不同铜源对鸡嗉囊ATP7A和ATP7B基因和蛋白表达的影响

为研究不同水平的硫酸铜、微米氧化铜和纳米氧化铜对鸡嗉囊铜转运蛋白基因ATP7A和ATP7B mRNA相对表达量及蛋白表达量的影响,将105只1日龄的SPF蛋鸡随机分为7组,每组15只。第1组为对照组,饲喂低铜半纯化日粮;第2组~第4组,在基础日粮中分别以硫酸铜、微米氧化铜和纳米氧化铜的形式添加铜8 mg/kg;第5组~第7组,在基础日粮中分别以硫酸铜、微米氧化铜和纳米氧化铜的形式添加铜160 mg/kg,试验期30 d。结果表明,日粮中添加硫酸铜和纳米氧化铜显著提高雏鸡嗉囊铜含量(P0.05),微米氧化铜没有明显变化。与硫酸铜和微米氧化铜相比,纳米氧化铜显著提高雏鸡嗉囊ATP7A和ATP7B mRNA和蛋白表达量(P0.05)。由此可见,嗉囊ATP7A和ATP7B对纳米氧化铜的转运发挥重要作用。     

竞争性RT-PCR检测铜对Ctr1 mRNA表达的影响

为了应用竞争 RT- PCR法检测铜对猪传代肾细胞 (PK15 )中特异性铜转运蛋白 Ctr1基因 m RNA表达水平的影响 ,经 2次克隆 ,将筛选出一段 4 0 0 bp的核苷酸序列 ,插入 RT- PCR扩增出的 5 30 bp Ctr1目的片段中 ,构建了插入突变型 Ctr1- c DNA竞争模板。再将竞争模板与各试验组 c DNA同时进行 PCR扩增。结果 ,猪肾 PK15细胞 Ctr1基因m RNA表达量在 7.8～ 31.2 μmol/ L Cu范围内随铜添加浓度的升高减少 ,当铜添加浓度达到 6 2 .5 μmol/ L 时 ,其表达量又有所回升 ,呈双相反应。     

不同铜源对Caco-2细胞内铜-ATP酶二价金属离子转运体1和金属硫蛋白含量的影响

利用Caco-2细胞模型研究不同浓度硫酸铜,微米氧化铜,纳米氧化铜(铜水平2、4、8、16 mg/L)对细胞铜-ATP酶、二价金属离子转运体1(Divalent Metal Transporter 1,DMT1)、金属硫蛋白(metallothionein,MT)含量的影响。结果显示,培养液中添加铜离子能提高Caco-2细胞铜-ATP酶、MT含量,低浓度铜离子能提高细胞DMT1含量,高浓度铜离子降低细胞DMT1含量。纳米氧化铜对几种铜转运蛋白的作用与硫酸铜类似,但纳米氧化铜对铜-ATP酶、MT、DMT1含量的影响更加明显。     

鸡贫血病毒衣壳蛋白VP1基因的克隆、原核表达和纯化

根据GenBank中CAV哈尔滨分离株基因序列,设计出针对CAV VP1大片段(608 bp)的引物,利用PCR方法从CAV基因组序列中扩增出VP1基因的大片段(608 bp),按照正确的读码框克隆到原核表达载体pET32a( )上,得到含VP1大片段的pET32a( )重组子,转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导重组蛋白表达,经SDS-PAGE和Western blotting检测发现有分子质量约42 ku的融合蛋白表达,与预期分子质量大小一致,通过Ni亲和层析柱纯化出融合蛋白,经Western blotting鉴定,融合蛋白与His单抗能够结合.CAV VP1基因的克隆表达及其融合蛋白的纯化为后续制备多克隆抗体和单克隆抗体提供了良好的抗原来源,也为研究VP1与其他CAV蛋白之间的相互关系奠定了基础.     

不同铜源对仔猪生长发育和粪便铜含量的影响

为了研究日粮中不同铜源对仔猪生长发育及粪便中铜排泄量的影响,选用264头35日龄杜长大断奶仔猪,体重相近,随机分成4组:对照组饲喂基础日粮,A、B、C三个处理组分别以氨基酸微量元素螯合物、小肽微量元素螯合物和有机微量元素配制低铜复合微量元素添加剂替代基础日粮中的微量元素,测定仔猪生长性能、粪便中Cu含量及相关生化指标。结果表明:与对照组相比,A、B、C组仔猪的日增重分别增加了6.67%、4.44%和6.67%(P0.05),料重比分别下降3.78%、2.70%和3.78%(P0.05);在试验第35天,A、B、C组仔猪粪便Cu含量分别下降66.44%(P0.05)、81.85%(P0.05)和49.37%(P0.05),试验组血清中的Cu含量与对照组相比显著降低,总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)水平与对照组相比显著增加,铜蓝蛋白、碱性磷酸酶(AKP)和胰岛素生长因子-1(IGF-1)无显著差异(P0.05)。以低浓度氨基酸微量元素螯合物、小肽微量元素螯合物和有机微量元素补充铜源,可维持仔猪正常生长发育和饲料报酬及生理生化过程,但能显著降低粪便中的Cu的排泄量,尤以小肽微量元素螯合物为好。提示采用微量元素螯合物低浓度有机微量元素补充技术是集约化养猪粪便重金属减排源头控制的有效方法,应进行深入研究和推广。     

鸡源EphrinA2基因的克隆表达及其单克隆抗体研制

研究旨在研制抗鸡EphrinA2蛋白的特异性单克隆抗体。试验用PCR和同源重组技术构建了鸡EphrinA2真核及原核表达载体,以纯化的EphrinA2原核表达产物免疫小鼠,将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,用间接ELISA方法筛选出阳性细胞克隆;用SDS-PAGE、间接免疫荧光试验和Western blot验证表达产物及单抗的特性。结果显示：原核表达的重组蛋白His-EphrinA2-RBD主要位于细菌包涵体中;获得2株能稳定分泌抗EphrinA2蛋白特异性抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为4H6和1G9;单克隆抗体4H6不仅能特异性识别真核表达载体pcDNA3.1-EphrinA2在DF-1细胞中表达的EphrinA2蛋白,而且能有效识别LMH和DF-1细胞中内源性的EphrinA2蛋白。结果表明,单克隆抗体4H6与鸡EphrinA2蛋白反应性和特异性均良好,能够应用于鸡EphrinA2相关基础研究。     

鸡IL-1β、IL-2、IFN-γ和MGF对表达新城疫病毒HN基因的重组鸡痘病毒免疫效力的影响

将10日龄的SPF鸡和15、28日龄的商品鸡分别随机分组,同时免疫不同剂量的rFPV-HN（表达NDV HN基因重组鸡痘病毒）和表达不同细胞因子（IL-1β、IL-2、IFN-γ、MGF）的重组鸡痘病毒（rFPVs）。在免疫后不同时间,通过检测血液中抗NDV的HN蛋白抗体、脾脏中CD4＋和CD8＋T细胞的变化及攻毒保护率等指标。结果表明：IL-1β或IFN-γ在免疫后期能促进抗HN间接ELISA抗体的滴度上升,而且产生抗体的整齐度好;IL-1β或IL-2可以显著增加脾脏中CD4＋和CD8＋T细胞含量;IL-1β、IL-2或IFN-γ同样可以提高商品鸡攻毒后的存活率。IL-2和IFN-γ在增加脾脏中CD4＋和CD8＋T细胞的数量及攻毒保护方面表现出一定的协同增强作用。     

蛋白激酶CK2抑制剂对鸡朊蛋白高表达和抑制表达DF-1细胞生物学行为的影响

为探讨CK2在鸡细胞型朊蛋白(ChPrP~C)高表达和抑制表达的DF-1细胞增殖、黏附、侵袭和凋亡过程中的作用及其与ChPrP~C表达量的关系,以DF-1-PrP和DF-1-SiRNA-3细胞为模型,DF-1细胞为对照,分别用0、25、50、100nmol·L~(-1)米托蒽醌处理以抑制CK2,检测细胞对鼠尾胶原的黏附能力,Transwell小室法检测细胞侵袭力,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,RT-PCR法检测PRNP基因mRNA转录。结果显示,DF-1-PrP、DF-1-SiRNA-3和DF-1细胞的PRNP基因mRNA转录量随着米托蒽醌浓度的增加均减少,其增殖、黏附、侵袭能力相应下降,而总凋亡率均升高;但在同一米托蒽醌浓度下,DF-1-PrP细胞增殖、黏附、侵袭能力始终高于DF-1细胞,总凋亡率均低于DF-1细胞;DF-1-SiRNA-3细胞则相反。表明ChPrP~C的高表达可促进DF-1细胞增殖、黏附和侵袭,抑制其凋亡,而ChPrP~C的低表达则相反;CK2在ChPrP~C介导DF-1细胞增殖、黏附、侵袭和凋亡过程中具有重要的作用。本研究结果为进一步阐明ChPrP~C生理功能的分子机制奠定基础。     

鸡IL-2基因的克隆及GST-chIL2融合蛋白的表达

根据Sundick等发表的鸡IL-2基因(chIL2)序列设计合成特异性引物,用RT-PCR从ConA诱导的鸡脾淋巴细胞扩增出450 bp的目的片段,酶切鉴定及序列测定结果表明为鸡IL-2基因。该基因包括鸡IL-2基因的全部开放阅读框,编码142个氨基酸组成的蛋白质,与GenBank鸡IL-2基因相比,在编码氨基酸的49位有一个氨基酸缺失;而与Broiler、SC、Chenren和Xiaoshan鸡在编码氨基酸上完全一致,具有较近的亲缘关系;与Kestrel来航鸡、来航SPF鸡、Obese、Silky和Xianju鸡等有1-4个氨基酸的差异;与火鸡和鹌鹑的氨基酸同源性分别为69.9%和59.4%。将克隆到的基因插入到融合蛋白原核表达载体pGEX-6p-1中,得到重组表达质粒pGEX-IL2。将此重组质粒转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导,表达出了大小约为40 ku的GST-chIL2融合蛋白,其中GST部分为26 ku,鸡IL-2为14 ku,与预期的鸡IL-2成熟蛋白大小一致。     

不同蛋白源供应形式对蛋鸡小肠肽载体PepT1表达的影响

为研究不同蛋白源形式对蛋鸡肠道肽载体PepT1表达的影响,选取遗传背景相同的成年蛋鸡30只,随机分为3组,每组10只,分别应用游离氨基酸、小肽、酪蛋白为氮源,根据总能和总氮相同的原则,配制不同蛋白形态的纯合日粮,饲喂2周,应用RT-PCR技术检测小肠内肽转运载体表达量变化.结果表明:以小肽为氮源的试验组蛋鸡小肠不同肠段转运载体表达量较游离氨基酸和酪蛋白组明显提高(P＜0.05),而游离氨基酸组和酪蛋白组间差异不显著(P＞0.05).     

不同铜源和水平对肥育绵羊生产性能、铜状态和抗氧化能力的影响

为研究不同铜源和水平对肥育绵羊生产性能、铜状态和抗氧化能力的影响,本试验选用50只体重相近(23.8±1.6)kg、3月龄左右的杜泊×蒙古羊杂交一代羯羊,随机均分为5组,对照组饲喂基础日粮(不加铜)、试验组分别在基础日粮中添加10、20mgCu/kgDM赖氨酸铜和10、20mgCu/kgDM碱式氯化铜。结果表明:2种铜源和水平对肥育绵羊生产性能无显著影响(P>0.05)。补加铜显著增加了绵羊血浆铜浓度(P<0.05),极显著增加肝脏铜浓度和血浆Cp活性(P<0.01)。补加铜显著降低了血浆和肝脏中MDA浓度(P<0.05),提高了血浆SOD活性(P<0.05)。赖氨酸铜和碱式氯化铜对绵羊铜状态和抗氧化能力的影响相同,10、20mgCu/kgDM2种铜水平对绵羊抗氧化能力的影响也相同,但随着铜添加水平的增加绵羊体内铜状态提高。     

鸡Slit2和Robo1基因mRNA组织表达特性分析

SLIT/ROBO信号通路在鸡的卵泡发育过程中发挥着重要作用,Slit2和Robo1基因是影响鸡产蛋性能的关键候选基因.本试验以大骨鸡和海兰白蛋鸡为供试素材,利用半定量RT-PCR方法对Slit2和Robo1基因在鸡不同组织中mRNA表达水平进行测定分析.结果显示,Slit2和Robo1基因mRNA在卵巢和输卵管等8种组织中均呈较广泛的分布(除在海兰白胸肌、腿肌中未检测到扩增条带外);Robo1基因mRNA相对表达量除在脾脏和肺脏组织中的表达水平相对较低(P＜0.01)外,在肝脏、卵巢和输卵管3种组织中的mRNA表达量均维持于较高水平(P＜0.01).虽然在被检各组织中的Slit2基因mRNA相对表达量存在一定的差异(P＜0.05),但在卵巢等其它7种组织中的表达水平均较高(除在海兰白肝脏组织中的表达较低外).在被检8种组织中Robo1和Slit2基因mRNA相对表达量在每一品种各分别呈现出基本一致的变化趋势.     

不同铜源与铜浓度猪粪对玉米生长和铜沉积的影响

采用土壤盆栽玉米,试验猪粪是猪饲喂基础日粮添加250mg/kg铜分别来自硫酸铜(CuSO4)、氨基酸铜(Cu-AA)和碱式氯化铜(TBCC)排出的粪,对照猪粪取于猪饲喂基础日粮的粪。添加铜源猪粪分别设100g/盆、200g/盆、300g/盆3个铜浓度。研究不同铜源与铜浓度猪粪对玉米移栽后生长及植株铜吸收累积的影响。结果表明:不同铜源猪粪对玉米生长及植株铜沉积无显著影响(P>0.05)。玉米移栽后40d,随粪中铜含量的增加显著增加土壤铜含量(P<0.05),玉米地下部和地上部分铜含量随土壤铜含量增加而增加(P<0.05),玉米地上部和地下部鲜物质量随试验猪粪中铜浓度的升高而下降(P<0.05)。高铜浓度猪粪施肥影响玉米生长。     

鸡贫血病毒vp2基因的表达、纯化及重组蛋白的鉴定

根据GenBank上已发表的鸡贫血病毒Cux-1株基因组序列设计并合成了1对特异性引物,通过PCR扩增出vp2基因,将扩增出的片段克隆到pGM-T载体上,通过测序分析证实该片段与鸡贫血病毒Cux-1株的vp2基因序列一致。将克隆的W2基因亚克隆到原核表达载体pET-32a（＋）上并转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,用IPTG诱导表达,表达的融合蛋白进行SDS-PAGE和Westernblot分析,并用镍柱在天然状态下进行了纯化。结果表明,表达的融合蛋白分子量约为45ku,能与鸡贫血病毒阳性血清发生反应。     

不同蛋白源对鹌鹑生长的不同影响

鹌鹑生长对饲料蛋白质的要求量,已有报告说应为16～32%。现有美国研究人员认为要求量与其氨基酸组成有关,并进行了实地探讨。实验用蛋清蛋白和酪蛋白(添加蛋氨酸)分别配制成单一蛋白质鹌鹁饲料。蛋清蛋白饲料(简称“蛋饲料”)的粗蛋白质(CP)含量为5～35%,每相差5%为一种水平(共7种);酪蛋白饲料(“酪饲料”)分别为10、20、30%三种水平(共3种饲料)。十种饲料的代谢能都相等,供本实验用的是育成期的鹌鹑。实验结果是:低 CP 水平时,“酪饲料”对鹌鹑体重、氮的摄入量比“蛋饲料”差。“酪饲料”的 CP 水平越高鹌鹁的生长速度越快;     

不同鸡种TLR1和TLR2基因SNP检测分析

本研究利用DNA直接测序技术对9个地方鸡种(北京油鸡、白耳鸡、溧阳鸡、河南斗鸡、泰和乌骨鸡、大骨鸡、狼山鸡、仙居鸡、茶花鸡)和1个引进品种(白来航蛋鸡)鸡Toll样受体1(chTLR1-1、chTLR1-2)、Toll样受体2(chTLR2-1、chTLR2-2)基因的全部外显子、部分内含子及5′调控区的序列进行单核苷酸多态性(SNPs)检测。结果共发现了27个SNP位点,96%的SNPs位于编码区,其中33%的SNPs为错义突变。chTLR2-1基因在所有品种中均未发现SNP位点,chTLR1-1、chTLR1-2和chTLR2-2基因在9个地方品种中突变位点较为丰富,且不同品种间SNP数量差别较大,但在白来航蛋鸡中均未发现SNPs位点。本试验为进一步开展地方鸡种chTLR1和chTLR2基因多态性与抗病研究提供了理论依据。     

不同铜源和水平对生长猪组织铜含量和含铜酶的影响

选用54头体重约17 kg杜长大生长猪进行试验,研究日粮中添加不同铜源、不同水平铜对猪血液生化指标及组织铜沉积的影响。试验猪随机分为9个处理,每个处理3个重复,每个重复2头。各处理日粮分别为基础日粮添加以氨基酸铜（Cu-AA）、硫酸铜(CuSO4)和碱式氯化铜(TBCC)为铜源的铜10、150和250 mg/kg的日粮。研究结果表明：添加不同铜源、不同剂量铜,猪日增重和料重比均无显著差异(P＞0.05);肝、肾铜含量随铜添加水平的升高而显著升高(P＜0.01),在心肌铜含量方面,添加250 mg/kg铜水平显著高于添加10和150 mg/kg铜水平(P＜0.01); 高剂量铜可显著提高血清铜兰蛋白活性(P＜0.01),添加150 mg/kg铜可显著提高血清超氧化物歧化酶（SOD）活性(P＜0.05);硫酸铜源可显著降低肌肉铜含量(P＜0.01),氨基酸铜源可显著提高血清铜兰蛋白活性(P＜0.01)。     

小型猪复合麻醉剂对大鼠不同脑区LKB1基因mRNA转录和p-LKB1蛋白表达的影响

旨在研究小型猪复合麻醉剂(XFM)对大鼠不同脑区LKB1基因mRNA转录和p-LKB1蛋白表达的影响。将30只SD大鼠随机分成XFM组(M组)和生理盐水对照组(C组),M组又按照时间点的不同分为4个亚组。各组大鼠到达试验设计时间点后分别采取脑组织并分离各脑区,采用PCR和Western blot技术,分别检测各试验组中大鼠不同脑区LKB1基因mRNA的相对表达量和p-LKB1蛋白表达量。结果显示:在试验的麻醉早期阶段(即M1和M2),各脑区LKB1基因mRNA转录与对照组相比均未出现显著变化(P0.05);大脑皮层、海马及小脑p-LKB1蛋白表达与对照组比较并无显著变化(P0.05),而丘脑与脑干p-LKB1蛋白表达与对照组比较则明显升高,且丘脑差异显著(P0.05),脑干差异极显著(P0.01)。而在麻醉后期阶段(即M3和M4)各脑区LKB1基因mRNA转录表达明显上升,尤以M4突出,差异极显著(P0.01),其中丘脑和脑干变化最为明显;大脑皮层、海马及小脑p-LKB1蛋白表达与对照组比较均无明显变化(P0.05),但丘脑和脑干p-LKB1蛋白表达呈现显著升高(P0.05)。研究表明,XFM麻醉作用可能影响大鼠中枢神经系统中LKB1基因mRNA的转录和p-LKB1蛋白的表达。     

过表达FOXL2基因对鸡胚性腺分化的影响

试验旨在研究FOXL2基因对鸡胚性腺分化的影响。本试验分为试验1组、试验2组和空白对照组（鸡胚数量分别为260、100、20枚）,试验组通过胚盘下腔注射的方法分别将pLV-FOXL2慢病毒重组质粒、pLV空质粒注入胚胎期第2天的鸡胚,空白对照组不做处理并与试验组一起孵化至出雏,利用CHD1基因遗传性别鉴定的方法对出雏的雏鸡进行性别检测,分析其性腺解剖学、组织学结构变化,并利用免疫组化的方法检测性腺FOXL2和CYP19A1蛋白表达量。结果显示,试验1组遗传性别为公的23只,遗传性别为母的18只,表型性别为公的21只,表型性别为母的18只,其中有2只表型性别不典型,左侧性腺发生变化,朝卵巢结构转变;试验2组遗传性别为公的9只,遗传性别为母的12只,表型性别与遗传性别一致。阳性PCR检测结果显示,试验1组获得阳性个体10个,阳性率为24.4%（10/41）;试验2组获得阳性个体8个,阳性率为38.1%（8/21）。性腺解剖学结果显示,阳性pLV-FOXL2雄性鸡胚左侧性腺体积明显大于右侧性腺,表现膨松状态;组织切片结果显示,雄性鸡胚性腺具有典型的卵巢皮质层和髓质层结构;阳性pLV-FOXL2雌性鸡胚性腺的发育无明显变化。免疫组化结果显示,FOXL2和CYP19A1蛋白在试验1组左右侧睾丸中的表达量与空白对照组母鸡卵巢中的表达量相似,显著高于试验2组（P<0.05）。以上结果表明,FOXL2基因可能促进鸡雄性性腺的性反转,在鸡性腺分化和发育过程中发挥着重要的作用。