蜜蜂白垩病病原观察及其综合防治措施

从患白垩病的蜜蜂幼虫尸体分离出了病原菌－蜜蜂球囊菌，经马铃薯酵母汁培养基培养，观察到蜜蜂球囊菌的生长过程其形态，并对蜜蜂白垩病提出了综合防治的措施。     

蜜蜂患白垩病虫体内一株球囊菌拮抗细菌的分离与鉴定

【目的】寻找抑制蜜蜂球囊菌的拮抗菌,用于白垩病的生物防治。【方法】利用细菌纯化技术从患白垩病的蜜蜂幼虫体内分离纯化了一株对蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)有抑制作用的细菌,并结合形态学、革兰氏染色以及16S rDNA序列分析技术进行鉴定,同时通过蜜蜂体内、体外接种试验研究其对蜜蜂球囊菌的抑制作用。【结果】该细菌被初步鉴定为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus),它在培养基中能够完全抑制蜜蜂球囊菌的生长,但其发酵液对蜜蜂球囊菌的生长没有影响。将含菌饲料喂蜜蜂幼虫,蜜蜂幼虫的死亡率和生长发育没有受到影响,说明该细菌对蜜蜂幼虫没有致病性。蜜蜂幼虫体内同时接种细菌和球囊菌孢子,发现细菌对球囊菌在蜜蜂体内的萌发和初期菌丝的生长没有影响,蜜蜂依然能够患病,但生长后期该细菌能够降解球囊菌菌丝,对球囊菌子代孢子的产生表现出一定的抑制作用。【结论】 该研究结果为蜜蜂白垩病的生物防治提供了理论依据。     

浅谈蜜蜂白垩病、蜂蝇病的发生及防治方法

一、白垩病是蜜蜂幼虫的一种顽固性传染病。该病在我国台湾省发现较早,在我国南方省份80年代末期也开始流行此病。近些年来传播蔓延较快,给养蜂生产造成很大危害。1.病原致病菌为子囊球菌,菌丝雌雄异株,两者结合进行有性生殖,形成膨大的子囊球,其内充满着孢子囊,里面具有大量的子囊孢子。孢子具有很强的生命力,在干燥状态下可存活15年之久。     

蜜蜂球囊菌几种胞外蛋白酶的特性

 【目的】研究由蜜蜂球囊菌引起的真菌性疾病白垩病的侵染机制,以及蜜蜂球囊菌胞外蛋白酶的种类及其特性。【方法】利用人工合成的培养基,在体外诱导蜜蜂球囊菌分泌胞外蛋白酶,用硫酸铵沉淀和透析,获得初酶液,利用相应的底物对酪蛋白酶、偶氮酪蛋白酶、胶原蛋白酶、弹性蛋白酶和胰蛋白酶的活力进行测定。【结果】蜜蜂球囊菌分泌的胞外酶主要有酪蛋白酶、偶氮酪蛋白酶、胶原蛋白酶3种,无弹性蛋白酶和胰蛋白酶。对这3种酶的最适温度、pH值以及热稳定性和酸碱稳定性进行了测定。这3种胞外酶的最适反应温度都在40℃左右,最适pH为7左右,均不耐高温,热稳定性差,在中性的pH环境下比较稳定。【结论】蜜蜂球囊菌可以分泌多种胞外蛋白酶,它们的最适pH和温度与蜜蜂消化道内的环境一致。     

蜜蜂白垩病防治药物的筛选及蜂群抗病机理的探讨

本研究先后采用２０多种药物，经过对蜜蜂球囊菌进行实验室抑菌试验和生产上防治试验，从中筛选与组配出了对蜜蜂白垩病防治效果好、对蜂群使用安全的“复方抗白垩”药物．并对蜂群的抗病机理进行了探讨．     

蜜蜂白垩病防治药物的筛选及蜂群抗病机理的探讨

本研究先后采用２０多种药物，经过对蜜蜂球囊菌进行实验室抑菌试验和生产上防治试验，从中筛选与组配出了对蜜蜂白垩病防治效果好，对蜂群使用安全的“复方抗白垩”药物，并对蜂群的抗病机理进行了探讨。     

蜜蜂常见病防治技术

1.白垩病治疗方法 白垩病是通过子囊孢子传播的,被污染的饲料、死亡幼虫尸体或病脾是病害传播的主要来源.当蜜蜂幼虫吞食了混入饲料中的子囊孢子或菌丝后,孢子即在消化道中萌发,长出菌丝,穿透肠壁,破坏消化道,幼虫表现明显症状.     

球囊菌侵染对意大利蜜蜂成年工蜂的影响

为了探究球囊菌侵染对意大利蜜蜂成年工蜂存活率、免疫基因、发育基因及肠道菌群的影响，将纯化培养的球囊菌孢子接种6日龄意大利蜜蜂成年工蜂，利用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测球囊菌侵染对意大利蜜蜂成年工蜂免疫基因、发育基因及肠道菌群的影响。结果表明，连续3 d接种球囊菌孢子对意大利蜜蜂成年工蜂存活率无显著影响(χ²=0.133,P=0.715)。意大利蜜蜂工蜂中肠与后肠球囊菌孢子含量在接种球囊菌孢子4 d时分别显著高于接种8 d时(P<0.05)。与未接种组相比，接种球囊菌孢子4 d，意大利蜜蜂成年工蜂免疫相关基因abaecin、apidaecin、defensin-1、defensin-2、hymenoptaecin、GNBP-1和IMD均显著上调表达(P<0.05)；接种球囊菌孢子8 d，意大利蜜蜂成年工蜂免疫相关基因相对表达量无显著差异(P>0.05)；接种球囊菌孢子4 d和8 d，发育相关基因VGMC、usp、kr-h1、AMHex10869相对表达量无显著差异(P>0.05)。与未接种组相比，接种球囊菌孢子4 d，意大利蜜蜂成年工...     

蜜蜂消化道内含物细菌群落组成的PCR-DGGE分析

通过PCR-DGGE技术研究蜜蜂消化道内含物的细菌群落组成,结合蜜蜂消化道细菌的形态特征,对蜜蜂肠道可培养的细菌进行分类与鉴定,研究分析了春季和夏季2个季节健康的蜜蜂工蜂的肠道菌相区别,同时还比对了春季健康蜜蜂和病蜂肠道菌相的区别。     

核盘菌子囊盘形成的影响因子

观察比较营养，温度，干燥，土壤深度等因素对核盘菌萌发子囊盘，形成了囊孢子的影响。结果表明：ＰＤＡ不适合培养菌核萌发子囊盘；该菌的不同菌株对低温处理和不同温度的反应有所不同；所试菌株经干燥处理后，不能萌发子囊盘；该菌菌核的子囊盘萌发率随着土壤深度的增加而下降。     

蜜蜂球囊菌分泌多种胞外酶侵染蜜蜂幼虫

对健康和患病蜜蜂幼虫血淋巴进行SDS-PAGE电泳和蛋白酶、酯酶的活性染色,以研究蜜蜂球囊菌分泌的胞外酶种类及对蜜蜂侵染的作用.结果表明:健康蜜蜂幼虫血淋巴中的蛋白含量丰富,主要由4种高分子质量的蛋白组成,而患病幼虫血淋巴中的蛋白含量很少,主要蛋白组分被降解;在患病幼虫血淋巴中可以检测到健康幼虫所没有的多种蛋白酶和酯酶...     

基于RNA-seq数据大规模挖掘蜜蜂球囊菌的SSR分子标记

基于已获得的球囊菌转录组数据预测微卫星标记(SSR),并进行SSR位点的信息分析和SSR引物的挖掘.利用软件MISA对球囊菌转录组中42610条unigenes进行搜索,共预测出7968个SSRs,分布于5233条unigenes中,其中最主要的重复类型为三核苷酸重复(53.15%),其次为二核苷酸重复(32.32%)和四核苷酸重复(8.46%).二核苷酸重复中的基序主要是AG/CT(占总量的15.8%).针对所有的SSR位点,利用Primer Premier 5软件设计出6956对SSR特异性引物,随机选取20对引物对两个不同来源的球囊菌样品进行SSR位点扩增,共有6对引物成功扩增出符合预期的目的片段.研究结果表明,利用球囊菌转录组数据开发SSR引物是可行的.     

微生态制剂EM对蜜蜂微孢子体外发芽抑制实验

防治蜜蜂孢子病的关键是抑制蜜蜂微孢子发芽。分四部分对此进行了探索:第一部分探索了分离纯化蜜蜂微孢子的方法,试验证明Percoll法分离的孢子均匀一致,无杂质和杂菌,适合后期试验要求;第二部分探索了蜜蜂微孢子人工发芽的最佳方法,试验证明KOH法孢子发芽率高,污染率低,为最佳的发芽方法;第三部分探索了蜜蜂微孢子人工发芽的最佳培养基,试验证明pH7.8的PBS发芽率最高,为最佳发芽培养基;第四部分探索了EM对蜜蜂微孢子体外发芽抑制作用,试验证明EM对蜜蜂微孢子体外发芽有较强的抑制的作用,浓度越高,抑制效果越好。     

蜜蜂球囊菌菌丝和孢子中微小RNA及其靶mRNA的比较分析

【目的】蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis,球囊菌)专性侵染蜜蜂幼虫而导致白垩病。本研究旨在通过small RNA-seq（sRNA-seq）技术和生物信息学方法对球囊菌纯化菌丝（AaM）和纯化孢子（AaS）进行深度测序和比较分析,明确球囊菌菌丝miRNA和孢子miRNA的数量、结构和表达谱差异,并揭示菌丝和孢子共有miRNA、特有miRNA和差异表达miRNA（differentially expressed miRNA,DEmiRNA）及其靶mRNA与球囊菌菌丝和孢子生长、发育和病原致病性的潜在关系。【方法】实验室条件下获得纯培养的球囊菌,利用sRNA-seq技术对AaM和AaS分别进行测序,通过对原始读段（raw reads）进行过滤和质控获得有效标签序列（clean tags）。通过Venn分析筛选菌丝和孢子共有miRNA和特有miRNA。根据P≤0.05且|log₂ fold change|≥1的标准筛选AaM vs AaS的DEmiRNA。对上述共有miRNA、特有miRNA和DEmiRNA的靶mRNA进行预测,并对靶mRNA进行GO及KEGG数据库注释。根据靶向结合关系构建DEmiRNA和靶mRNA的调控网络。利用RT-qPCR验证测序数据的可靠性。【结果】AaM和AaS中分别得到12 982 320和12 708 832条raw reads,经过滤和质控分别得到10 800 101和9 888 848条clean tags。AaM中miRNA的长度介于18—26 nt,AaS中miRNA的长度介于18—24 nt,分布miRNA数量最多的长度均为18 nt,AaM和AaS中首位碱基为U的miRNA数量最多。AaM和AaS中表达量最高的miRNA均为miR6478-x、miR10516-x和miR482-x。菌丝和孢子共有miRNA靶向结合5 946个mRNA,二者特有miRNA分别靶向结合6 141和6 346个mRNA。共有miRNA的靶mRNA主要参与代谢进程、细胞进程和催化活性等42个功能条目,以及翻译、碳水化合物代谢和能量代谢等120条通路。AaM vs AaS比较组包含93个DEmiRNA,可靶向结合6 090个mRNA,这些靶mRNA可注释到38个功能条目和120条通路。DEmiRNA与靶mRNA之间形成较为复杂的调控网络,miR-4968-y位于调控网络的中心且能够靶向结合多达118个mRNA。RT-qPCR结果显示5个DEmiRNA的表达趋势与测序数据一致,证实了本研究中测序数据的可靠性。【结论】球囊菌菌丝和孢子中的miRNA具有类似的结构特征,但表达谱表现出明显差异;菌丝和孢子可能通过特异性表达和差异表达部分miRNA对其生长、发育和生殖进行调控。     

不同营养和培养条件对向日葵黑茎病菌生长特性的影响

[目的]对向日葵黑茎病菌Phoma helianthi Taberosi生态适应性中的营养和培养条件进行研究,以期建立常规生物学检测方法,以便采取有效检疫处理措施.[方法]不同营养和培养条件下(包括培养基、碳源、氮源、温度、酸碱度、光照),对该菌培养7 d,测量其菌落直径大小和观察其生长状况.并用SPSS 12.0软件进行相应的计算处理、统计分析.[结果]向日葵黑茎病菌在PDA、HLA培养基上生长较好,在WA培养基上生长较慢.该病菌能充分利用可溶性淀粉和硝酸钾.在温度4-32℃均能生长,最适生长温度为24-28℃,适宜生长的PH4.0-8.0,最适PH5.0-7.0;在全光照培养条件下有助于菌丝的生长.[结论]通过不同营养和培养条件下的生长情况,可知该病菌的最适生长条件,有助于对该病菌进行有效的检疫处理.     

金属离子对蜜蜂球囊菌几丁质酶活力的影响

探讨了不同金属离子对蜜蜂球囊菌几丁质酶活力的影响.结果表明:在0-100 mmol.L-1范围内,一价金属离子Na+、K+随离子浓度的增大,对几丁质酶活力的影响表现为先促进后抑制;在1-10 mmol.L-1范围内,二价金属离子Mg2+、Mn2+起抑制作用,Zn2+基本没有影响,Ca2+、Fe2+起促进作用;在1-10 mmol.L-1范围内,三价金属离子A l3+起促进作用,Fe3+基本没有影响.     

松口蘑菌丝体培养特性初步研究

采用固体培养方法对松口蘑菌丝体在不同培养基和培养条件下的菌丝生长状况进行比较分析,结果表明:适合菌丝体生长的最佳培养基为PDA,最适培养温度为23℃,最适初始pH值范围是5.0~6.0。