4种芽孢杆菌来源木聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达及酶活分析

研究旨在比较4种不同来源木聚糖酶基因在大肠杆菌E.coli BL21中表达后的酶活等性质,为生产中筛选高表达量及耐极性木聚糖酶基因提供依据。根据已发表的木聚糖酶基因序列设计引物,分别扩增出浸麻芽孢杆菌(B.macerans)B3、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)B6、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)B10和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)B12的木聚糖酶基因片段,经克隆表达后获得4种工程菌。经培养和IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳检测及酶特性分析。测序结果表明,4个基因的开放阅读框均为642 bp。其中前3种木聚糖酶基因均为首次报道。4种重组木聚糖酶在55℃下的酶活分别为:36.16、3.85、7.22、98.98 U/ml。4种重组木聚糖酶的最适反应温度均在50~60℃,且枯草芽孢杆菌木聚糖酶最为耐热。结果提示,枯草芽孢杆菌来源的木聚糖酶具有较高的酶活和较好的耐热性。     

动物肠道益生菌地衣芽孢杆菌的筛选及培养基的优化

为了研制新型微生态制剂,以常用益生菌株--地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）为试验菌株,在测定了初发菌株的极限耐受性后,运用紫外诱变技术筛选到了一株耐酸性较强,耐胆汁,耐高温的地衣芽孢杆菌D-11.其极限耐受条件为：pH 4.18,胆盐浓度0.4 g/L,温度58 ℃.并通过试验对该菌株进行了形态和生理生化特征的鉴定.最后通过单因素和正交试验对地衣芽孢杆菌D-11的发酵培养基成分配比进行了选择和优化,为以后的工业化生产提供依据.结果显示当培养基的配比浓度为：玉米淀粉15 g/L、豆粕粉90 g/L、玉米浆6 g/L时菌体的培养效果最好.     

耐高温α-淀粉酶的研究进展

α-淀粉酶（α-amylase）广泛地存在于动植物和微生物中,它是一种内切葡萄糖苷酶,是目前最重要的工业酶制剂之一.当今广泛使用的酶制剂始于1906年,人类发现了用于液化淀粉生产乙醇的细菌淀粉酶,首先应用于工业的α-淀粉酶来自于真菌.由于一些细菌α-淀粉酶具有耐高温、耐酸、耐碱等特性，更符合工业生产中的某些极端条件，因此，目前在需高温的发酵等工业中使用最为广泛的是细菌α-淀粉酶，尤其是来自杆菌（如解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌）的耐高温α-淀粉酶已占据相当大的市场。     

地衣芽孢杆菌与其他微生物产酶能力的比较

试验对能在动物肠道产酶的芽孢产品—“益畜宝”的有效成分—地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的产酶特性进行了初步定性研究。在单一碳源培养基上的观察结果表明，该地衣芽孢杆茵能产生植酸酶、淀粉酶及蛋白酶。相同的试验条件下，大肠杆菌和啤酒酵母菌都不产生植酸酶。实验结果还表明，大肠杆菌虽然能产生淀粉酶和蛋白酶，但其活性比地衣芽孢杆菌要低得多，而啤酒酵母菌则不产生淀粉酶和蛋白酶。     

几株芽孢杆菌产消化酶分析

为探索地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌N1、SH、TCP、B1、B2株产生消化酶(淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶)的能力,采用鉴别培养基进行筛选比较。结果显示,不同菌株产消化酶的能力相差很大,其中地衣芽孢杆菌产淀粉酶的能力最强,产蛋白酶的能力较弱,不产脂肪酶;B1株纳豆芽孢杆菌产蛋白酶的能力最强,产淀粉酶能力却最弱;除地衣芽孢杆菌,其他6株芽孢杆菌都产生脂肪酶。     

中温α-淀粉酶酶学性质的研究

从地衣芽孢杆菌得到的α-淀粉酶的理化性质进行了研究,结果表明:该酶的最适pH是6,pH在5～6.5时酶活比较稳定.最适反应温度是60 ℃,高于75 ℃后,酶活下降很快.Ca2+、Mn2+ 和Mg2+对该酶活力具有较明显的促进作用,乙二胺四乙酸(EDTA)对酶活具有较强的抑制作用.该酶是Ca2+依赖性型淀粉酶,添加0.01 mol/L的Ca2+能明显提高酶活力,添加0.125 mol/L,的Ca2+还能明显提高酶的热稳定性.     

表达β-1，3-1，4-葡聚糖酶的基因工程酵母菌株

本专利利用基因工程手段，通过毕赤酵母生产葡聚糖酶。将重组酵母进行诱导发酵，对重组酶进行初步酶学性质分析表明，最适反应pH约为5．5，最适反应温度约为55℃。从芽孢杆菌菌株Bacillus licheniformis EGW039中克隆出β-（1，3）-（1，4）葡聚糖酶基因，将不带有DNA原基因信号肽编码序列的β-（1，3）-（1，4）葡聚糖酶基因插入到毕赤酵母表达载体pMETaA上.     

桑树内生枯草芽孢杆菌TasA基因的克隆及序列分析与表达产物的抑菌作用

TasA是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在芽孢的形成过程中产生的蛋白,对多种动、植物病原菌有较强的抑制作用。从桑树内生枯草芽孢杆菌菌株ME0717基因组DNA中克隆到TasA基因的全序列,包含一个786bp的完整开放阅读框(ORF),GenBank登录号为FJ713582。该序列与来源于B.subtilis的已知同源TasA序列Z99116、AJ871386的相似性达99.0%和98.1%,与芽孢形成相关的基因YqhF(GenBank登录号:BACJH642)的序列相似性也达99.0%,而与来源于地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的TasA序列(GenBank登录号:AE017333)相似性仅有46.0%,与来源于其它芽孢杆菌属的金属蛋白酶基因和芽孢外壳相关蛋白基因也有较高的相似性。构建该基因的原核表达载体,并在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中获得表达,表达产物对桑疫病病原细菌的菌体生长以及桑漆斑病菌和桑炭疽病菌的菌丝生长均有一定程度的抑制作用。     

地衣芽孢杆菌谷氨酸消旋酶基因克隆、原核表达及生物信息学分析

为了进一步分析谷氨酸消旋酶的结构和生物信息功能,试验以γ-PGA生产菌株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) DY136为材料,PCR扩增其谷氨酸消旋酶基因(racE),纯化racE基因进行原核表达,并运用多种在线生物信息学分析软件对该基因编码蛋白质的理化性质、亲/疏水性、信号肽、结构域等进行分析。结果表明：PCR扩增racE基因条带大小为819 bp,对racE基因进行大肠杆菌原核表达,通过构建表达载体和优化表达条件,成功表达了大小为30.15 ku的重组融合蛋白。racE蛋白编码272个氨基酸,氨基酸序列与NCBI中公布的地衣芽孢孢杆菌racE蛋白(GenBank登录号为KAA0845975.1)氨基酸同源性为99.62%。racE蛋白理化性质稳定,是亲水蛋白,无跨膜结构域,不含有信号肽,α-螺旋是其主要的二级结构,主要定位于细胞质中(73.90%)。说明racE基因保守且相对稳定,在谷氨酸的合成中发挥重要作用。     

地衣芽孢杆菌PCR检测方法的建立与初步应用

参照Gen Bank中登录的地衣芽孢杆菌促旋酶B亚单位(gyr B)基因,设计1对引物,扩增片段大小为507 bp的基因片段。该方法对地衣芽孢杆菌检测的灵敏性为1 pg总DNA量,对地衣芽孢杆菌DNA的扩增结果为阳性,对照菌株扩增结果均为阴性,成功地建立了地衣芽孢杆菌PCR检测方法。该方法具有快速、灵敏度高、特异性强等优点,为地衣芽孢杆菌的分离及鉴定奠定了良好的基础。     

猪源芽孢杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

从自然生长的健康猪肠道中分离到13株芽孢杆菌,通过生理生化试验初步鉴定其中9株为枯草芽孢杆菌,2株为巨大芽孢杆菌,1株为地衣芽孢杆菌,1株为凝结芽孢杆菌;对这13株芽孢杆菌分别进行了耐酸性试验、耐胆盐试验、体外抑菌试验和动物安全性试验。结果表明,其中1株地衣芽孢杆菌B7株和1株枯草芽孢杆菌B9株均有较强的耐酸、耐胆盐能力,对致病性大肠杆菌具有较好的体外抑制能力,且均安全无毒,可作为动物用益生菌制剂的候选菌种。     

MTT-分光光度法快速测定地衣芽孢杆菌发酵液活菌数的研究

试验以地衣芽孢杆菌发酵液为研究对象,旨在建立1种快速、稳定、灵敏度高的活菌计数方法,并探讨MTT-分光光度法用于活菌计数的可行性。试验筛选显色反应终止液最适浓度、最适反应波长、最适反应时间、最适菌液浓度等,考察不同培养基、培养液保存后和其他干扰物对测定结果的影响,并对比MTT-分光光度法与稀释平板法测定发酵菌液中地衣芽孢杆菌活菌数结果的关系。结果显示,在最大吸收波长550 nm处测定OD值,反应时间为1 h,反应终止液为1.0 mol/L盐酸,MTT添加量为0.2 mL,新鲜的地衣芽孢杆菌发酵液OD值>0.04。菌液浓度为10⁸～10⁹ CFU/m L时,OD_{550 nm}值与稀释平板法得到的活菌数具有很好的线性对应关系,当菌液浓度<10⁸ CFU/mL时对应关系不再成立。研究表明,活菌量>10⁸ CFU/mL时,MTT-分光光度法不受地衣芽孢杆菌生长阶段的影响,可准确计量地衣芽孢杆菌发酵液活菌量相对应的吸光度,从而快速、准确地检测活菌数。     

不同种属芽孢杆菌对彭泽鲫生长性能、背肌营养成分、肠道结构及消化酶活的影响

为探究饲料中添加不同种属芽孢杆菌对彭泽鲫（Carassius auratus var. Pengze）生长性能、背肌营养成分、肠道结构及消化酶活性的影响，试验选取体质健壮初始体重为（25.07±0.21）g的彭泽鲫500尾，随机分成5组，每组4个重复，每个重复25尾，分别饲喂添加0（对照组）、1.5×108 cfu/g枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）、复合菌（地衣芽孢杆菌：凝结芽孢杆菌=1：1）的5种等氮等能饲料。在流水水族箱中开展60 d饲喂试验。试验结果表明：在饲料中分别添加枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌及复合菌均能显著提高彭泽鲫的增重率和特定生长率，显著降低饲料系数（P < 0.05），其中复合芽孢杆菌组促生长作用更明显|地衣芽孢杆菌组及复合芽孢杆菌组彭泽鲫的肠道绒毛高度均显著提高（P < 0.05）|彭泽鲫饲喂含枯草芽孢杆菌及复合芽孢杆菌的饲料后，其肝胰脏淀粉酶、中肠胃蛋白酶及血清脂肪酶活力均显著提高（P < 0.05）|同时，饲喂彭泽鲫含芽孢杆菌的饲料后，彭泽鲫背肌营养成分无显著变化（P ＞ 0.05）。综上所述，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌均能促进鱼类生长，调节肠道健康|其中复合芽孢杆菌对肠道结构及酶活性的影响效果最佳。 [关键词] 芽孢杆菌|彭泽鲫|生长性能|肠道结构|消化酶     

提高微生物纸片法检出限的探讨

为提高纸片法检测抗生素残留量的检出限,试验以嗜热乳酸链球菌(S.T)、地衣芽孢杆菌(B.S)、蜡样芽孢杆菌(B.C)和嗜热脂肪芽孢杆菌(B.L)作为试验菌,选择3种兽医临床常用抗生素,进行了最适培养基、培养温度、细菌量的筛选以及抗生素最低检出限筛选的研究。结果显示:S.T、B.S和B.L均在LBM I培养基中生长较好,最适培养温度分别为49、49、58℃,最适细菌量分别为50、50、100μg/mL;B.C在NA培养基中生长较好,最适培养温度为37℃,最适细菌量为50μg/mL。用优化的检测条件得到:B.L检测庆大霉素残留量最低检出限为0.05μg/mL;B.S检测多西环素残留量最低检出限为0.12μg/mL;B.C检测替米考星残留量最低检出限为0.125μg/mL。试验菌种类和菌量对微生物纸片法检测结果影响较大,其次是培养温度和培养基。     

地衣芽孢杆菌M109高密度发酵条件的优化

试验旨在筛选一株地衣芽孢杆菌M109(Bacillus licheniformis M109)进行培养基和发酵条件的优化。采用单因素试验方法筛选出最佳碳源和氮源的培养基,并利用正交试验方法确定其最佳的碳氮比。为了继续提高地衣芽孢杆菌M109的发酵水平,研究其在发酵过程中的生长曲线、pH和溶氧(DO)水平的变化曲线,通过对发酵过程中生长参数的测定,优化了地衣芽孢杆菌M109最佳的接种量和最适pH。结果发现,溶氧限制是地衣芽孢杆菌M109生长的关键因素;在限定通风量的条件下,通过调节搅拌转速的方法来提高培养基中的溶氧水平,提高发酵密度;通过流加培养基的方法也能提高地衣芽孢杆菌M109的发酵水平。因此,通过对培养基和发酵条件的优化,使地衣芽孢杆菌M109的发酵水平由最初的1.0×10⁹ CFU/mL提高到1.2×10¹⁰ CFU/mL,芽孢形成率为88%。     

饲用地衣芽孢杆菌抗逆性与益生性的体外评价

为了探讨地衣芽孢杆菌的抗逆性与益生性,研究通过5个试验评定地衣芽孢杆菌的耐高温、耐酸性、耐胆盐、抑菌性和黏附性,于85℃水浴分别处理地衣芽孢杆菌2.5 min、5 min、7.5 min模拟制粒条件;利用pH值分别为2,3,4的人工胃液模拟胃液环境;用0.3%的胆盐模拟肠液环境;抑菌试验测定地衣芽孢杆菌发酵液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑制能力;以蛋鸡肠道上皮细胞为模型测定地衣芽孢杆菌的黏附能力。结果表明:85℃处理地衣芽孢杆菌2.5 min后活菌数最高,与对照组相比提高了2.25%(P>0.05);用pH值为2,3,4的胃液分别处理,与对照组相比活菌数分别提高0.77%(P>0.05)、1.54%(P>0.05)、1.34%(P>0.05);地衣芽孢杆菌发酵液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌环直径分别为0和16.16 mm;在黏附性试验中,每100个蛋鸡肠道黏膜上皮细胞上平均可以黏附27个地衣芽孢杆菌。说明制粒过程、人工胃液、人工肠液不影响地衣芽孢杆菌的活菌数,地衣芽孢杆菌对金黄色葡萄球菌有显著抑制作用,使金黄色葡萄球菌基本不能在蛋鸡消化道内定植。     

一株土壤源高产纤维素酶芽孢杆菌的分离与鉴定

为了获得产纤维素酶的芽孢杆菌,从河南省不同地方采集玉米地、秸杆垛的土壤样品58份,利用刚果红平板法分离产纤维素酶的芽孢杆菌,采用3,5-二硝基水杨酸法测定纤维素酶活,结合菌落特征、显微形态、生理生化试验和16SrDNA序列进行鉴定。结果表明,从样品中分离出的42株产纤维素酶菌株中筛选出一株产纤维素酶较高的菌株B.LY02,纤维素酶活力可达0.5351U/mL。该菌株呈短杆状,革兰氏染色阳性,能形成芽孢。基于16SrDNA序列同源性比较分析表明该菌株与Bacillus licheniformis strain CICC10095的亲缘关系最近,基因序列的同源性为96.5%,因此鉴定该菌株为地衣芽孢杆菌。     

猪生物发酵床保育期垫料中效应细菌的筛选及鉴定

本试验对猪生物发酵床保育期垫料样品中效应细菌的组成和作用进行了研究,共获得了6株效应细菌;经纯培养后观察其个体与群体形态,并进行生化特征鉴定以及16S rRNA基因分析.结果表明,所得的6株效应细菌中,芽孢杆菌属(Bacillus sp.)细菌有4株,分别为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis);沙雷氏菌属(Serratia sp.)有1株,为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens);假单胞菌属(Pseudomonas sp.)有1株,为假单胞杆菌(Pseudomonas).     

耐酸性α-淀粉酶在家蚕生物反应器中的表达初探

本文克隆了全基因3 906bp的热脂环酸杆菌的耐热酸性α-淀粉酶,此酶表达的蛋白分子量为140KD,有1 301个氨基酸。将此基因重组克隆到家蚕杆状病毒表达转移载体pVL1393中,使用一般方法获得重组病毒,并将该病毒感染家蚕,则酸性α-淀粉酶在家蚕中正常表达,对表达产物进行检测,此表达酶有淀粉酶活性。     

一株高产α-淀粉酶的地衣芽孢杆菌的筛选及鉴定

芽孢杆菌属的一些菌株对动物和人类具有广泛的作用而被认为是益生菌,其中地衣芽孢杆菌是芽孢杆菌中较具有应用潜力的菌种之一.本文从健康的鸡、鸭、鹅、马、牛、羊粪便及周边土壤中分离出12株芽孢杆菌,并通过产总淀粉酶活性和α-淀粉酶活性筛选出6株产淀粉酶的芽孢杆菌,通过形态学分析、生理生化分析及分子鉴定,确定产酶性能最优的1株芽...