鸡传染性贫血病毒vp3基因在真核细胞中的表达与功能分析

为研究鸡传染性贫血病毒(CIAV)VP3蛋白在宿主细胞中的作用,本研究采用PCR技术从CIAV DNA中扩增出vp3基因,并将该基因克隆到p MD18-T simple vector中。经测序证实所克隆的vp3基因与CIAV CUX-1标准株相同。并将vp3基因亚克隆到真核表达载体p EGFP-N1中,构建了重组真核表达质粒p EGFP-vp3与p CMV-Myc vp3,转染BHK-21和293 T细胞,经RT-PCR、荧光显微镜以及Western Blot证实转染的真核细胞能够表达VP3蛋白。以台盼蓝染色法检测细胞死亡,结果表明,VP3蛋白具有较强诱导细胞死亡的作用。该结果为深入研究CIAV的致病机理奠定了基础。     

小型猪复合麻醉剂对大鼠中枢神经系统p-p38MAPK蛋白表达的影响

为研究小型猪复合麻醉剂(XFM)对大鼠中枢神经系统p-p38蛋白表达的影响,将30只大鼠分为对照组(C组)和麻醉剂组(M组),M组又分为4个亚组:M1组(注射XFM后大鼠翻正反射消失即刻)、M2组(注射XFM后大鼠翻正反射消失后1h)、M3组(注射XFM后大鼠翻正反射恢复即刻)和M4组(注射XFM后大鼠翻正反射恢复后1h),各组大鼠到达预定的时间点后分别采取脑组织,应用RT-PCR法检测脑内p38 mRNA转录量,应用Western blot方法检测中枢神经系统中p-p38蛋白的表达量。大鼠注射XFM后,与对照组比较,试验组大鼠大脑皮层和丘脑p38mRNA转录量显著降低(P0.05),在苏醒过程中有所恢复,但仍显著低于对照组(P0.05);大脑皮层和丘脑内p-p38蛋白的相对表达量,在M1、M2组的时间点显著低于对照组(P0.05或P0.01);大鼠注射XFM后,与对照组比较,试验组大鼠小脑、海马、脑干内p38mRNA转录量显著升高(P0.05),在苏醒过程中仍显著高于对照组(P0.05);小脑、海马、脑干内p-p38蛋白的表达量,在M1组、M2组、M3组显著升高,与对照组相比差异显著(P0.05或P0.01),在M4组表达量下降,与对照组相比差异不显著(P0.05)。结果表明,XFM诱导大鼠大脑皮层、丘脑内p38 mRNA及p-p38蛋白表达下调,p38 mRNA及磷酸化蛋白的改变可能是XFM作用的机制之一。     

鸡贫血病毒vp3突变体的构建

以本实验室克隆保存的含野生型鸡贫血病毒 ( CAV)全基因序列的 p UC18-CAV为模板 ,通过双向聚合酶链式反应 ( PCR)的方法在CAV的 DNA序列中制造定点突变并新增特定限制性酶切位点 ,得到载有 CAV突变体的p UC18-CAVm。突变体中致病基因 vp3的起始密码子 ATG(在 m RNA是 AUG)突变为 ACG而失去翻译起始位点的功能 ,虽然 vp3基因完全重叠于 vp2基因内部 ,但由于读码框的不同和密码子的简并性 ,突变位点的碱基变化并未引起VP2蛋白的氨基酸残基序列发生变化 ,从而保证了突变体和原始病毒抗原性的一致 ,为开发鸡贫血病毒的 DNA疫苗奠定了坚实的基础     

营养和空间因素对中蜂幼虫dynactin p62基因表达影响

为探究营养和空间因素对中蜂Apis cerana cerana幼虫dynactin p62基因的表达特性,本研究通过人工饲喂中蜂幼虫,采用荧光定量PCR检测了不同营养和空间发育条件下,中蜂6日龄幼虫dynactin p62基因表达量。结果表明:发育空间因素显著影响了中蜂6日龄幼虫dynactin p62基因表达量(P<0.05),而营养因素对中蜂6日龄幼虫dynactin p62基因表达量没有显著影响(P>0.05)。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒vp3基因的截短表达及鉴定

根据I型鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus type 1,DHV-1)A66株vp3基因序列,设计了一对扩增vp3截短基因(-468bp)的特异性引物,将vp3截短基因与表达载体pET-32a(+)连接,构建了vp3截短基因的重组表达质粒pET-VP468。pET-VP468转入表达菌E.Coli Rosetta-gami(DE3)pLysS中,使用IPTG诱导表达融合蛋白Trx-VP468。Trx-VP468经过Ni-NTA亲和层析柱和DEAE-Sepharose阴离子柱纯化,SDS-PAGE电泳结果表明,pET-VP468在大肠杆菌中表达了一个相对分子量约为36kDa的蛋白,免疫印迹试验表明Trx-VP468得到了正确表达。该结果为VP3蛋白的免疫学功能研究奠定了基础。     

口蹄疫病毒Akesu/O/58株结构蛋白基因的克隆和细胞受体结合位点初探

将Akesu/O/58口蹄疫病毒分离株牛舌皮毒适应乳鼠,通过RT-PCR法分别获得了该病毒结构蛋白基因vp1和p1.结果表明:vp1和p1基因分别为639 bp和2 208 bp,与Akesu/O/58细胞适应株FMDV的vp1和p1基因核苷酸序列的同源性分别为83.9%和84.7%,氨基酸序列的同源性为89.7%和95.1%.本试验分离株与OHK99、O1K、Taiwan97病毒株的细胞受体结合位点均为RGD(Arg-Gly-Asp),而Akesu/O/58细胞适应株的细胞受体结合位点为SGD(Ser-Gly-Asp).     

布鲁菌对不同分化类型巨噬细胞JAK-STAT6信号通路的影响

为研究布鲁菌侵染巨噬细胞过程中,对后者不同分化类型细胞中JAK-STAT6信号通路和细胞因子表达变化的影响,本研究利用小鼠巨噬细胞系RAW264.7,经40 ng/m L的IL-4体外作用24 h将其诱导为M2型巨噬细胞,采用细胞免疫荧光方法,检测M2巨噬细胞极化状态;通过荧光定量PCR(q RT-PCR)方法,检测布鲁菌疫苗株M5侵染不同类型(M0和M2型)巨噬细胞中JAK1、STAT6基因mRNA转录情况;采用ELISA方法检测M5侵染不同类型巨噬细胞上清中IL-10、INF-γ的表达情况。细胞免疫荧光检测结果显示,IL-4诱导24 h后,巨噬细胞表面标志CD206荧光表达量超过90%,表明巨噬细胞极化为M2型;q RT-PCR结果显示,M5侵染M0型巨噬细胞后能够引起JAK1、STAT6 mRNA转录水平持续降低,在24 h和48 h时其转录水平最低,二者差异极显著(p0.01);而M5侵染M2型巨噬细胞后,与未极化组(M0型)相比,JAK1、STAT6的mRNA转录水平增高,同时存在时间差异性,侵染8 h时,二者mRNA转录水平最高,差异极显著(p0.01)。ELISA结果显示,M5侵染巨噬细胞后,极化组(M2型)与未极化组(M0型)巨噬细胞相比,INF-γ的表达量差异不显著(p0.05),而IL-10的表达量上调且在侵染48 h达到最大值,差异显著(p0.05)。上述结果表明,在IL-4的诱导下巨噬细胞可以从未极化的M0型极化为M2型;布鲁菌M5侵染M0型巨噬细胞中JAK1、STAT6的转录水平下调,但上调M2型巨噬细胞JAK1、STAT6的转录水平并促进下游细胞因子IL-10的分泌。本研究为探究布鲁菌引起持续感染的机制研究奠定了基础,同时为布鲁菌病药物靶标开拓了新的研究方向。     

鸡传染性贫血病毒衣壳蛋白的原核表达及免疫原性分析

将从组织病料中提取的鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus,CIAV)核酸进行PCR扩增,获得vp1基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)中,构建了CIAV vp1基因重组质粒,命名为pET32a-vp1。将 pET32a-vp1转化E.coli plys,重组菌经IPTG诱导,SDS-PAGE分析结果表明,vp1基因在大肠杆菌中成功表达。纯化的蛋白质作为包被抗原,ELISA鉴定结果表明具有良好的抗原性。本试验结果为进一步研究用重组抗原制备CIAV ELISA诊断试剂盒奠定了基础。     

Hardy空间的原子分解及其上算子的有界性

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miR-144-5p靶向WNT5a对山羊卵巢颗粒细胞增殖、凋亡的影响

旨在探究miR-144-5p靶向WNT5a对山羊颗粒细胞增殖和凋亡的影响。本研究选用2岁健康雷州母山羊的卵巢颗粒细胞来过表达和抑制表达miR-144-5p及WNT5a,通过荧光定量PCR(real-time qPCR, RT-qPCR)、Western blot、双荧光素酶报告基因、CCK-8等技术来探究miR-144-5p与WNT5a对颗粒细胞增殖和凋亡的影响。结果表明，miR-144-5p在大卵泡颗粒细胞中的表达量极显著高于小卵泡颗粒细胞(P<0.01),WNT5a在大卵泡颗粒细胞中的表达量极显著低于小卵泡颗粒细胞(P<0.01);CCK-8检测发现，miR-144-5p抑制了GCs增殖，过表达miR-144-5p后，抑凋亡基因BCL-2的mRNA和蛋白表达极显著下调(P<0.01),促凋亡基因BAX的mRNA和蛋白表达极显著上调(P<0.01);Wnt/β-Catenin通路CTNNB1 mRNA和β-Catenin蛋白水平极显著降低(P<0.01);另外，miR-144-5p能靶向WNT5a抑制其表达。同时，CCK-8检测结果表明，WNT5a可促进...     

布鲁氏菌M28强毒株O抗原聚合酶基因缺失株的构建及其毒力评价

为构建布鲁氏菌O抗原聚合酶缺失突变株,本研究以布鲁氏菌M28株为亲本株,利用同源重组方法,以编码O抗原聚合酶靶基因M28_ B0107基因ORF外侧序列作为同源臂构建重组质粒pSP-B0107-K,将其电转化至M28感受态细胞中,以卡那霉素抗性基因(Kanr)作为标记,筛选缺失突变株(M28-△B0107).M28-△B0107经过20余代传代培养,Kanr表达稳定.将M28-△B0107与M28以106 cfu剂量腹腔接种小鼠,进行体内致病性试验.结果显示,M28-△B0107感染组小鼠脾脏荷菌量显著低于亲本M28株感染组,感染6周时,前者低于后者近10倍(p＜0.05);而且M28-△B0107感染组脾脏重量也显著低于M28强毒株组(p＜0.05);小鼠腹腔巨噬细胞系(RAW264.7)感染能力试验结果表明,突变株与亲本株无明显差异(p＞0.05).     

家蚕黑色蚕突变体p~B中apontic-like基因的结构与表达分析

黑缟蚕(striped,p~S)突变体是由p基因座上的一个等位基因控制的色素沉积突变体,经图位克隆发现是由apontic-like(apt-like)基因控制的。控制黑色蚕突变体(black,p~B)的主效基因和控制p~S的主效基因是等位基因,为了验证黑色蚕突变体p~B是否也是apt-like基因突变引起的,以黑色蚕突变体(p/p~B)和野生型素蚕(p/p)为试验材料,对apt-like基因在p~B和p中的结构和表达进行了分析,结果表明,apt-like基因编码序列在p~B(p/p~B)和p(p/p)中没有差异,在基因组上克隆验证亦无差异。实时定量PCR表达量检测结果表明,apt-like基因在检测过的5龄第3天幼虫头部、表皮、中肠、血淋巴、卵巢、精巢、马氏管、气管、丝腺和脂肪体中均有表达,其中在头部、表皮和中肠的表达量较高;且除血淋巴外,在其他9个组织中在p中的表达量显著高于在p~B中的表达量,表明apt-like基因对p~B突变性状的形成起重要作用。该研究结果将为进一步研究apt-like基因功能及其在p~B突变体中所起的作用提供理论依据。     

川桑(M notabilis C.k.Schn)的细胞学研究

本研究以川桑(M.notabilis C.k.Schn,)茎尖为材料,用去壁低渗法,进行体细胞染色体数鉴定。发现该桑:1、体细胞染色体为14。2、花粉经悬滴培养后,全不发芽。3、花粉粒直径为15u,大大小于二倍体桑花粉粒(22.5u)和多倍体桑花粉粒(27.5～30.0u)。     

体尺细分法在竞赛用伊犁马选择上的应用研究

本文采用体尺细分法 ,测定了乌鲁木齐马术俱乐部 2 4匹伊犁马 1 9个细分体尺及 1 0 0 0m速度成绩。分析细分体尺与速度的相关性 ,结果为 :颈长、肩长、肱骨长、股骨长、胫骨长、肩倾角、股骨倾角、髋骨倾角与速度呈显著 (P <0 0 5)或极显著 (P <0 0 1 )相关     

p38丝裂原活化蛋白激酶信号途径调节骨骼肌生长发育的机理

p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号途径是成肌细胞分化过程中重要的调节途径。p38 M APK蛋白在成肌细胞分化过程中受上游丝裂原活化蛋白激酶激酶3(M KK3)、丝裂原活化蛋白激酶激酶6(MKK6)的激活而活化其下游成肌分化蛋白(MyoD)、肌生成素5(Myf5)、肌形成蛋白(myogenin)、肌肉调节因子4(MRF4)等肌肉调节因子。p38 MAPK信号途径的活化可以进一步增加骨骼肌纤维细胞蛋白含量,增加肌纤维长度和横截面直径,使骨骼肌纤维在数量不变的前提下质量大幅度提高,本文就p38 MAPK信号途径调节骨骼肌生长发育的机理进行综述。     

布鲁氏菌DnaK基因缺失株的构建及其功能初步评价

为获得毒力较弱并能够区分自然感染和疫苗免疫的布鲁氏菌候选疫苗株,本研究采用PCR方法扩增布鲁氏菌疫苗株DnaK基因上下游同源臂序列及卡那基因序列,并利用融合PCR将以上基因序列融合,构建p DM18-T-ΔDnaK-Kana打靶载体。电转化至布鲁氏菌M5-90感受态细胞,筛选该菌疫苗株M5-90的DnaK基因缺失株,并对获得的M5-90ΔDnaK遗传稳定性、生长曲线、毒力和细胞免疫指标进行检测。结果表明,M5-90ΔDnaK与M5-90体外生长曲线相似, M5-90ΔDnaK在胞内的存活能力显著低于M5-90 (p0.05), M5-90和M5-90ΔDnaK诱导小鼠血清IFN-γ水平相似(p0.05),并且均显著高于PBS组(p0.01)。结果表明,M5-90ΔDnaK有望成为毒力低且可诱导机体细胞免疫的疫苗候选株。本研究为布鲁氏菌致病机制的研究和疫苗的研发提供科学依据。     

siRNA干扰TGF-β1基因对LPS诱导小鼠乳腺上皮细胞IL-6和TNF-α分泌的影响

为研究转化生长因子β1(TGF-β1)对脂多糖(LPS)刺激小鼠乳腺上皮细胞(MECs)分泌炎症因子的影响,本实验利用si RNA转染技术干扰MECs TGF-β1基因,采用荧光定量RT-PCR方法筛选最佳转染条件,并检测其干扰后LPS介导其下游信号smad3 m RNA的表达量,采用ELISA法检测其下游信号smad3蛋白含量和LPS介导细胞分泌前炎症细胞因子TNF-α和IL-6的含量。结果显示,选用50 n M浓度的TGF-β1-mus-1212片段转染组能够极显著抑制TGF-β1的m RNA表达(p0.01);TGF-β1被干扰后,LPS刺激其下游smad3 m RNA的表达量与对照组相比呈显著性降低(p0.05),smad3蛋白含量与对照组相比均极显著性降低(p0.01);细胞分泌TNF-α的量与对照组相比显著降低(p0.05),分泌IL-6的量各组无变化(p0.05)。本实验结果表明干扰TGF-β1能降低LPS诱导乳腺上皮细胞TNF-α的分泌量,因此TGF-β1可作为靶基因深入研究乳腺上皮细胞的免疫功能,本研究为乳腺炎症、肿瘤等乳腺相关疾病的治疗提供新的思路及实验数据,为新药的开发和应用提供理论依据。     

高职专业细分细化与课程体系调整研究与实践——以长沙航空职业技术学院飞行器维修专业为例

高职院校为培养满足职业岗位需求的人才,对专业进行细分细化很有必要并且切实可行,本文以长沙航空职业技术学院飞机维修专业为例,对高职专业细分细化的必要性和可行性进行了探讨,同时对专业细分细化后课程体系的构建进行了分析。     

猪胰高血糖素样肽-2通过细胞外信号调节激酶1/2调节仔猪空肠上皮细胞紧密连接蛋白表达

本试验以体外培养的仔猪空肠上皮细胞(IPEC-J2)为研究对象,研究了猪胰高血糖素样肽-2(p GLP-2)对紧密连接蛋白表达的调节及其信号传导机制。培养液中分别添加10-9mol/L p GLP-2(p GLP-2组)和10-9mol/L p GLP-2、10μmol/L U0126(p GLP-2+U0126组),对照组不添加以上试剂,每组3个重复,每个重复1个培养孔。测定IPEC-J2胞质紧密黏连蛋白-1(ZO-1)、occludin、claudin-1以及细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)蛋白表达量。结果表明:与对照组相比,IPEC-J2细胞培养液中添加p GLP-2显著增加了ZO-1、occludin、claudin-1以及p42-ERK1/2、p44-ERK1/2的蛋白表达量(P0.05);与p GLP-2组相比,在IPEC-J2细胞培养液中加入ERK1/2的抑制剂U0126,显著降低了ZO-1、occludin、claudin-1以及p42-ERK1/2、p44-ERK1/2的蛋白表达量(P0.05)。综合得出,ERK1/2通路是p GLP-2调控肠道上皮细胞紧密连接蛋白表达的一条重要信号通路。     

应用单抗间接ELISA检测兔出血症病毒的研究

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