细菌性条斑病非寄主抗性基因Rxo1在水稻中同源序列的表达和遗传定位分析

利用在玉米中克隆到的一个抗水稻细菌性条斑病的非寄主抗性基因Rxo1中含有NBS LRR结构的开放读码框（ORF）在水稻基因组中搜索到16个抗性基因同源序列,进一步研究发现,位于第11染色体上的同源序列基因RPR1与细菌性条斑病的抗性有一定关系。首先,以RPR1为模板设计的两对引物都只在供试的细菌性条斑病抗病品种中扩增出目标带;再者RT PCR的结果表明RPR1的表达能被细菌性条斑病菌接种所诱导,说明来自不同物种的结构相似的抗性基因可以表达相同或相似的功能。但从对RPR1定位的结果看,RPR1与之前定位的抗细菌性条斑病主效QTL之间尚有9 cM的图距,两者之间的连锁并不紧密,说明RPR1的表达并不能解释抗病品种Dular对细菌性条斑病的抗性,RPR1并不是水稻表达细菌性条斑病抗性的关键因子。     

基于QTL-Seq的水稻抗细菌性条斑病QTL定位

【目的】发掘水稻抗细菌性条斑病新基因，丰富抗病基因资源，为水稻抗细菌性条斑病基因克隆及分子育种提供依据。【方法】以抗病材料广西普通野生稻WP1和感病品种9311及其衍生的F8:9代RIL群体为研究材料，利用QTL-Seq初定位与细菌性条斑病抗性相关的区间，之后利用QTLIciMapping4.1进行复合区间作图以验证结果并精细定位。【结果】分别在第4、8、10染色体上鉴定了一个与细菌性条斑病抗性相关的位点，复合区间作图验证了第4染色体抗细菌性条斑病QTL位点qBLS4.1，表型贡献率和LOD值分别为10.65%和5.03，并进一步将qBLS4.1精细定位在521kb的范围内。抗感亲本序列比对分析发现，在41个基因的编码区共有252个非同义突变，可能与细菌性条斑病抗性相关。【结论】通过QTL-seq分析结合复合区间作图法可以更快速高效地对水稻QTL进行定位，鉴定了一个抗细菌性条斑病性QTL新位点qBLS4.1，为水稻抗细菌性条斑病新基因鉴定与克隆奠定基础。     

水稻细菌性条斑病非寄主抗性基因Rxo1的双右边界双元载体的构建

 Rxo1 是从玉米中克隆的水稻细菌性条斑病非寄主抗性基因。采用ScaⅠ和NgoMⅣ酶切携带Rxo1 基因的载体pCAMBIA1305 1,HpaⅠ和XmaⅠ酶切双右边界双元载体pMNDRBBin6,通过平端和黏性末端连接目的基因和载体,得到了重组载体pMNDRBBin6 Rxo1。 PCR和限制性内切酶酶切以及序列测定证实Rxo1 整合到了双右边界载体pMNDRBBin6中。该载体为利用转基因技术获得无选择标记抗细菌性条斑病水稻育种材料提供了条件。     

水稻细菌性条斑病非寄主抗性基因Rxo1的双右边界双元载体的构建

Rxo1 是从玉米中克隆的水稻细菌性条斑病非寄主抗性基因。采用ScaⅠ和NgoMⅣ酶切携带Rxo1 基因的载体pCAMBIA1305 1,HpaⅠ和XmaⅠ酶切双右边界双元载体pMNDRBBin6,通过平端和黏性末端连接目的基因和载体,得到了重组载体pMNDRBBin6 Rxo1。 PCR和限制性内切酶酶切以及序列测定证实Rxo1 整合到了双右边界载体pMNDRBBin6中。该载体为利用转基因技术获得无选择标记抗细菌性条斑病水稻育种材料提供了条件。     

美国稻品种对白叶枯病和细菌性条斑病的抗性鉴定

 对美国南部和西部地区广泛种植和将要推广的水稻品种42个，孕穗期接种白叶枯病和细菌性条斑病病菌，以抗病品种IR26，感病品种金刚30和南京11作为对照品种进行抗性鉴定。白叶枯病Z173和GD1358两个菌株在所有42个品种上均能侵染发病，未发现高抗或免疫品种，对Z173表现抗病或中抗水平的品种约占85％以上，表现感病的只有1个。而用GD1358接种时，表现抗病或中抗水平的品种仅占总品种数的28％左右，多数抗Z173的品种对GD1358表现中抗或中感。对GD1358表现抗病的Gulfrose, Bellmont和IR36M4三个品种对Z173也表现抗病,具有较宽的抗谱。与白叶枯病菌相仿，两个细菌性条斑病菌菌株在所有美国稻品种上均能侵染形成典型病斑，未发现高抗和免疫品种。对强毒菌株BS93表现抗病和中抗的品种分别占总品种数的19.1%和38.1%；而对中等毒力菌株BS39表现抗病和中抗的品种分别占总品种数的52.4%和31.0%，其中22个抗病品种中, 只有8个品种抗强毒菌株BS93，其余的品种对BS93均表现中抗或中感。其中Lebonnet和LA2168甚至表现感病。比较同一品种对两种不同病害的抗性表现，可以看出一些对白叶枯病有较好抗性的品种，如Gulf rose,IR36M4等对细菌性条斑病也有很好抗性，对白叶枯病表现感病的品种如Lacassine、Jasmine等对细菌性条斑病菌也呈感病反应。在测定的42个品种中未发现对白叶枯病表现抗病，而对细菌性条斑病表现感病的品种，或对细菌性条斑病表现抗病，而对白叶枯病表现感病的品种。研究结果表明，美国水稻品种对白叶枯病的抗性和其对细菌性条斑病的抗性有一定的相关性。     

美国稻品种对白叶枯病和细菌性条斑病的抗性鉴定

对美国南部和西部地区广泛种植和将要推广的水稻品种42个,孕穗期接种白叶枯病和细菌性条斑病病菌,以抗病品种IR26,感病品种金刚30和南京11作为对照品种进行抗性鉴定。白叶枯病Z173和GD1358两个菌株在所有42个品种上均能侵染发病,未发现高抗或免疫品种,对Z173表现抗病或中抗水平的品种约占85％以上,表现感病的只有1个。而用GD1358接种时,表现抗病或中抗水平的品种仅占总品种数的28％左右,多数抗Z173的品种对GD1358表现中抗或中感。对GD1358表现抗病的Gulfrose, Bellmont和IR36M4三个品种对Z173也表现抗病,具有较宽的抗谱。与白叶枯病菌相仿,两个细菌性条斑病菌菌株在所有美国稻品种上均能侵染形成典型病斑,未发现高抗和免疫品种。对强毒菌株BS93表现抗病和中抗的品种分别占总品种数的19.1%和38.1%;而对中等毒力菌株BS39表现抗病和中抗的品种分别占总品种数的52.4%和31.0%,其中22个抗病品种中, 只有8个品种抗强毒菌株BS93,其余的品种对BS93均表现中抗或中感。其中Lebonnet和LA2168甚至表现感病。比较同一品种对两种不同病害的抗性表现,可以看出一些对白叶枯病有较好抗性的品种,如Gulf rose,IR36M4等对细菌性条斑病也有很好抗性,对白叶枯病表现感病的品种如Lacassine、Jasmine等对细菌性条斑病菌也呈感病反应。在测定的42个品种中未发现对白叶枯病表现抗病,而对细菌性条斑病表现感病的品种,或对细菌性条斑病表现抗病,而对白叶枯病表现感病的品种。研究结果表明,美国水稻品种对白叶枯病的抗性和其对细菌性条斑病的抗性有一定的相关性。     

应用候选基因定位水稻抗稻瘟病QTL

 应用经克隆了的已知功能或有潜在功能的DNA序列,即候选基因，作为分子标记，在中156/谷梅2号F8重组自交系群体中进行水稻抗稻瘟病QTL的分析。大部分候选基因在水稻染色体上成簇分布，并且位于已知抗病基因簇区域。应用复合区间法检测到1个调控病斑大小和1个调控病斑数量的QTL，前者位于第1染色体CG36a~RM212区间，贡献率为4.17%，抗性等位基因来自父本谷梅2号；后者定位于第2染色体CG18a~RM263区间，贡献率为6.25%，抗性等位基因来自母本中156。同时检测到2对控制病叶面积和1对控制病斑大小的基因互作。这些QTL和互作基因涉及抗性基因同源序列、离子通道调控子以及编码致病相关蛋白和几丁质酶的基因，表明候选基因的应用有助于揭示QTL的功能。玉米锈病抗性基因Rp1与稻瘟病抗性有关，提示了利用水稻这个模式作物来克隆较大基因组中有利基因的可能性。     

小麦Mlo基因的克隆及白粉病菌诱导下的表达模式分析

为了研究Mlo基因在感、抗小麦品种中的表达情况,根据小麦基因芯片的Mlo探针序列,利用电子克隆与RT-PCR方法在感病小麦品种豫麦13和抗病品种红蚰麦中分别克隆到Mlo基因的同源序列。两条核苷酸序列全长均为1 605 bp,都含有一个完整的ORF(Open reading frame)。核苷酸序列分析显示二者的DNA序列只有一个核苷酸的差异,与大麦Mlo的相似性均为90%。编码的氨基酸序列包含有7个跨膜结构域,前18个氨基酸是信号肽序列,第414~435位是编码蛋白的活性中心,第451、459、462、475、483位点上有糖基化位点,细胞定位分析将其定位在膜上。从头建模分析构建的二者三维结构有明显差异。利用定量PCR对该基因在白粉菌诱导早期的表达模式进行分析,结果两基因的表达都受白粉菌的诱导,但在红蚰麦中的表达高峰出现在18 h,豫麦13中的表达高峰出现在72 h,表达时间的差异可能决定了两者对白粉菌的不同抗性反应。     

江西东乡野生稻对三种病害抗性的研究

采用常规方法研究了20℃份江西东乡野生稻对稻瘟病、白叶枯病和细菌性条斑病的抗性，东乡野生稻抗稻瘟病性差，但对白叶枯病和细菌性条斑病的抗性较好，对两病的抗性呈极显著正相关（r=0.68)；抗三种病害的材料有5份。     

水稻烯酰辅酶A水合酶的功能预测分析

水稻潜根线虫是一类寄生于水稻根部的迁移性内寄生线虫，广泛分布于各类水稻田中，成为严重危害水稻的寄生线虫，其中水稻细尖潜根线虫是江西省最严重的水稻潜根线虫之一。目前培育抗病品种是防治水稻潜根线虫病最为经济、有效的措施。通过转录组分析水稻细尖潜根线虫侵染的和未受水稻细尖潜根线虫的感病水稻品种‘霸王鞭’根组织基因表达情况，筛选出差异表达显著上调基因OsECH1，并对OsECH1蛋白及其同源蛋白进行系统发育分析。结果表明：OsECH1蛋白与其他同源蛋白具有相同的保守结构域PLN02874，属于ECH家族。同时发现在水稻‘日本晴’中有5个同源基因，其中OsECH1基因位于染色体1上；克隆获得OsECH1基因全长并利用同源重组技术构建重组表达载体，通过农杆菌转化获得转基因水稻；经RT-qPCR分析该基因表达水平对水稻细尖潜根线虫侵染的影响。结果表明，在水稻中过表达OsECH1基因会减少水稻细尖潜根线虫的侵染，沉默OsECH1基因会增加水稻细尖潜根线虫的侵染；OsECH1蛋白亚细胞定位于细胞核中；通过His-tag pull down分析，该蛋白可能与5种防御相关蛋白互作。5种防御相关蛋白分别属于v...     

水稻不育系系谱抗稻瘟病基因同源序列的克隆与序列分析

根据已知NBS-LRR类抗病基因结构中氨基酸的保守区域设计简并引物,对水稻不育系系谱NBS-LRR类抗病基因同源序列进行克隆、测序和聚类。同源序列克隆与分析表明,7个水稻不育系系谱亲本中共获得14个阳性克隆,其中11个含有NBS-LRR类抗病基因所特有的保守氨基酸结构域KinaseⅠ、KinaseⅡ、KinaseⅢ及跨膜区域。这些片段间同源性最高达98.3%,最低仅为29.7%;11个氨基酸片段与抗病基因Xal（AB002266）的同源性较高,42%-45%的氨基酸序列相同,59%-64%的氨基酸序列相似,且与水稻其他NBS-LRR类抗性蛋白相似性很高。通过聚类分析,可以将其分为3类,分别记为G1、G2、G3,并发现抗源谷农13所含有的G3类基因,通过天谷、福伊传给后代谷丰、全丰。     

水稻抗病基因同源序列的克隆及测序分析

 根据已知的NBS LRR类及丝/苏氨酸蛋白激酶类抗病基因结构中氨基酸的保守区域，设计了两组简并引物用于扩增广谱抗稻瘟病品种云系2号中的抗病基因同源序列。结果一共获得11类的NBS-LRR类抗病基因同源片段及16类的丝/苏氨酸蛋白激酶类抗病基因同源片段。所有11类的抗病基因同源系列均含有NBS-LRR类抗病基因的保守序列，如P-loop、Kinase 2、Kinase 3a以及跨膜区域等。所有16类的蛋白激酶的序列均含有丝/苏氨酸蛋白激酶所共有的催化区Ⅵ（共有氨基酸序列：DLKPEN）、Ⅷ（共有氨基酸序列：GT/SXXYXAPE）以及蛋白激酶的其他催化区。两条NBS-LRR类的抗病基因同源片段YR1、YR12分别与抗病基因I2 C-2及Xa1氨基酸同源性很高(>50%)。7条丝/苏氨酸蛋白激酶类的抗病基因同源片段与已克隆的[WTBX][STBX]Xa21、Pto、Lr10[WTBZ][STBZ]等抗病基因的氨基酸序列超过60%的相同以及76%~78%的氨基酸类似。     

花生DNA分子标记的研究ⅡRGA标记

采用4对RGA引物、9份花生材料进行PCR扩增．只有引物NLRR inv1／inv2扩增出产物。采用该对引物扩增．18份材料中只有10份获得产物。总共获得58条迁移率不同的带．其中多态性带56条。根据条带共享程度计算出的带型相似指数为0．188～0．986。10份材料可以按条带数目多寡分成两大类。     

高原粳稻子预44抗稻瘟病基因遗传分析和定位

 以高感稻瘟病的低海拔粳稻江南香糯与高抗稻瘟病的高原粳稻子预44作亲本进行杂交,获得F1、F2、BC1F1和以F2单粒传构建的、由276个株系组成的F7重组自交系群体。分别用稻瘟病菌生理小种ZB13和ZE1对两亲本江南香糯和子预44及其杂交后代群体F1、F2和BC1F1进行抗性接种鉴定和遗传分析。结果表明,子预44对稻瘟病菌生理小种ZB13和ZE1的抗性都表现为单基因控制的显性遗传。进一步利用重组自交系F7群体的266个有效株系作为定位群体,将抗稻瘟病菌生理小种ZE1的基因定位在水稻第11染色体上与SSR标记RM206间遗传距离为0 cM的位置,暂定名为Pi zy（t）。这些结果为进一步将子预44中的抗性基因用于水稻抗病育种及该抗稻瘟病基因的克隆奠定了重要基础。     

水稻细条病田间抗性鉴定及指标评价

以50份水稻材料为研究对象进行田间细条病抗性观察鉴定，对病斑占总叶面积率(病斑占比)、病斑长度、病叶率和病情指数等抗性指标进行相关和主成分分析，研究3个指数间及其与剑叶宽度的相关性。结果表明：病斑占比是田间评价细条病发病情况的理想指标；病斑长度是唯一与剑叶宽度存在极显著相关的指数；按照病斑占比(IRRI标准)，5份材料L424、L425、L427、L433和L443表现为中抗(10%)，15份表现为中感(30%)，20份表现为感病(40%)，10份表现为高感(20%)。     

香蕉NBS-LRR抗病基因类似序列的克隆和分析

根据大多数抗病基因的核苷酸结合区(NBS)和富含亮氨酸重复序列(LRR)保守区的氨基酸序列设计PCR简并引物,利用快速而又可行的简并PCR技术获得NBS-LRR类抗病基因类似序列。笔者利用该技术从香蕉cDNA中获得了一个NBS-LRR类抗病基因类似序列,命名为B-NB(SAY739270)。结构域分析发现,B-NBS含有NBS蛋白所具有的P-Loop、Kinase-2、Kinase-3a和下游疏水GLPLAL结构域(HD,GLPLAL)4个保守基序。聚类分析发现,B-NBS与已报道的6个植物抗病基因的NBS基序的遗传距离在21.7之内。因此,B-NBS是一个香蕉NBS-LRR类抗病基因类似序列。本研究将为香蕉抗病基因克隆和抗病机理研究提供新的抗病候选基因资源。     

甘薯NBS-LRR类抗病基因同源序列的克隆、分析及数目研究

根据植物抗病基因保守序列设计特异引物,对甘薯高抗茎线虫病品种AB94078-1、感病品种徐18及其8个后代品系进行PCR扩增.获得15个具有完整氨基酸读码框的片段,均具有NBS类抗病蛋白4个保守基序,其中5个片段含LRR结构.利用从亲本AB94078-1扩增的R510-AB作为探针进行Southern杂交,结果表明,其在基因组中存在多个拷贝,并估计其在基因组中的拷贝数目,克隆新的甘薯RGA序列,为进一步获得甘薯抗病基因打下基础.