新城疫病毒核酸检测标准物质研究

分别设计了3对引物,从灭活新城疫病毒F48E9株和Lasota疫苗株病毒提取的RNA中扩增了完整的M、FA和HN基因编码序列,并克隆于pGEM-T.经测序确认后,采用体外转录方法制备了6种RNA纯品.初步定量后,用RNA保存液稀释至含量约108拷贝数/mL,分装.分装后均一性检测结果显示瓶间差异<5%,稳定性实验表明室温20~25℃(相对湿度20%~50%)14天稳定;长期监测结果表明:2~8℃6个月及-20℃保存1年的含量均无明显变化.委托多家实验室采用外标实时荧光定量RT-PCR检测方法对制备的标准物质进行准确定值.以上结果表明该制备物可以作为新城疫病毒的核酸检测标准物质.     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒国家核酸标准物质的研制

为了研制高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)国家核酸标准物质,将PRRSV美洲变异株代表毒株PRRSV JXA1接种Marc145细胞,出现细胞病变后,反复冻融并收集病毒液,并灭活分装。制备后进行均匀性、稳定性评估、数字PCR法定值、不确定度分析和临床试用。结果表明,制备的标准物质的定值为:(1.13±0.18)×10~4拷贝/μL,样品均匀;-20℃可稳定保存12个月以上、4℃可稳定2个月以上。经全国标准物质管理委员会的专家评审,该制备物达到了国家二级标准物质要求,可以作为核酸扩增检测PRRVS的核酸标准物质。     

核酸标准物质研究现状

以核酸扩增为基础的分子诊断技术越来越广泛的应用于医学研究、出入境检验检疫、疫病诊断等领域,核酸标准物质是保证体外诊断检测数据和结果准确一致的重要材料。作者介绍了国内外核酸标准物质的发展历史、研究现状及面临的挑战,展望了核酸标准物质未来发展方向。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株国家核酸标准物质的研制

为了研制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)欧洲株国家核酸标准物质,将PRRSV欧洲株代表毒株LV接种Marc145细胞,待出现细胞病变后,反复冻融收集病毒液,并灭活分装。制备后进行均匀性评估、稳定性评估、数字PCR法定值、不确定度分析和临床试用。结果显示,制备的标准物质的定值为(1.83±0.22)×10~4 copies/μL;样品均匀;-20℃稳定保存12个月以上,4℃稳定2个月以上。经全国标准物质管理委员会的专家评审,该制备物达到了国家二级标准物质的要求,可以作为核酸扩增检测的PRRSV核酸标准物质。     

新城疫病毒LaSota株检测用国家核酸标准物质的研制

为满足禽类及禽类产品质量安全检测领域对标准物质的需求,将新城疫病毒(NDV)LaSota株接种于9日龄SPF鸡胚,72 h后收集鸡胚尿囊液,经灭活后分装、冻干,制备新城疫病毒LaSota株核酸标准物质.对该标准物质开展了均匀性评估、稳定性评估、标准物质定值、不确定度评定和临床适用性评价.结果表明,该标准物质均匀性、稳定...     

亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒核酸检测标准物质的制备研究

针对目前口蹄疫病毒核酸扩增检测缺乏标准物质的现状,以口蹄疫病毒亚洲Ⅰ型核酸为模板,分别设计引物扩增具有检测意义的5′端1nt～2208nt的片段(含完整的5′NCR)和3012nt～5155nt片段(含完整1D～2B区域),并克隆于pMD20-T。测序后采用体外转录方法制备2种RNA纯品,进行初步定量稀释后等量混合分装。采用荧光定量RT-PCR方法进行均匀性和稳定性检验后,委托外部实验室对RNA片段进行拷贝数定值。结果显示,制备的标准品均匀性和稳定性良好。     

猪伪狂犬病病毒gE基因核酸探针的制备

伪狂犬病（pseudorabies,PR）又称Aujeszky氏病,是由伪狂犬病病毒引起的猪、牛、羊等多种家畜、家禽及野生动物的一种以发热、奇痒（猪一般除外）、呼吸和神经系统疾病为特征的重要传染病。控制和消灭伪狂犬病所面临的主要困难是伪狂犬病病毒的潜伏感染问题。目前,OIE推荐使用基因缺失疫苗,我国农业部已决定只生产和使用基因缺失疫苗。已有的商业化基因缺失疫苗普遍缺失了啦基因。随着基因缺失疫苗的广泛使用,迫切需要一种有效的检测强毒及其潜伏感染的诊断方法与之配套,因此进行了利用缺失的gE基因制备核酸探针的研究。     

猪瘟病毒C株检测用国家核酸标准物质的研制

为研制均匀、稳定的猪瘟病毒（CSFV）核酸标准物质,选择CSFV C株接种于PK-15细胞并收获病毒液,然后经过病毒灭活、分装、冻干,最终形成核酸标准物质。用微滴式数字PCR对制备的CSFV标准物质进行均匀性和稳定性评估、标准物质合作定值,在评定不确定度后计算得出最终量值结果,并开展临床试用。结果显示,该标准物质均匀,4 ℃条件下可稳定存放4周,25 ℃可稳定存放1周,-20 ℃可稳定存放11个月,量值结果为（5.1±0.7）×105 copies/mg;临床试用显示,所制备的标准物质与临床样本的互通性良好。本研究制备的CSFV C株国家核酸标准物质均一性良好、稳定、量值准确度高,并通过了全国标准物质管理委员会评定,可用于动物及动物产品质量安全检测,从而有效保障猪瘟防治工作的开展。     

伪狂犬病病毒HS株tk基因的PCR扩增与克隆

参照伪狂犬病病毒（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓ,ＰＲＶ）ＮＩＡ－３株ｔｋ基因序列,设计并合成１对长２２ｍｅｒ的引物,引物间距１．５ｋｂ,其内包含完整的ＰＲＶｔｋ基因。以ＢＨＫ２１细胞繁殖的ＰＲＶ湖北地方强毒株（ＨＳ－９３０４）基因组为模板进行ＰＣＲ扩增。琼脂糖凝胶电泳检测显示扩增主带清晰,长约１．５ｋｂ,符合设计要求。扩增片段克隆至由ｐＵＣ１８质粒改制而成的Ｔ载体中,限制性内切酶ＢａｍＨＩ、ＳｍａⅠ、ＸｈｏⅠ、ＨｉｎｄⅢ酶切分析证实,扩增片段的酶切位点与ｔｋ基因一致,说明扩增和克隆片段包含ＰＲＶｔｋ基因。     

猪圆环病毒1型和2型核酸定性标准样品的研制

为了研制猪圆环病毒1型(PCV1)、猪圆环病毒2型(PCV2)核酸定性标准样品,分别将PCV1和PCV2病毒全序列克隆至pMD18-T载体中并进行稀释分装。制备后进行均匀性评估、稳定性评估、定值和临床试用。结果:制备的标准样品的参考值分别为:1.33×10⁴ copies/μL(PCV1)和1.11×10⁴ copies/μL(PCV2);样品均匀;-20℃可稳定保存24个月以上,4℃可稳定2个月以上。经国家标准化管理委员会组织的专家评审,达到了国家标准样品的要求,可作为核酸扩增检测的猪圆环病毒核酸标准样品。     

肽核酸与基因表达

肤核酸(PNA)是一类人工合成的核酸类似物,PNA与核酸链以Waston-Crick碱基配对方式稳定互补结合,具有高度的亲合性、稳定性、特异性特征,PNA能调节基因的表达作用,包括调节基因的复制、转录(或逆转录)、翻译过程,因此PNA有着广泛的分子生物学效应,显示出作为基因调节药物的应用潜力.     

口蹄疫病毒核酸试纸条检测方法的建立

本研究通过核酸探针与免疫层析相结合的方法,建立了一种简单、敏感、特异的检测口蹄疫病毒的方法。试验利用RT-PCR方法获得口蹄疫病毒3D核苷酸片段,在引物中设计了灵敏度高、特异性好的核酸探针--生物素和地高辛,使扩增产物结合探针。利用胶体金的放大原理将链霉亲和素与金颗粒形成胶体金混合物,从而与RT-PCR产物中的生物素探针结合。硝酸纤维素膜上端标记生物素化山羊抗兔IgG作为指控条带,下端标记抗地高辛抗体以捕获RT-PCR产物中的地高辛探针。组装金标试纸条,检测RT-PCR产物,结果表明该核酸试纸条可以检测到 0.3×10^-3~3×10^-3 μg/μL,敏感性高于琼脂糖凝胶电泳,两种方法的符合率高,核酸试纸条检测方法是一种敏感性高、成本低且费时短的新型检测方法。该方法为口蹄疫病毒检测提供了一种新的思路。     

猪瘟病毒核酸检测国家级能力验证结果分析

对猪瘟病毒核酸的检测是实验室检测猪瘟感染的主要手段。为全面考察动物疫病检测机构对猪瘟病毒核酸的检测能力，国家认证认可监督管理委员会（以下简称“认监委”）组织了A类能力验证项目“猪瘟诊断检测技术”（CNCA-19-A01），该项目由中国兽医药品监察所国家/OIE猪瘟参考实验室（以下简称：参考实验室）承担。参考实验室负责制备了检测样品，并进行随机编号。向每个参试实验室发放4份待检盲样，不限定检测方法，参试实验室对各个盲样进行定性判断，并向参考实验室提供检验结果及原始检验报告。出现“不满意”结果的单位可参加补测一次，若补测结果仍为“不满意”，则表明该实验室暂不具备该参数的检测能力。参加本次猪瘟病毒核酸检测的实验室共有97家，初测满意率为93.81%，初测和补测的总体满意率为98.97%。此次能力验证结果表明，我国90%以上猪瘟检测机构能够提供正确的检测结果，可以满足猪瘟诊断和监测的需求。对不达标机构，通过本次能力验证项目查找出了存在的问题，帮助该单位及时纠正错误，进一步提升猪瘟诊断能力。     

Development of Nucleic Acid Lateral Flow Immunoassay Detection Method for Foot-and-mouth Disease Virus

In this article, through the combination of nucleic acid probes and immune chromatography, a simple, sensitive and specific detection system——nucleic acid lateral flow immunoassay (NALFIA) for amplifing foot-and-mouth disease virus (FMDV) 3D RT-PCR products was established.An ultrasensitive nucleic acid biosensor (NAB) based on streptavidin-labeled gold nanoparticles dual labels and lateral flow strip biosensor (LFSB) were used in this system.The biotinylated goat anti-rabbit IgG was marked to the NC membrane as the alleged strip and the anti-digoxin antibody was labeled to the NC membrane to capture the digoxin probe.After assemblying gold-labeled strip and detecting RT-PCR products, the detection limit of NALFIA was 0.3×10^-3 to 3×10^-3 μg/μL.The NALFIA was compared with agar gel electrophoresis analysis, the results showed that the sensitivity of NALFIA was higher than agar gel electrophoresis.There was an excellent agreement between the two methods.NALFIA was a method with high sensitive, low cost and short time.In conclusion, this method provided a good alternative to detect FMDV.     

应用猪繁殖与呼吸综合征核酸标准物质比较5种核酸提取试剂盒

为比较不同核酸提取试剂盒对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）核酸的提取效率,使用国家标准物质“猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲经典株核酸标准物质”作为模拟样品,分别使用试剂盒A、B、C（磁珠法）以及试剂盒D、E（柱式法）等5种核酸提取试剂盒进行核酸提取,然后通过荧光RT-PCR和数字RT-PCR方法评估提取效率,并分析不同基质对提取效率的影响。结果显示：5种试剂盒均能有效提取PRRSV RNA,其中磁珠法的提取效率高于柱式法;试剂盒B和C对PRRSV RNA的提取效率较高;基质会对提取效率造成影响,精液和抗凝血对试剂盒提取效率的影响较大。综上,试剂盒B、C均可适用于猪繁殖与呼吸综合征临床样品的核酸提取。实际操作中,应根据实验室条件、样品数量、样品类型和时间要求等因素,选择应用合适的提取试剂盒。     

狂犬病病毒糖蛋白原核表达及纯化

试验旨在提高狂犬病病毒(rabies virus,RV)糖蛋白(G)在大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中的表达量。通过优化蛋白质诱导表达的温度、时间、诱导剂浓度等条件,以提高该蛋白质的表达量。SDS-PAGE电泳分析结果显示,重组质粒在1 mmol/mL IPTG、30 ℃诱导6 h条件下蛋白表达量最高,经GST-resin亲和层析柱法纯化获得的纯化蛋白约为36 ku,与预期大小相符。Western blotting结果显示,表达蛋白具有很好的免疫原性和特异性。结果表明,RV G融合蛋白的优化表达和纯化为RV亚单位疫苗及中和抗体的研制奠定了基础。     

嵌合犬瘟热病毒H基因的重组狂犬病病毒的构建及免疫原性研究

【目的】构建表达犬瘟热病毒（CDV）血凝素蛋白H基因的重组狂犬病病毒（RABV）,并研究其生物学特性及免疫原性。【方法】在RABV HEP-dG株基因组G与L基因之间插入CDV H基因,构建重组全长cDNA质粒pHEP-dG （H）。将pHEP-dG （H）与辅助质粒共同转染BHK细胞,拯救携带CDV H基因的重组RABV HEP-dG （H）。将重组病毒接种BHK细胞,分析病毒的扩散能力;将重组病毒接种小鼠,分析病毒的致病性和免疫原性。【结果】RT-PCR及直接免疫荧光显示,传至第3代的病毒仍能检测到H基因,表明CDV H基因已成功插入RABV基因组中,并在HEP-dG （H）中稳定遗传和正确表达。HEP-dG （H）在BHK细胞中的生长曲线与HEP-dG毒株相似,病毒滴度在96 h达到峰值,但HEP-dG （H）的滴度在每个时间点略低于HEP-dG。以感染复数（MOI）为0.005感染BHK细胞,HEP-dG （H）的扩散能力比HEP-dG毒株低。HEP-dG （H）与HEP-dG对6周龄成年小鼠均不致死,但HEP-dG （H）对成年小鼠体重的影响弱于HEP-dG。HEP-dG （H）与HEP-dG均能诱导小鼠产生抗RABV的中和抗体,免疫后7 d抗体已达到保护水平（0.5 EU/mL）;此外,HEP-dG （H）可诱导产生CDV中和抗体。HEP-dG （H）与HEP-dG免疫小鼠3周后,均能抵御RABV标准攻毒毒株CVS-24的攻击。【结论】本研究成功构建重组RABV HEP-dG （H）,其具有良好的免疫原性和安全性,可作为RABV-CDV新型二联基因工程候选疫苗。