⅡ酶切位点以便于构建表达载体。利用PCR技术扩增得到NS1全基因，将其克隆到pMDl8-T载体中进行序列测定并分析，进而构建重组转移载体pFast-NS1，在DH10Bac大肠杆菌中与改造过的苜蓿夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)基因组(Bacmid)发生同源重组，获得重组穿梭载体Bacmid—NS1，经脂质体介导转染Sf9细胞后，得到重组杆状病毒(AcNPV-NS1)。SDS—PAGE、West-ern-blotting分析可见大小约为84000的特异性带，表明NS1蛋白在杆状病毒：Bac-To-Bac表达系统中成功地实现了表达。从而为研究其结构与功能创造了条件。     

绵羊肺炎支原体黏附因子的定点突变及原核表达

本研究采用点突变PCR方法成功克隆并表达了绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoiae,M.O)内蒙古分离株(SZWQ株)的黏附因子基因(SZWQ-860)。表达产物经SDS-PAGE电泳检测,与预期目的蛋白的大小一致,将重组蛋白纯化后经Western blot检测,结果表明重组蛋白具有良好的免疫反应性。     

猪肺炎支原体P102基因C末端序列的克隆及原核表达

应用DNA重组技术，将猪肺炎支原体P102的C末端基因克隆到pET-28a表达载体上，并构建了重组表达载体；将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21，用终浓度为1．0mmol／L的IPTG诱导5h，然后用Bug BusterTM Ni—NTAHis·Bind纯化试剂盒在自然条件下对目的蛋白进行纯化。ELASE检测结果表明：该蛋白具有良好的生物学活性。利用纯化蛋白制备高免血清为检测P102蛋白在真核系统中的表达奠定基础。     

猪肺炎支原体p97 R1区基因和大肠杆菌LTB基因的重组和表达

本研究从猪肺炎支原体的主要抗原蛋白及其免疫特点出发,将猪肺炎支原体纤毛粘附决定区R1区基因和具有黏膜免疫佐剂作用的大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(the B subunit of heat-labile enterotoxin LTB)基因重组表达,并且单独表达了R1区基因。将扩增的目的片段插入到表达载体pET-28a(+)中,分别构建了两个原核表达质粒pET28a(+)-rLTBR1和pET28a(+)-rR1,诱导表达了两个融合蛋白rLTBR1和rR1。对表达的目的蛋白进行了SDS-PAGE和Western blot检测,结果表明,表达的蛋白为特异的蛋白。本试验为进一步的研究rLTBR1融合蛋白在黏膜免疫方面的作用打下了基础。     

猪肺炎支原体P46基因的克隆及序列分析

根据GenBank中登录的猪肺炎支原体J株P46基因序列设计一对引物,扩增得到P46全基因序列,将克隆得到的P46基因片段克隆至pEasy-T载体中进行测定.将SC株P46基因与232株、J株、7448株及168株进行比对,结果表明SC株与这些株同源性分别为99.9%、99.6%、99.2%、99.0%.     

猪肺炎支原体特异性蛋白P36基因的克隆与表达

根据Genbank中猪肺炎支原体P36基因序列设计一对特异性引物,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增出猪肺炎支原体ZCF23株特异性蛋白P36基因序列,经测序确认后,克隆人原核表达载体pGEX 6p-1的EcoR I和Xho I位点之间,转化宿主菌BL21,将筛选出的阳性克隆用IPTC诱导,通过SDS-PAGE电泳进行鉴定,结果表明,P36蛋白基因获得了表达,这为猪肺炎支原体免疫检测与诊断提供了重要条件.     

猪肺炎支原体168株P97基因的克隆与表达

根据GenBank中猪肺炎支原体P97基因序列设计1对特异性引物,通过PCR扩增出猪肺炎支原体168弱毒株特异性黏附因子P97抗原决定簇基因部分序列,经测序确认后,克隆入原核表达载体pET-32a,转化宿主菌BL21,将筛选出的阳性克隆用IPTG诱导,通过SDS-PAGE进行鉴定,Western blot证明所表达的重组蛋白具有猪肺炎支原体抗原性,这为猪肺炎支原体免疫检测与诊断提供了重要条件。     

猪肺炎支原体P159蛋白的截短表达及黏附活性研究

为了解猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)P159蛋白的黏附活性,本实验利用PCR从Mhp NJ株扩增P159基因片段(3’端),克隆于pET-28a(+)进行表达,并用表达的截短蛋白进行黏附试验。结果表明,PCR扩增的目的基因片段约为450 bp;SDS-PAGE检测重组蛋白分子量为46 ku;western blot检测表明该重组蛋白能够与Mhp阳性血清发生特异性反应,表明该蛋白具有良好的免疫反应原性;表达的截短蛋白与Mhp的黏附试验结果表明,该重组蛋白可以粘附于猪肺上皮细胞(SJPL)表面,并部分抑制Mhp对SJPL的粘附作用。本研究结果为Mhp致病机制的进一步研究奠定了基础。     

猪气喘病的净化——猪支原体肺炎的研究进展

猪气喘病是由猪肺炎支原体引起的一种传染病。临床特征以咳嗽、气喘、呼吸困难为主，死亡率虽然低，但感染率很高，感染猪发育迟缓，生产速度减慢，加上药费的增加，给猪场造成严重的经济损失，所以净化该病就成了养猪企业一直关心的问题。本期主题将重点向读者介绍一下猪气喘病的净化措施。[编者按]     

两例猪支原体肺炎的治疗

猪支原体肺炎又称猪喘气病、猪地方性流行性肺炎．是猪的一种慢性接触性传染病，其病原是猪肺炎支原体寄生于呼吸道而引起的一种高接触性传染病，国外称为猪地方性肺炎（SEP）我国称为猪气喘病或喘气病。     

猪胸膜肺炎放线杆菌自动转运黏附素基因的克隆与表达

为了研究猪胸膜肺炎放线杆菌保护性免疫机制,试验筛选猪胸膜肺炎放线杆菌3~8 kb随机基因组文库,获得1株阳性克隆,测序拯救质粒得到序列,通过Blast分析确定此片段为猪胸膜肺炎放线杆菌自动转运黏附素(AT-Adhensin)基因,根据序列设计特异性引物PCR扩增该基因,分子克隆表达该黏附素蛋白。结果表明,该蛋白与猪传染性胸膜肺炎康复期血清发生反应。     

猪支原体肺炎的流行及诊治

本病是由猪肺炎支原体引起的接触性传染病,又称猪地方流行性肺炎,习惯称猪气喘病。1流行病学病猪和带毒猪是本病的主要传染源。新疫区多是由于引进带菌猪,未经严格检疫和隔离观察,便混进健康猪群,从而引起本病的暴发流行。老疫区带菌母猪起着最主要的传播作用。这类病母猪,在一定时期内带菌,并向体外排菌,感染其所产仔猪,而且大多数都能发病。     

猪支原体肺炎的诊断与治疗

猪支原体肺炎又叫猪地方流行性肺炎、猪霉形体肺炎,俗称猪气喘病。是一种慢性呼吸道病。病原体为猪肺炎支原体,属支原体科支原体属。病猪和带菌猪是本病的传染源,病猪与健康猪直接接触,通过病猪咳嗽、气喘和喷嚏将含病原体的分泌物喷射出来,形成飞沫．经呼吸道而感染。本病一年四季均可发生,但以冬春季节较为常见;     

猪支原体肺炎的防治措施

猪支原体肺炎,又称猪气喘病,是由猪肺炎支原体引起的一种高度接触性、慢性呼吸道传染病,特征是咳嗽和气喘。该病发病率高,流行广,但死亡率不高。然而猪场一旦感染,很难彻底清除,给养猪户造成了一定的经济损失。     

猪肺炎支原体P102基因的突变

猪肺炎支原体是引起猪地方性喘气病的病原。人们预测猪肺炎支原体p102基因是猪肺炎支原体潜在的黏附因子。在p102基因中有七个密码子TGA，在猪支原体中编码色氨酸，而在原核和真核细胞中TGA为终止密码子。因此，为了将p102基因在原核与真核系统中表达，需将TGA突变成TGG。从猪肺炎支原体Yin-1株扩增p102基因（全长2700bp），将其分为A（1bp-936bp）、B（937bp-1665bp）、C（1666bp-2700bp）-S-段分别克隆进pMD-18T载体上，通过定点PCR方法把A段四个和C两段三个编码Trp的密码子TGA突变为TGG，每突变成功一个密码子后都要连接到pMD-18T载体上送测序。最后将突变成功三段基因按A＋B＋C的顺序相连亚克隆到pMD-18T载体上，得到质粒pMD-18T—P102。测序结果用MegAlign软件与国际标准菌株232进行比较，P102基因中七个TGA已经成功突变成TGG。P102基因定点突变的成功为其在原核和真核系统中的表达奠定了良好的基础，亦对猪肺炎支原体疫苗研制具有重要意义。