H9N2亚型禽流感病毒核蛋白基因的克隆及其序列特征

用RT—PCR技术扩增到H9N2亚型禽流感病毒分离株A／Chicken／Shanghai／F／98(简称F株)的核蛋白(NP)全基因。18个毒株NP基因核苷酸序列比较结果显示，以Q／HK／G1／97为代表的、并和同期香港发生的人流感事件有直接联系的毒株相互间同源率达98．3％一99．3％，而F株与它们的同源率为92．2％一92．8％。遗传进化分析结果表明，F株独成一组，可暂时划分到类C／Ko／323／96亚系。从目前已发表的H9N2毒株NP基因数据不能确定F株的来源。     

H9N2亚型禽流感病毒M基因的克隆与序列分析

对分离自中国南方的H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Guangxi/KMⅢ/99(H9N2)的M基因进行克隆和序列分析。序列分析表明,该M基因全长1 027 bp,包含2个读码框,可分别翻译出M1和M22种蛋白质。M1由252个氨基酸残基组成,M2由97个氨基酸残基组成。与不同毒株比较,结果显示,该M基因与A/Chicken/Guangxi/10/99(H9N2)同源性为100%,当A/Chicken/Guangxi/9/99(H9N2)同源性为99%,与A/Chicken/Guangdong/5/97(H9N2),A/Chicken/Guangdong/11/97(H9N2)等中国分离株同源性达98%。     

鹅源H9N2亚型禽流感病毒PB2和PB1基因序列分析

采用RT-PCR方法对1株鹅源H9N2亚型禽流感病毒(GS/GX/01/07)RNA聚合酶基因PB2和PB1分别进行了扩增,将其克隆到pMD18-T载体后进行序列测定与分析.结果表明,该株病毒的PB2、PB1开放阅读框(ORF)分别由2 280和2 277个碱基组成,分别编码759和758个氨基酸.经同源性和系统进化树...     

10株H9N2亚型禽流感病毒HA和NA基因的序列分析

为了从分子水平上掌握我国H9亚型禽流感的变异情况和流行规律,本研究汇集近年来从我国部分省市养殖场分离的10株禽流感H9N2亚型毒株,采用RT-PCR技术对其HA和NA基因进行扩增、克隆和测序,并对所得全序列进行同源性和遗传进化分析。结果显示,本试验分离到的10株病毒的HA和NA基因变异程度不大,变异概率大;在遗传进化树中均属于欧亚分支中的类CBJ194亚分支,与CBJ194的HA基因核苷酸同源性在88.8%~95.8%,NA基因核苷酸同源性在93.4%~97.6%,可能与CBJ194由同一毒株进化而来。由于基因突变使ACHB101毒株的HA基因出现了新的糖基化位点,ACHN102毒株的保守受体结合位点发生变异。NA基因推导氨基酸序列中第63、64、65位有T、EI、3个氨基酸的缺失,导致61位糖基化位点的丢失。唾液酸吸附位点上有明显的突变。HA和NA基因的变异可能与频繁的疫苗免疫选择压力有关。     

10株H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因的序列分析

为了解中国目前H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)血凝素(HA)基因的遗传变异情况,对中国不同地区分离的10株H9N2亚型AIV的HA基因进行扩增、克隆和测序,并对所获得的HA全序列进行同源性和遗传进化分析。结果表明,10个分离株的裂解位点均为RSSR↓GLF,符合低致病性AIV的分子特征;10个分离株有7~9个潜在糖基化位点,由于基因突变有些HA基因出现了新的糖基化位点;与参考株相比,发现了4个抗原表位的突变,这些表位的突变可能引起病毒致病性的改变;受体结合位点除198位有变异外,其他位点均较保守;6株病毒234位氨基酸均为L,具有与哺乳动物唾液酸α,2-6受体结合的特征;10个分离株HA基因与国内疫苗株的核苷酸及氨基酸序列同源性分别为90.4%~99.2%和92.2%~98.7%;10个分离株同属于欧亚谱系中的A/duck/Hong Kong/Y280/97群,但差异显著,为此本试验又将其分为4个不同的亚群。人工感染排毒试验结果表明,BJ15和NJ17分离株在鸡体内具有较强的复制能力,排毒周期较长且排毒量也较大,而S145N的漂变导致在145-147位氨基酸多出1个糖基化位点NGT,可能是分离株复制能力增强的原因。     

H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因序列的初步分析

禽流行性感冒 ,简称禽流感 (ＡｖｉａｎＩｎｆｌｕｅｎｚａ ,ＡＩ)是由正黏病毒科、流感病毒属、Ａ型流感病毒所引起的禽类的感染和/或疾病综合症 ,被国际兽疫局确定为Ｉ类烈性传染病 ,并被列入国际生物武器公约动物传染病名单。ＯＩＥ根据对家禽所造成的疾病程度 ,将禽流感划分为高致病禽流感ＨＰＡＩ和低致病禽流感ＬＰＡＩ。Ｈ9Ｎ2亚型禽流感病毒 ,属低致病力禽流感病毒。 1994～ 1999年期间 ,该亚型病毒在全球呈广泛流行趋势 ,且危害日趋严重。中国在 1994年 ,由陈伯伦等[1] 人报道 ,在广东某鸡场的蛋鸡中分离到我国第 1株Ｈ9Ｎ2亚型禽…     

禽流感病毒KMI/99(H9N2)HA和NA基因的序列分析

研究分别以自行设计的一对简并引物和另一对普通引物，经RT－CR，一次性成功地扩增禽流感病毒A／Chicken/Guangxi/KMI/99(H9N2）HA全和基因cDNA和NA全长基因cDNA，并将它们克隆于pGEM-T Easy的T－T窗口，首次报道了该毒株的HA全基因和NA全基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列，测序结果显示，该毒株的HA基因全长为1683bp，编码560个氨基酸。NA全长为1398bp，编码466个氨基酸残基。研究发现其HAI羧基端的分子特征是：R－S－S－R。从分子水平推论。A/Chicken/Guangxi/KMI/99(H9N2)属于非高致病力毒株。研究还发现NA蛋白于63－65位缺失了T、E、I三个氨基酸。     

三株H9N2亚型禽流感病毒全基因组序列分析

采用RT-PCR对3株H9N2亚型禽流感病毒基因组进行扩增,测序后再利用DNAStar和MEGA 4对所得到的序列和部分具有代表性的参考序列进行遗传演化及分子特点分析,旨在从分子水平探讨华南地区H9N2亚型禽流感病毒的流行特点,为该病的综合防控提供依据。结果表明,3个分离株CK/GD/162/03、Francolin/GD/298/05与CK/GD/A8/10分别属于B34、B47和B54基因型;3个分离株HA基因未发生明显的变异,符合我国大陆H9N2亚型AIV HA基因的遗传进化特点,但内部基因出现不同程度重组且部分基因与人源高致病性H5N1亚型AIV同源性很高;CK/GD/162/03、Francolin/GD/298/05两株分离株具有宿主多样性。因此,对华南地区H9N2亚型AIV进行监控及分子流行病学调查具有重要意义。     

H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆与表达

根据已知H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因序列,设计、合成PCR引物。自H9N2亚型禽流感病毒感染的鸡胚尿囊液中提取总RNA,反转录后采用高可信度DNA聚合酶扩增血凝素基因,采用Invitrogen定向表达系统进行克隆表达,纯化获得N末端携带多聚组氨酸标签的重组血凝素,分子质量约75 ku。采用阳性血清经免疫印迹及ELISA分析重组血凝素的免疫反应性,结果表明,重组血凝素能与H9N2亚型病毒抗血清发生特异性结合,具有良好的免疫反应性。     

H9N2亚型禽流感病毒疫苗研究进展

H9N2亚型禽流感病毒在世界范围内广泛存在,给养禽业造成巨大的经济损失,并危害人类健康。流感病毒抗原易发生漂移和转换,使流感病毒的防控变得困难。疫苗接种是防控禽流感最有效的手段之一,全病毒灭活疫苗保护效果好,制备简单,是流感病毒常用的疫苗,但该疫苗局部副反应大,并伴随生物安全问题。随着分子生物学技术的发展,活载体疫苗、核酸疫苗、亚单位疫苗等新型疫苗的开发,给H9N2亚型禽流感病毒的防控提供了新的手段。新型疫苗除具有传统疫苗的保护效果外,在生物安全和普遍防控方面具有广泛的优势,是流感病毒疫苗发展的新方向。     

鸡源禽流感H9N2亚型河南分离株NS1基因克隆、序列分析及原核表达

根据H9N2亚型禽流感病毒（AIV）的NS1基因序列,设计1对特异性引物,采用RT-PCR方法扩增AIV的NS1基因序列,将其克隆到原核表达载体pET-32α（＋）中,构建重组表达质粒pET-32α（＋）-NS1,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导得到NS1融合蛋白;其相对分子质量约28 000,分析显示NS1基因的原核表达载体成功构建,表达蛋白以包涵体形式存在,包涵体经过变性和复性后均可获得单一、高表达量的目的蛋白,为进一步开展关于NS1蛋白的功能,为建立鉴别禽流感疫苗免疫和野毒感染ELISA诊断试剂盒奠定基础。     

一株鸡源H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定

从福州市某活禽市场采集的鸡泄殖腔棉拭子样品中分离出1株病毒,经血凝抑制试验(HI)和聚合酶链反应(PCR)方法鉴定为H9N2亚型禽流感病毒。在GenBank基因库中对该病毒株的3个基因片段的测序结果进行BLAST比对分析表明,3个基因片段均属于H9N2亚型禽流感病毒的基因。HA基因遗传进化分析表明,该病毒分离株与代表株DK/HK/Y280/97处于同一分支,与上海的鸡源分离株A/chicken/Shanghai/06/2015(H9N2)同源性最高,同源性为99.5%。     

H9N2亚型禽流感病毒NA和M2基因的克隆与表达

旨在分别构建NA蛋白和M2蛋白的重组质粒,并进行表达鉴定。采用PCR扩增了H9N2分离株A/chicken/Shandong/LY1/2017毒株的NA基因和M2基因。同源性分析证实,这2个基因序列与目前流行毒株的基因同源性很高。将NA基因克隆至pcold1原核表达载体,将M2基因克隆至pET28a原核表达载体,成功构建了pcold1-NA和pET28a-M2重组质粒,并成功表达出相应的融合蛋白。然后对表达的融合蛋白进行纯化,并采用免疫印迹验证其免疫反应性。本试验为进一步研究H9N2亚型禽流感病毒致病机制及检测技术奠定了基础。     

H9N2亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因的克隆及表达

根据已知H9N2亚型禽流感病毒神经氨酸酶(NA)基因序列设计,合成克隆引物。自H9N2亚型病毒感染的鸡胚尿囊液中提取总RNA,反转录后采用高可信度DNA聚合酶(PyobestTMDNAPolymerase)扩增NA基因,采用Invitrogen定向表达系统(ChampionTMpETdirectionalTOPOexpressionsystem)进行克隆表达,纯化获得N末端携带多聚组氨酸标签的重组NA,分子量约54·7ku。经免疫印迹及ELISA分析重组NA的免疫反应性和免疫动物分析其免疫原性,结果表明:重组NA能与H9N2亚型病毒抗血清发生特异性结合,且其免疫动物后能诱导机体产生特异性抗体,具有良好的抗原性。     

免疫鸡群中分离的H9N2亚型禽流感病毒的分子特征研究

为研究浙江省禽流感病毒(AIV)的流行病学情况,本实验应用鸡胚传代方法从AIV疫苗免疫鸡群中表现典型呼吸症状的产蛋鸡体内分离1株H9N2亚型AIV A/Chicken/Jiande/01/2009(H9N2)。氨基酸序列分析显示,HA受体结合位点出现了人流感病毒结合位点226L,M基因出现S31N的突变。遗传进化分析显示,A/Chicken/Jiande/01/2009的M基因和PB2基因属于G1-Like谱系,HA基因、NA基因和NS基因属于Ck/BJ/1/94-Like分支,而NP基因、PA基因和PB1基因属于Ck/SH/F/98-Like谱系。这些资料表明,A/Chicken/Jiande/01/2009(H9N2)为一株重排病毒。     

不同H9N2亚型禽流感病毒株致病力的比较试验

参照NDV评价毒力的方法对1998—2008年间收集的25株H9N2AIV的致病性进行了比较研究。结果显示,25株H9N2AIV不同毒株间致病性有较大差异,大致分为3类：致病性偏强、致病性中等和致病性较弱。从中选出致病力有差异的8个毒株进行了1日龄雏鸡脑内接种指数（ICPI）、6周龄鸡静脉接种指数（IVPI）以及8周龄SPF鸡人工感染排毒试验,结果证明大部分毒株ICPI和IVPI基本上为0,排毒散毒的高峰期在攻毒后第5天到第6天。在25个毒株中,3#和12#表现出了比较高的致病性,不仅其EID50值最高（分别为10-8.8/0.2mL和10-8.8/0.2mL）、ELD50值最高（分别为10-7.9/0.2mL和10-8.7/0.2mL）,而且鸡胚平均死亡时间也最短（分别为66.5,69h）。3#、12#还出现了1日龄雏鸡脑内接种指数（分别为0.238,0.437）和6周鸡静脉内接种指数（分别为0.34,0.51）。在8周龄SPF鸡人工感染排毒试验中3#和12#毒株的排毒量大,排毒时间也明显长于其他毒株（第2～9天）。以上试验结果表明我国H9N2AIV不同毒株致病性有明显差异,呈多态性,致病性偏强的毒株造成鸡群较高的死亡率。     

猪流感病毒H9N2亚型济南株HA、NA基因的克隆与序列分析

根据GenBank中流感病毒H9N2亚型HA基因与NA基因序列,分别设计扩增HA基因与NA基因的特异性引物,用RT-PCR方法扩增猪流感病毒H9N2济南株(SW/SD/JT/07)HA基因和NA基因,分别将RT-PCR扩增产物克隆入pMD18-T载体,进行测序分析。结果表明,SW/SD/JT/07 HA基因长度为1701bp,编码566个氨基酸,HA0切割位点序列为R-S-S-R-G,属非高致病性毒株;HA蛋白有8个糖基化位点,与参考毒株糖基化位点数一致;HA蛋白有5个受体结合位点,其中在190位氨基酸与其余参考毒株存在差异。SW/SD/JT/07 NA基因长度为1413bp,编码470个氨基酸,NA蛋白基质结合部与参考毒株一致,高度保守;NA蛋白有5个抗原位点,在325位为D其余参考毒株均为N,SW/SD/JT/07与DC/HB/W1/04,CK/GS/2/99在398位为E,其余参考毒株为D或N;SW/SD/JT/07 NA蛋白与CK/SH/F/98,DC/HB/W1/04,CK/GS/2/99,SW/GD/WXL/04,SW/SD/W4/03,SW/YN/Simao2/07一样在茎区63,64,65位发生氨基酸缺失。SW/SD/JT/07 HA基因与参考毒株的同源性82.5%～98.6%,NA基因与参考毒株的同源性82.2%～99.1%。SW/SD/JT/07 HA基因与NA基因系统发生树分析表明,SW/SD/JT/07与AIV H9N2亚型亲缘关系密切。     

一株野鸟源H9N2亚型禽流感病毒的全基因组序列分析及致病性研究

为进一步了解2014年分离自我国南方野鸟粪便中的一株H9N2亚型禽流感病毒(AIV)Wide Bird/Hu N/SC1400/2014(H9N2)(WB/400/14)的生物学特性,本研究对其进行全基因组序列测定、进化分析及SPF鸡、SPF鸭和BALB/c小鼠的感染性试验。序列分析显示:该分离株的HA裂解位点基序为333PAASDR↓GL340,其中不存在多个连续的碱性氨基酸,符合低致病性禽流感病毒(LPAIV)氨基酸序列特征。该分离株不同基因片段来源较复杂,分别与H9、H6、H4、H1、H11、H10、H3等多种亚型的LPAIV同源性较高,呈现明显的多样性。感染性试验显示,WB/400/14不能够在SPF鸡和小鼠体内有效复制,但病毒感染SPF鸭后能够在部分脏器中检测到病毒的存在,并且感染鸭能通够过咽喉和泄殖腔同时向外排毒,而同居感染鸭仅通过泄殖腔向外排毒,表明分离株在SPF鸭群中具有良好的水平传播能力。本研究为AIV的监测和防控提供实验依据。     

一株H9N2亚型禽流感病毒全基因组分析

为了研究H9N2亚型AIV A/Chicken/Guangdong/333/2008的全基因组序列变异情况,试验利用RT-PCR方法扩增出该病毒的8个基因序列,并应用DNAStar和MEGA4.0软件分析所得基因序列。结果表明:该病毒HA基因的第226位氨基酸由Q(Gln)变为了L(Leu),其NP基因与Viet Nam/1203/2004(H5N1)的NP基因同源率最高。说明该病毒已具备了感染哺乳动物的分子特征,并可能在遗传演化过程中突变为高致病性的禽流感病毒(AIV)。     

H9亚型禽流感病毒钦州株HA基因的克隆与遗传进化

采集钦州活禽交易市场的鸡气管和泄殖腔的棉拭予样品,用H9亚型分型引物进行PCR初步筛选,阳性样品经SPF鸡胚尿囊腔接种分离病毒,通过RT-PCR方法扩增HA基因,并将其克隆到pMD—18T载体后进行序列测定和分析。结果表明,获得1株H9亚型禽流感病毒命名为：A／Chicken／Guangxi／qz40／2009（简称qz40）。测序结果表明qz40的HA基因片段全长1683bp,编码560个氨基酸;序列同源性比较结果表明,该毒株与参考毒株的核苷酸序列同源性为82．8％．99．9％,推导氨基酸同源性为87．5％．99．6％;HA基因的裂解位点氨基酸顺序为RSSRIGLF,为低致病性毒株;含有7个潜在的N-糖基化位点,其中5个位于HAl部分、2个位于HA2部分;基于H9亚型HA基因的进化树分析表明,qz40株属于欧亚种系的A／Chicken／Beijing／1／94（Ck／Bei—like）群系。