奶牛子宫内膜粘液抗菌肽的分离纯化

为研发奶牛抗菌肽生物制剂,防治奶牛子宫内膜炎,本研究采用酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖弥散法检测子宫内膜粘液酸溶性提取物抗菌活性;应用琼脂糖电泳及水平电泳洗脱分离相应的抗菌条带,HPLC进一步分离纯化,琼脂糖弥散法检测纯化分子抗菌活性,Tricine-SDS-PAGE电泳检测其分子量。结果表明,从奶牛子宫内膜酸溶性提取物中纯化出一分子量约为14kD左右的抗菌多肽,对大肠杆菌(E.coliBL21)和金黄色葡萄球菌26003具有抗菌活性。本研究可能分离纯化出一种新的子宫内膜分泌的抗菌多肽,其可能参与奶牛子宫的天然防御机制。     

PGD2/DP1途径对细菌感染奶牛子宫内膜组织中HMGB-1和PAFR表达的影响

为了研究前列腺素D₂（prostaglandin D₂,PGD₂）/DP₁受体途径对大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）感染奶牛子宫内膜组织中炎症介质HMGB-1和PAFR的表达及对组织损伤程度的影响,试验以体外培养奶牛子宫内膜组织为研究对象,应用1×10^-6 mol/L DP₁受体激动剂（BW-245C和15d-PGJ2）和等量（1×10⁶ CFU/mL）大肠杆菌、金黄色葡萄球菌共同处理奶牛子宫内膜组织,采用实时荧光定量PCR、免疫组化和HE染色法检测奶牛子宫内膜组织中HMGB-1和PAFR的表达并评价组织损伤情况。结果显示,与空白对照组相比,大肠杆菌和金黄色葡萄球菌感染奶牛子宫内膜组织中HMGB-1和PAFR表达量显著升高（P<0.05）,而DP₁受体激动剂与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌共处理奶牛子宫内膜组织中DP₁受体激动剂显著抑制奶牛子宫组织中HMGB-1和PAFR的表达（P<0.05）。HE染色结果显示,大肠杆菌与金黄色葡萄球菌感染的奶牛子宫内膜组织上皮细胞和腺上皮细胞完全脱落、坏死、崩解;而DP₁受体激动剂、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌共同处理奶牛子宫内膜组织中,DP₁受体激动剂的加入显著减轻奶牛子宫内膜组织的损伤程度（P<0.05）。免疫组化染色法结果与以上两种方法结果一致。结果表明,PGD₂能够抑制大肠杆菌与金黄色葡萄球菌感染的奶牛子宫内膜组织中损伤相关因子HMGB-1、PAFR的表达,减轻组织损伤程度,这一作用可能是由DP₁受体所介导的。     

奶牛S100A12基因克隆、原核表达及体外抗菌活性分析

克隆奶牛S100A12基因并在大肠杆菌中高效表达.采用RT-PCR扩增奶牛外周血白细胞中S100A12基因,构建原核表达载体pCold TF-S100A12,在大肠杆菌BL21(DE3)中IPTG诱导表达并纯化.SDS-PAGE和Westernblotting分析显示S100A12基因以融合蛋白形式表达,表达量占菌体总蛋白的46.7％,纯化的重组蛋白(80 mg/L).琼脂扩散法测定重组蛋白对乳腺炎主要致病菌大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性.结果显示:重组蛋白对大肠杆菌有抗菌活性,而对金黄色葡萄球菌无抗菌活性.本研究为S100A12蛋白抗体制备及基因功能研究奠定了基础.     

大肠杆菌与金黄色葡萄球菌对奶牛子宫内膜组织细胞因子表达及损伤程度的影响

本试验旨在研究体外感染金黄色葡萄球菌与大肠杆菌对奶牛子宫内膜组织中细胞因子白介素-6(IL-6)、IL-1β和IL-8的表达及损伤程度的影响。以体外培养的奶牛子宫内膜组织作为研究对象,采用1×10~5～1×10~9 CFU/mL大肠杆菌与金黄色葡萄球菌对奶牛子宫内膜组织进行体外感染,通过实时荧光定量PCR和ELISA方法检测两种细菌刺激后奶牛子宫内膜组织中IL-6、IL-1β及IL-8 mRNA与蛋白的表达量,并用HE染色法观察两种细菌感染后奶牛子宫内膜组织病理学切片。结果显示,1×10~5～1×10~9 CFU/mL大肠杆菌体外感染后,奶牛子宫内膜组织中IL-6、IL-1β和IL-8 mRNA表达量均极显著高于空白对照组(P0.01);金黄色葡萄球菌感染浓度为1×10~5、1×10~6 CFU/mL时,IL-6、IL-1βmRNA表达量极显著高于空白对照组(P0.01),感染浓度为1×10~7 CFU/mL时,IL-6、IL-1βmRNA表达量显著高于空白对照组(P0.05),感染浓度为1×10~6 CFU/mL时,IL-8 mRNA表达量显著高于空白对照组(P0.05),其他感染浓度均与空白对照组无显著差异(P0.05)。奶牛子宫内膜组织感染1×10~5～1×10~9 CFU/mL金黄色葡萄球菌和大肠杆菌时,IL-6、IL-1β及IL-8蛋白表达量均极显著高于空白对照组(P0.01)。相同浓度的大肠杆菌感染奶牛子宫内膜组织后,IL-6、IL-1β及IL-8 mRNA与蛋白表达量均极显著高于金黄色葡萄球菌感染组(P0.01)。HE切片染色结果显示,大肠杆菌感染后仍有部分上皮细胞保留,而金黄色葡萄球菌感染后上皮细胞全部脱落。本试验结果表明,大肠杆菌与金黄色葡萄球菌感染奶牛子宫内膜组织后,引起的炎症反应不同。大肠杆菌感染后,促炎性细胞因子被显著上调,而金黄色葡萄球菌感染后破坏子宫内膜上皮细胞程度更加严重。     

大肠杆菌与金黄色葡萄球菌对奶牛子宫内膜组织细胞因子表达及损伤程度的影响

本试验旨在研究体外感染金黄色葡萄球菌与大肠杆菌对奶牛子宫内膜组织中细胞因子白介素-6（IL-6）、IL-1β和IL-8的表达及损伤程度的影响。以体外培养的奶牛子宫内膜组织作为研究对象,采用1×10⁵~1×10⁹ CFU/mL大肠杆菌与金黄色葡萄球菌对奶牛子宫内膜组织进行体外感染,通过实时荧光定量PCR和ELISA方法检测两种细菌刺激后奶牛子宫内膜组织中IL-6、IL-1β及IL-8 mRNA与蛋白的表达量,并用HE染色法观察两种细菌感染后奶牛子宫内膜组织病理学切片。结果显示,1×10⁵~1×10⁹ CFU/mL大肠杆菌体外感染后,奶牛子宫内膜组织中IL-6、IL-1β和IL-8 mRNA表达量均极显著高于空白对照组（P<0.01）;金黄色葡萄球菌感染浓度为1×10⁵、1×10⁶ CFU/mL时,IL-6、IL-1β mRNA表达量极显著高于空白对照组（P<0.01）,感染浓度为1×10⁷ CFU/mL时,IL-6、IL-1β mRNA表达量显著高于空白对照组（P<0.05）,感染浓度为1×10⁶ CFU/mL时,IL-8 mRNA表达量显著高于空白对照组（P<0.05）,其他感染浓度均与空白对照组无显著差异（P>0.05）。奶牛子宫内膜组织感染1×10⁵~1×10⁹ CFU/mL金黄色葡萄球菌和大肠杆菌时,IL-6、IL-1β及IL-8蛋白表达量均极显著高于空白对照组（P<0.01）。相同浓度的大肠杆菌感染奶牛子宫内膜组织后,IL-6、IL-1β及IL-8 mRNA与蛋白表达量均极显著高于金黄色葡萄球菌感染组（P<0.01）。HE切片染色结果显示,大肠杆菌感染后仍有部分上皮细胞保留,而金黄色葡萄球菌感染后上皮细胞全部脱落。本试验结果表明,大肠杆菌与金黄色葡萄球菌感染奶牛子宫内膜组织后,引起的炎症反应不同。大肠杆菌感染后,促炎性细胞因子被显著上调,而金黄色葡萄球菌感染后破坏子宫内膜上皮细胞程度更加严重。     

四川省凉山州健康奶牛粪便源细菌的分离及耐药性检测

为调查四川省凉山州健康奶牛肠道不同细菌的耐药情况,课题组成员从2013年起采集不同奶牛场健康奶牛粪便样本,按细菌常规分离、鉴定方法对粪便样本中的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和肠球菌进行了分离、纯化及鉴定,采用纸片扩散法测定各分离菌对不同抗菌药物的敏感性。结果表明:从198份粪便样本中共获得294株菌株,其中大肠杆菌138株、金黄色葡萄球菌51株、肠球菌105株;分离菌株中大肠杆菌、肠球菌对多数抗菌药物呈低水平耐药(耐药率低于30%);金黄色葡萄球菌则表现出较高的耐药性。说明凉山州健康奶牛胃肠道主要的共生菌(大肠杆菌、肠球菌)耐药情况不严重,但金黄色葡萄球菌的耐药状况比较严重,应加强对金黄色葡萄球菌耐药性监测,奶牛养殖业应谨慎使用抗菌药物。     

复方中药对奶牛子宫内膜炎主要病原菌体外抑菌试验的研究

奶牛子宫内膜炎是奶牛常发病,严重制约养殖业的发展。本试验选取化脓链球菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、乳房链球菌、金黄色葡萄球菌五种致病菌,对其进行体外抑菌试验。试管二倍稀释法试验结果表明：试验Ⅰ组对五种病原菌的抗菌活性较强,MIC及MBC达到8-64mg／ml,试验Ⅱ组对除金黄色葡萄球菌外的四种病原菌的抗菌活性也较强,MIC及MBC达到16～64gmg／ml。打孔法试验结果表明：试验Ⅰ组对蜡样芽孢杆菌为极敏效果,对大肠杆菌及乳房链球菌达高敏效果,对化脓链球菌及金黄色葡萄菌均为中敏效果;试验Ⅱ组对五种致病菌均为中敏效果。综合以上试验结果,筛选试验Ⅰ组进行下一步试验。     

中药复方宫炎净注射液的体外抑菌试验

为了研究中药复方宫炎净注射液对奶牛子宫内膜炎的抗炎治疗作用,试验选用针对导致奶牛子宫内膜炎的主要病原菌（大肠杆菌、沙门杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌）,采用琼脂平板扩散法研究中药复方宫炎净注射液的抑菌效果。结果表明：中药复方宫炎净注射液对大肠杆菌、沙门杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌高度敏感,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门杆菌的最小抑菌浓度（MIC）为0.160 9 mg/mL,而对链球菌的MIC为0.321 8 mg/mL。说明中药复方宫炎净注射液具有较强的抑菌作用,可用于临床治疗奶牛子宫内膜炎。     

牛气管抗菌肽的原核表达、体外抗菌活性及其组织分布分析

本文旨在对牛气管抗菌肽(tracheal antimicrobial peptide,TAP)基因进行原核表达,以及研究重组蛋白的抗菌活性,并分析TAP在各组织的表达分布情况,为开展转TAP基因抗乳腺炎奶牛研究提供技术资料。作者采用RT-PCR从荷斯坦奶牛气管扩增TAP基因,分析其序列后根据大肠杆菌表达系统对密码子的偏好性,人工合成牛TAP基因,构建pET32a(+)-TAP重组质粒;然后转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达并纯化。对表达蛋白进行SDS-PAGE、Western Blot鉴定;在线软件分析目的蛋白表达量。采用滤纸片法测定重组牛TAP的体外抗菌活性,并用RT-PCR法分析牛各组织中TAP表达情况。测序结果表明,扩增到114bp目的基因片段,可编码含38个氨基酸残基的成熟蛋白。SDS-PAGE分析表达的融合蛋白相对分子质量为24ku,重组蛋白以可溶性方式存在,表达量占菌体总蛋白的52.1%。Western Blot检测只出现单一条带。抗菌效价分析表明0.115μg·μL-1重组蛋白对牛源金黄色葡萄球菌有一定的抗菌活性。TAP基因在奶牛咽喉、肺、气管、小肠、肝、心脏及口腔黏膜中均有表达,在鼻黏膜和舌黏膜中微量表达,在皮肤中几乎不表达。作者成功表达了牛TAP基因,重组牛TAP蛋白在大肠杆菌中实现高效表达,并具有一定的抗奶牛乳腺炎致病菌的活性,为未来培育抗乳腺炎转基因奶牛及相关基因工程产品的开发奠定了基础。     

溶菌酶对奶牛子宫内膜炎主要病原的体外药敏试验

选取从患有子宫内膜炎奶牛的子宫黏液中分离出的主要病原菌金黄色葡萄球菌37株、链球菌30株、大肠埃希氏菌12株和化脓棒状杆菌22株,在体外用溶菌酶、庆大霉素、氨苄西林和头孢唑啉按照微量肉汤稀释法进行药敏试验。结果表明,溶菌酶对奶牛子宫内膜炎分离的金黄色葡萄球菌和链球菌具有良好的抗菌活性,对化脓棒状杆菌具有一定的抑杀作用,对大肠埃希氏菌作用较弱;氨苄西林则均产生了大量的耐药菌株,而溶菌酶对庆大霉素、氨苄西林和头孢唑啉耐药菌株同样具有较好的抑杀效果。     

抗菌肽的基因克隆表达及其在畜牧业中的应用前景

抗菌肽是具有抗菌活性的一类短肽,具有分子量低、热稳定、广谱的抗菌、抗病毒及抑制肿瘤的生物活性,是动物防御体系的一个重要组成部分,在机体抵抗病原的入侵方面起着重要的作用。本文主要综述了抗菌肽基因的克隆与表达的研究进展并展望了抗菌肽在畜牧业生产中的应用前景。     

多黏类芽孢杆菌抗菌肽的分离纯化及特性研究

试验旨在分离纯化多黏类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）BLCC1-0402代谢产物中的抗菌肽,为抗菌肽制备及其制品检测提供参考。采用离心、不同分子质量卷式膜超滤浓缩、Superdex peptide 10/300GL凝胶过滤层析对多黏类芽孢杆菌发酵上清液进行逐级分离纯化,对不同时段的收集液做抑菌试验,以大肠杆菌O78标准菌株为指示菌,采用打孔法进行抑菌活性检测,比较评价分步层析效果,以Tricine-SDS-PAGE进行分子质量检测。结果显示,通过5和3 ku卷式膜超滤获得的3~5 ku组分蛋白质样品抗菌活性较强;对于3~5 ku组分经凝胶过滤层析分离纯化,纯化后的抗菌肽A3抑菌活性最强,经Tricine-SDS-PAGE小分子多肽电泳检测,已达到电泳纯,分子质量为4 ku;抑菌活性检测结果显示,该抗菌肽A3对大肠杆菌O78标准菌株具有较强的抑菌作用。同时,抗菌肽A3表现出较好的耐热性,90~100 ℃处理15 min,抑菌活性可保持在96%左右;具有较好的酸碱稳定性,在pH 2.0~9.0下,抑菌活性保持在90%以上;经胃蛋白酶作用后抗菌肽A3抑菌活性降低20%,胰蛋白酶作用后抗菌肽A3抑菌活性降低18%,蛋白酶K对抗菌肽A3的抑菌活性几乎无影响。本研究结果表明,分离得到的抗菌肽A3是一种对大肠杆菌O78具有抑菌活性的新型抗菌肽,具有一定的开发潜力,可为下一步抗菌肽的结构分析、理化特性分析等深入研究提供一定参考依据。     

鳄龟血液抗菌肽生物活性研究

为探讨鳄龟血液抗菌肽初提物的生物活性,采用纸片法和固体培养基连续稀释法对其进行抗菌效果检验,结果表明:分离纯化的血液抗菌肽对G-细菌和G+细菌均有不同程度的抑制或杀灭作用,但不同的微生物对其敏感性不同。其对致病性嗜水气单胞菌、葡萄球菌、枯草杆菌、蜡样芽孢杆菌和沙门氏菌的最小抑菌质量浓度分别为12.5,25,50,50,200μg/mL。鳄龟血液抗菌肽具有①耐热性:将其沸水浴5 min后仍然具有极强的抗菌活性,沸水浴10 min后其抗菌活性减弱;②耐酸性和不溶血性:pH值为6.0,5.0,4.0,2.5时,鳄龟血液抗菌肽对嗜水气单胞菌均有抑菌活性,当pH值下降至2.5时其抑菌圈最小。     

光滑爪蟾皮肤抗菌肽的分离纯化及活性检测

通过高效液相色谱法,对光滑爪蟾皮肤分泌物进行分离纯化,得到具有抗菌活性的光滑爪蟾皮肤抗菌肽。通过最小抑菌浓度（MIC）试验、溶血活性试验及癌细胞抑制试验,对其体外生物活性进行研究。结果表明,经过纯化得到2个纯度高且具有活性的抗菌肽（AMP1和AMP2）,质谱鉴定结果得出其相对分子质量分别为1 082.78和2237.34。MIC结果表明,AMP1对S.aureus ATCC25923、Escherichia coli ATCC25922的MIC值分别为23.63、8.71mg/L,对MRSA无抑菌作用。AMP2对S.aureus ATCC25923,Escherichia coli ATCC25922、MRSA的MIC值分别为4.94、10.7、86.6mg/L。溶血试验显示AMP1,AMP2具有极弱溶血活性,且对癌细胞SW480具有抑制作用。     

牛乳酪蛋白初级抗菌肽粉乳基料的制备

为制备抗菌活性较好的肽粉乳基料,以新鲜牛乳为原料提取酪蛋白,以酪蛋白酶解物对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为指标,从木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶中筛选出一种蛋白酶水解牛乳酪蛋白,并通过单因素试验和正交试验确定该酶水解牛乳酪蛋白优化水解条件。结果表明：木瓜蛋白酶水解牛乳酪蛋白,其酶解物对3种菌均有较好的抑制作用;优化水解工艺条件为：酶解温度50℃、酶解时间4.5h、加酶量4500U/g、pH5.5、底物质量浓度6g/100mL;牛乳酪蛋白酶解物及初级肽粉乳基料稳定性均较好。     

嗜驼璃眼蜱抗菌肽的电泳分析及抗菌活性研究

为探讨嗜驼璃眼蜱血淋巴中抗菌肽的电泳分析方法及其抗菌作用,从半饱血的嗜驼璃眼蜱雌蜱体内抽取血淋巴,用50mL／L的乙酸抽提,经AU—PAGE分析嗜驼璃眼蜱血淋巴中阳离子多肽成分,用电泳凝胶琼脂糖弥散法对各多肽进行抗菌活性的筛选。结果表明,嗜驼璃眼蜱血淋巴中阳离子多肽成分对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌均有很强的抗菌作用。AU—PAGE发现一电泳迁徙率明显高于溶菌酶的阳离子抗菌多肽。提示在嗜驼璃眼蜱的血淋巴中,存在与溶菌酶不同的抗菌多肽,可能是嗜驼璃眼蜱抵御感染的重要分子。AU—PAGE是一种较简单、快速、经济的分离纯化抗菌肽的方法。     

红茂草生物碱TLC检测技术的建立及抑菌活性研究

利用醇提法提取红茂草中生物碱,并对其进行TLC检测,建立红茂草生物碱TLC检测技术;用红茂草浓缩液对3种供试菌进行体外抑菌活性研究,测定其最小抑菌浓度（MIC）。结果以95%乙醇：冰乙酸：水：浓氨水（15：0.5：2.5：0.5）为展开系统,分离效果最好,斑点清晰;对供试菌MIC测定结果分别为：大肠埃希氏杆菌0.18mg/mL、金黄色葡萄球菌0.14mg/mL、粪肠球菌0.26mg/mL。红茂草具有明显的抑菌作用。TLC检测技术可作为红茂草提取物中生物碱质量控制方法,且该法重现性好、准确度高。     

绵羊抗菌肽GNLY基因多态性分析及合成多肽的生物学功能研究

试验旨在分析绵羊抗菌肽颗粒溶素（granulysin,GNLY）基因多态性,检测合成多肽的抑菌活性和抑制肿瘤细胞活性,明确绵羊抗菌肽GNLY的生物学功能。通过对GNLY基因RT-PCR产物进行测序,分析GNLY基因多态性,推导其氨基酸序列信息合成功能区多肽,利用径向扩散试验和MIC试验检测合成多肽对大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、金黄色葡萄球菌的抑制作用;利用MTT试验观察合成多肽对人食管癌细胞（EC109）、人肾癌细胞（X786-0）的抑制作用。结果发现,MIC试验中浓度>250 μg/mL的G16对大肠杆菌、葡萄球菌均有抑制作用;浓度 ≥ 7.82 μg/mL的GS16对大肠杆菌抑制作用明显,对沙门氏菌、葡萄球菌和金黄色葡萄球菌无明显抑制作用;62.5 μg/mL GC16对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用,其中对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑制作用较为明显;G22对4种细菌均无明显的抑制作用。MTT试验结果表明,合成多肽G16、GS16对癌细胞无抑制作用,G22和GC16对EC109、X786-0具有显著抑制作用,其中1 mg/mL G22和1 mg/mL GC16对EC109生长抑制率分别为88.21%和57.21%,对X786-0生长抑制率分别为96.37%和81.87%。研究显示,合成GNLY多肽对细菌和肿瘤细胞具有一定的抑制活性,本研究结果为绵羊抗菌肽作为候选抗菌药物的开发奠定了基础。     

Antibacterial activity of thionin Thi2.1 from Arabidopsis thaliana expressed by bovine endothelial cells against Staphylococcus aureus isolates from bovine mastitis

Bovine mastitis is mainly caused by Staphylococcus aureus and antimicrobial therapy, commonly used for its control, has resulted in an increase in the frequency of resistant staphylococci in recent years. Thus, alternative therapies are desirable and the antimicrobial peptides represent attractive control agents. In this work, we expressed the antimicrobial peptide thionin Thi2.1 cDNA from Arabidopsis thaliana in the bovine endothelial cell line BVE-E6E7 and evaluated its activity against bovine mastitis S. aureus isolates. A polyclonal population from BVE-E6E7 cells transfected with the pThi2.1 construct was obtained and thionin Thi2.1 expression was confirmed by RT-PCR. From this population, eight stably transfected cell clones were obtained and their conditioned media (CM) were evaluated against the S. aureus ATCC 27543 strain. Clones showed high antibacterial activity (>95%) relative to the activity of the polyclonal population. The C8 clone showed the highest antibacterial activity (>99%) and its CM was evaluated against eleven bovine mastitis S. aureus isolates. A 2.5microg aliquot of total protein from the C8 clone's CM inhibited the growth of S. aureus isolates (>40%) relative to the CM from BVE-E6E7 cells used as control. Growth inhibition of S. aureus isolates was dose-dependent, showing a total inhibition at concentrations higher than 3.12microg/ml. These results suggest that thionin Thi2.1 antimicrobial peptide could be use in the treatment of bovine mastitis.