苦荞黄烷酮3-羟化酶基因FtF3H及其启动子的克隆与功能分析

【目的】克隆苦荞FtF3H基因及其启动子序列,探究该基因的生物学效应及启动子对环境因素与激素的响应。【方法】基于苦荞基因组和转录组数据克隆FtF3H基因及其启动子,对二者进行生物信息学分析,采用qRT-PCR技术检测FtF3H对MeJA、ABA和光处理的响应,进一步利用转基因拟南芥技术,分析FtF3H的过表达对黄酮合成的影响。【结果】苦荞FtF3H基因DNA序列长2 034 bp,包括2个内含子和3个外显子;其ORF序列为1 104 bp,推导的FtF3H蛋白含367个氨基酸残基,归类于2-酮戊二酸依赖性双加氧酶超家族且具有典型的植物F3H的分子特征。启动子PFtF3H在核心启动子基序外,还含有数目众多的光应答元件和激素响应元件,qRT-PCR检测结果显示,PFtF3H可强烈响应ABA、MeJA和光照的诱导。转基因拟南芥中,FtF3H的过表达可引起总黄酮含量显著增加（P<0.05）,黄酮合成相关酶基因,AtANS、AtDFR和AtF′3H等的表达量显著上调（P<0.05）,而拟南芥内源的AtF3H表达受到抑制（P<0.05）。【结论】苦荞FtF3H基因是一个典型的植物...     

花生黄烷酮3-羟化酶基因AhF3H的克隆和表达分析

利用花生转录组测序结果和GenBank EST数据库,首次从花生中克隆了黄烷酮3-羟化酶基因,命名为AhF3H,GenBank登录号为KF312218。氨基酸序列分析表明,AhF3H与其他植物F3H有较高的同源性。进化树分析表明,AhF3H与大豆、野生大豆F3H的亲缘关系较近。在花生紫色种质材料及丰花1号中,AhF3H的相对表达水平同花青素含量呈正相关,表明AhF3H在花生花青素合成代谢过程中具有重要作用。     

核桃黄烷酮3-羟化酶基因cDNA 3′端的克隆与序列分析

从核桃(Juglans regia)中首次克隆得到黄烷酮3-羟化酶基因的cDNA片段,并命名为JrF3H,GenBank登录号为FJ966204.JrF3H长1 029 bp,编码342个氨基酸.蛋白质序列多重比对结果表明,推导的JrF3H蛋白质与其他植物F3H蛋白质具有很高的相似性,JrF3H蛋白质与茶学、拟南芥、大豆、烟草、小麦和银杏F3H蛋白质序列的同源性分别为86%、85%、85%、82%、80%和79%.此外,JrF3H在相似的位置存在结合亚铁离子和酮戊二酸的保守位点.F3H系统进化树表明,JrF3H与乔木类植物的F3H基因聚类关系最近.JrF3H基因的克隆将有助于弄清该基因在核桃黄酮代谢途径中所起的作用.     

汉中黑稻黄烷酮3-羟化酶基因(F3H)的遗传变异分析

本实验通过PCR和测序拼接获得汉中地区8个黑稻品种黄烷酮3-羟化酶基因(F3H)编码区序列,在NCBI中用BLAST分析首次发现该基因位于水稻4号染色体。发现8种黑稻和普通籼稻F3H序列完全相同,与粳稻相比较,则存在4个突变位点,导致2个氨基酸突变。基于F3H序列信息的进化树表明黑稻与籼稻、粳稻、小麦、玉米的亲缘关系较近;遗传距离和同源性分析表明F3H基因较为保守,是一个古老的基因,可用于种属的鉴定分析。F3H蛋白理化性质分析发现,黑稻与其它禾本科植物存在一定差异,蛋白三维结构及相关位点预测发现粳稻和黑稻无明显差异,初步认为黑稻F3H序列变异可能与花青素的合成无关,需要在其表当量与花青苷和成合成与沉积的关系方面开展进一步研究。     

植物黄烷酮3-羟化酶的生物信息学分析

研究黄烷酮3-羟化酶家族的酶学特性,为黄酮类化合物生物合成的分子机理提供理论依据。对NCBI已注册的12个植物F3H的核酸和氨基酸序列进行生物信息学方法分析,对其组成成分、理化性质、亚细胞定位、跨膜结构、分子进化、蛋白质二级结构和结构域进行预测和推断。结果得出,F3H蛋白是定位于细胞基质,无信号肽的非分泌型蛋白,α-螺旋和不规则卷曲是蛋白质二级结构中量最多的结构元件,伸展片段散布于整个蛋白质中。     

紫色甘薯渝紫薯7号黄烷酮3-羟化酶基因的克隆和序列分析

为渝紫薯7号品种后续的遗传转化及其分子育种提供理论基础,采用同源克隆和RACE方法对其生物合成途径中关键酶基因进行同源性克隆及生物信息学分析。结果表明:从渝紫薯7号中克隆到F3H基因的全长c DNA序列(Genbank登录号为KU144881),序列全长为1280 bp,包括5’端UTR+一个编码368个氨基酸残基的编码区+3’端UTR+poly A尾巴;F3H基因蛋白具有结合酮戊二酸的RXS基序Arg287-Ser285和结合亚铁离子的保守氨基酸His219、Aps221和His277,结构域位于蛋白的核心(Fe2+被包埋在酶的中心);在Gen Bank中,渝紫薯7号F3H的序列与圆叶牵牛的F3H序列之间具有很高的相似性,为96%;渝紫薯7号F3H蛋白与近缘物种茑萝氨基酸相似性较高,为94%;渝紫薯7号F3H符合植物中普遍存在的F3H基因,同时具有生物学活性。     

黄烷酮3-羟化酶基因表达分析及转基因大豆新种质创制

黄烷酮3-羟化酶(F3H)是大豆异黄酮代谢途径重要酶类。研究F3H在不同大豆品种中的表达差异,并应用转基因途径创制新种质是提高大豆异黄酮含量的重要途径。以高异黄酮含量大豆品种中豆27和低异黄酮含量大豆品种楚秀为试材,采用q PCR技术,分析F3H在大豆不同发育时期、组织部位中的表达差异;并利用花粉管通道转化技术,获得转F3H阳性植株。结果表明:F3H在2个大豆品种R1~R7期叶片中的表达模式不同,中豆27的F3H表达量在R1期最高,而后开始下降,R2~R5期维持较低水平,R6期略有上升,R7期又出现下降;楚秀F3H表达量在R1~R4期较低,R5期出现表达高峰,R6期开始下降。F3H在2个大豆品种R5~R8期籽粒中的表达模式基本相同,表达量均从R5期开始下降,且R6~R8期维持较低水平。基于此,构建F3H RNAi反义载体,并利用花粉管通道技术转入不同大豆品种,获得了5个转基因新材料。     

山葡萄中类黄酮3＇5’-羟化酶基因（F3’5＇H）cDNA的克隆和分析

用RT—PCR和SMARTRACE技术克隆了山葡萄F3’5’H基因的全长eDNA序列。GenBank登陆号为FJ645767,F3＇5＇HcDNA全长1779bp,包括开放阅读框1527bp,编码508个氨基酸,该基因表达产物相对分子质量为56．70kDa,等电点为9．28,是稳定蛋白。该基因属于P450超基因家族,不包含信号肽。氨基酸序列与欧亚种葡萄（DQ786631）、仙客来（GQ891056）、大豆（AY117551）、矮牵牛（Z22544）和飞燕草（AY856345）等植物的F3’5’H氨基酸序列的同源性系数分别为98％、81％、76％、76％和71％。     

山葡萄查尔酮合成酶基因的克隆与分析

为揭示查尔酮合成酶在山葡萄中的次生代谢途径,采用RT-PCR和RACE技术相结合的方法,从山葡萄果皮中克隆到查尔酮合成酶(CHS)基因的cDNA全长序列。结果表明:该基因全长1 461bp,包含1 182bp的完整开放阅读框,编码393个氨基酸,分子量为42.91KDa,等电点(PI)值为6.10。该基因属于无色花色素双加氧酶基因家族,二级结构预测表明,α-螺旋是VamCHS蛋白最大量的结构元件,氨基酸序列与欧亚种葡萄(BAB84112)、杂交种葡萄(ACS36661)和圆叶葡萄(ACN30003)等的CHS类基因同源性较高,分别为100%、96%和96%。     

山葡萄查尔酮异构酶(VamCHI)基因的克隆与分析

采用RT-PCR和RACE技术相结合的方法,从山葡萄(Vitis amurensis Rupr.)果皮中克隆到查尔酮异构酶(CHI)基因的c DNA全长序列。该基因全长955 bp,包含705 bp的完整开放阅读框,编码234个氨基酸。分子量为25.04 k Da,等电点(PI)为5.21。该基因属于查尔酮超级基因家族,二级结构预测表明,随机卷曲是Vam CHI蛋白质最大量的结构元件,不具有信号肽,属于稳定的亲水蛋白质。氨基酸序列与欧亚种葡萄(NP_001268033)、美洲种葡萄(ACS36662)和显齿蛇葡萄(AGO02170)的同源性较高,相似性分别为98%、98%和91%。     

山葡萄C4H基因的克隆表达及遗传转化分析

通过生物学技术来研究C4H基因在山葡萄着色过程中的作用,进而揭示山葡萄果皮着色的分子机理;利用RT-PCR技术克隆了山葡萄C4H基因的全长cDNA序列,并对该蛋白进行生物信息学分析,预测其功能;利用实时荧光定量PCR检测C4H基因在山葡萄8个不同转色时期的表达量,将克隆获得的山葡萄C4H基因完整的ORF连接到原核表达载体pET28a上,转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3),并通过不同浓度的IPTG诱导表达, SDS-PAGE检测表达产物.为了验证山葡萄C4H基因的功能,构建了表达载体pC C4H并转化农杆菌GV3101.用菌液浸泡花序法对拟南芥进行遗传转化,在含50 mg/L Kan的培养基上对T_0代种子进行筛选.克隆获得的山葡萄C4H cDNA全长1 735 bp,开放阅读框1 518 bp,编码505个氨基酸,该基因表达产物分子质量为57.70 KDa,等电点值9.06.C4H基因在山葡萄果皮转色各个时期均存在表达;该基因原核表达产物与预期大小一致,表明原核表达成功,拟南芥遗传转化先后得到3个阳性幼苗.对移栽成活的2株抗性植株进行PCR检测为阳性, 2株叶片颜色均变成紫红色;经花色素苷质量浓度的测定表明其质量浓度比对照组植株高出3倍.在拟南芥中花色素苷质量浓度虽然较低,但还是能少量合成,说明其花色素苷生物合成途径是开通的,只是积累的量较少.     

矮牵牛查尔酮黄烷酮异构酶（chiA）基因启动子的克隆和测序

通过ＰＣＲ扩增,从矮牵牛中克隆了能在花瓣、花药、花粉中特异表达的查尔酮黄烷酮异构酶（ｃｈｉＡ）基因启动子,序列分析表明该启动子含１３０５个核苷酸,与国外报道的序列完全一致。     

金银花香豆酸3-羟化酶基因LjC3H2的生物信息学分析

香豆酸3-羟化酶广泛存在于植物中,属于细胞色素P450家族的CYP98A亚家族。该酶能在植物苯丙素代谢中催化苯环C3位置的羟基化反应,是绿原酸生物合成的关键酶之一。本文以金银花香豆酸3-羟化酶基因LjC3H2为研究对象,采用生物信息学方法进行分析。结果表明,LjC3H2无信号肽,无跨膜结构域,偏亲水,定位于内质网上;二级结构以α螺旋为主,无规则卷曲较多。LjC3H2与其他植物同源蛋白氨基酸序列比对和系统发育分析表明,LjC3H2与蓟、桔梗的C3H亲缘关系较近,与同属于金银花的LjC3H亲缘关系较远;该蛋白的三级结构与细胞色素P450三级结构相似。     

膜荚黄芪异黄酮3′-羟化酶基因的克隆及表达分析

异黄酮3′-羟化酶(Isoflavone 3′-hydroxylase,I3′H)是催化合成毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮葡萄糖苷的关键酶.该研究从膜荚黄芪中克隆了I3′H基因cDNA全长,并对其进行了生物信息学分析,同时采用高效液相色谱法分别测定了毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量.结果表明:I3′H基因cDNA全长为18...     

山葡萄F3’5’H基因的克隆与表达及其启动子5′端缺失片段的功能分析

通过克隆山葡萄（Vitis amurensis）类黄酮-3’5’-羟化酶（flavonoid-3’,5’-hydroxylase,F3’5’H）基因及其启动子,并进行基因的原核表达和启动子不同缺失片段的瞬时表达,研究山葡萄不同种类花色苷的形成机制。克隆得到F3’5’H基因全长1 527bp,分析其理化性质发现,‘双红’品种F3’5’H较‘双丰’品种有所差异,通过对F3’5’H重组蛋白体外表达条件的探究,在温度为25℃、培养时间为11h且IPTG浓度为0.8mmol·L-1的条件下,目的蛋白在上清样品中有与预测重组蛋白分子量大小一致且较高浓度的表达带。山葡萄F3’5’H基因启动子序列共1 271bp,启动子序列中除具有核心启动子元件CAAT-box和TATA-box外,还有一系列光响应元件。采用启动子缺失技术研究不同长度缺失片段启动子在烟草中的瞬时表达,发现随着F3’5’H启动子缺失片段长度的增加,GUS酶活性呈先上升后下降的趋势。     

石榴花类黄酮3′羟化酶基因的克隆及序列分析

为研究花色苷生物合成途径中类黄酮3′羟化酶基因(F3′H)的序列信息,以泰山红石榴花瓣为试材,提取总RNA后反转录为cDNA,根据GenBank中登录的相关物种F3′H基因的保守序列设计兼并引物,对反转录后的cDNA进行PCR扩增并测序。结果表明:在石榴中克隆到了长度为996bp的F3′H基因cDNA片段,该基因编码331个氨基酸,含有细胞色素P450保守域,属于CYP75B亚家族。该序列在GenBank中的登录号为KC430328。     

山葡萄转录因子CBF1基因的克隆及其遗传转化体系

根据山葡萄的CBF1基因序列设计一对特异引物,克隆出山葡萄(Vitis amurensis)栽培品种‘双优’的抗寒转录因子CBF1基因,并将其构建到pBI121表达载体中,获得山葡萄转录因子CBF1基因的植物表达载体,命名为pBI121-ViCBF1,利用农杆菌介导叶盘转化‘巨峰’葡萄以研究高效的‘巨峰’葡萄转化体系。结果表明,以农杆菌LBA4404为介导菌株,以‘巨峰’葡萄叶片为外植体、3 d为预培养时间和4~5 d共培养时间、400 mg·L-1羧苄青霉素,50 mg·L-1卡那霉素筛选浓度转化效果较好,并已筛选到6株转基因植株,PCR检测均为阳性,为提高‘巨峰’葡萄的抗寒性建立了初步的技术基础。     

桂花β-胡萝卜素羟化酶基因的克隆与序列分析

为揭示桂花不同品种β-胡萝卜素羟化酶(β-carotene hydroxylase,HYB)基因的序列差异,利用已构建的桂花花瓣转录组数据库中Unigene序列信息,结合RT-PCR技术对桂花品种玉玲珑、金球桂、堰虹桂和日香桂中2个β-胡萝卜素羟化酶基因(HYB1和HYB2)的最大阅读框进行扩增,并测序验证。生物信息学分析结果表明,4个桂花品种HYB1基因均含有长为909 bp的开放阅读框,编码302个氨基酸残基; HYB2基因均含有长为915 bp的开放阅读框,编码304个氨基酸残基。4个桂花品种HYB1和HYB2推导的氨基酸序列均具备保守的组氨酸结构域。HYB1基因核苷酸序列存在27个变异位点,其氨基酸序列存在8个变异位点; HYB2基因核苷酸序列存在12个变异位点,其氨基酸序列存在3个变异位点。进化树分析结果发现,4个桂花品种的HYB1和HYB2蛋白与茄科植物番茄和辣椒HYB蛋白亲缘性最高。     

羽衣甘蓝β-胡萝卜素羟化酶基因的克隆及表达分析

以羽衣甘蓝(Brassica oleracea L. var. acephala)为试验材料,采用同源克隆和RT-PCR技术,克隆得到羽衣甘蓝β-胡萝卜素羟化酶的c DNA全长,命名为Bo BCH(Gen Bank登录号为MH016242)。序列分析表明,该c DNA序列长906 bp,编码301个氨基酸,分子量33. 8 ku,理论等电点为9. 67。保守结构域分析表明,Bo BCH属于FA_hydroxylase蛋白超家族。系统发育分析结果表明,羽衣甘蓝与结球甘蓝处于同一分支,其亲缘关系最近。TMHMM和Wolf-Psort进行跨膜区分析及亚细胞定位,结果表明Bo BCH蛋白有4个跨膜区域,可能定位于叶绿体中发挥作用。q RT-PCR检测结果表明,Bo BCH在紫叶羽衣甘蓝DH系D07的根、茎、叶中均有表达,在叶片中表达量最高,茎次之,根中表达量最低;不同发育时期的检测结果表明,Bo BCH在观赏期叶片中表达最高,在幼苗期和莲座期表达水平较低。