木薯MebZIP2基因克隆及其功能分析

【目的】bZIP转录因子在植物生长发育、淀粉合成和非生物胁迫等方面发挥重要作用。克隆木薯MebZIP2基因并进行亚细胞定位、表达分析和酵母单杂交分析,为进一步研究MebZIP2基因的功能提供参考。【方法】从木薯SC205中扩增MebZIP2基因编码区（CDS）序列,对其进行生物信息学分析,并构建pNC-GreenSubN融合表达载体,通过农杆菌介导转染烟草表皮细胞,观察荧光信号以确定MebZIP2蛋白的亚细胞定位情况。在木薯不同组织和块根不同发育阶段分析MebZIP2基因表达特征,利用酵母单杂交研究其与淀粉合成基因启动子的互作情况。【结果】MebZIP2基因CDS序列长度为465 bp,编码154个氨基酸,蛋白分子量为17 891.35 Da,理论等电点为5.23,属于不稳定亲水性蛋白。MebZIP2含有bZIP保守结构域,其氨基酸序列与橡胶树bZIP蛋白的相似性最高,为74.22%。MebZIP2基因启动子区域含有光响应元件,赤霉素、水杨酸和茉莉酸等激素响应元件,以及胚乳表达和胁迫响应元件。MebZIP2蛋白亚细胞定位于细胞核和细胞膜。MebZIP2基因在根尖分生组织、须根、茎和块根...     

外源ABA对木薯叶片内源激素及淀粉合成相关基因的影响

在盆栽条件下,用外源脱落酸(Abscisic acid,ABA)处理块根形成期的木薯品种,测定处理及对照在不同时刻叶片中ABA等激素变化、ABA合成与失活以及淀粉合成途径关键基因的表达变化。结果表明:1)正常条件下木薯叶片内源ABA水平及ABA合成途径基因均存在明显的夜间低而白天较高的昼夜节律,ABA信号转导相关基因也表现出下午的高峰表达,它们与淀粉合成途径基因的夜间表达一般具有相反的趋势。2)ABA处理后,木薯叶片内源ABA含量迅速下降,与观察到的ABA合成途径基因表达下降与后期ABA失活基因激活表达相一致,同时发现细胞分裂素中的玉米素核苷(Zeatin riboside,ZR)和生长素(Indole acetic acid,IAA)水平发生改变,预示木薯具有迅速恢复ABA平衡态的机制,并且与其他类激素存在协同作用。3)与此同时,外源ABA处理明显抑制淀粉合成上游基因表达,特别是夜晚高峰期的表达,而对下游基因的抑制相对较小。说明这些基因及相关酶类不同程度受到ABA的调控;ABA明显倾向于调控淀粉合成上游相关基因;外源ABA处理改变了叶片临时淀粉合成速率。     

木薯内源细胞分裂素含量对块根淀粉积累的影响

[目的]探讨木薯内源细胞分裂素(CTK)含量与块根淀粉积累的关系,为高淀粉木薯品种选育及栽培提供理论依据.[方法]以低淀粉木薯品种华南124和高淀粉木薯品种辐选01为试材,测定不同生育时期木薯叶片、茎秆和块根中的CTK含量与淀粉积累量,并分析两者间的相关性.[结果]华南124叶片CTK含量呈先下降后缓慢上升的变化趋势,辐选01则与之相反,呈先上升后缓慢下降的变化趋势.两个品种茎秆、块根CTK含量及块根淀粉积累速率均呈先上升后下降的变化趋势,淀粉含量从苗期至成熟期逐渐上升.在淀粉积累的关键时期即块根膨大中期(9月15日),辐选01叶片、茎秆和块根的CTK含量及淀粉积累速率均大于华南124,且除茎秆CTK含量外其他指标均达差异显著水平(P<0.05),说明该时期是形成高、低淀粉木薯品种淀粉含量差异的主要时期.相关性分析结果表明,华南124和辐选01块根CTK含量与淀粉积累量呈极显著正相关(P<0.01,下同),相关系数分别为0.58和0.60;华南124茎秆CTK含量和辐选01叶片CTK含量与其块根淀粉积累量呈极显著负相关,相关系数分别为-0.66和-0.75.[结论]木薯块根CTK含量对淀粉的积累起促进作用,而茎秆CTK和叶片CTK含量分别对低淀粉和高淀粉木薯品种的淀粉积累呈极显著的负向调节作用.     

木薯PYL13基因克隆及表达分析

[目的]解析木薯脱落酸(ABA)受体PYR/PYL/RCARs家族基因(MePYL13)在木薯块根采后生理性变质(PPD)过程中的功能作用,为后续探索ABA信号通路在木薯PPD中的功能及作物抗逆育种打下基础.[方法]从木薯品种SC8中克隆MePYL13基因,应用生物信息学分析方法对其编码蛋白的理化性质、亲疏水性、保守结构域及二、三级结构等进行预测,对基因上游启动子进行元件分析,通过亚细胞定位观察MePYL13蛋白在植物细胞中的定位情况,并利用实时荧光定量PCR检测MePYL13基因在木薯PPD过程中的相对表达量.[结果]克隆获得的MePYL13基因编码区(CDS)长度663 bp,编码220个氨基酸,蛋白分子量23.957kD,理论等电点(Ip)为6.74.MePYL13蛋白与巴西橡胶树(XP 021654464.1)PYL家族蛋白的氨基酸序列同源性最高,为91.55%,表明MePYL13蛋白氨基酸序列具有高度保守性.从MePYL13基因启动子鉴定获得与非生物胁迫逆境相关的响应元件,包括厌氧诱导元件(ARE,AAACCA)、光响应元件(ATCT-motif,AATCTAATCC)、干旱MYB元件(MBS,TAACTG)及ABA应答元件(ABRE,AAACAGA)和分生组织表达相关元件(CAT-box,GCCACT)等;MePYL13蛋白在木薯细胞的细胞核和细胞质上均有表达.随着PPD进程的推移,MeP YL13基因相对表达量整体上呈上升趋势,至PPD后期(48 h)其相对表达量是0h时(PPD前)的16倍,即MePYL13基因受木薯块根PPD的显著诱导.[结论]MePYL13基因是PYR/PYL/RCARs家族成员,可能在木薯块根PPD过程中发挥正向调控作用,为培育木薯PPD改良品种提供了潜在基因资源.     

木薯MeHSF7基因克隆及表达分析

[目的]克隆木薯热激转录因子(HSF)基因MeHSF7并分析其在抗逆响应和采后生理性变质(PPD)过程中的表达情况,为研究MeHSF7基因在响应干旱胁迫及延缓生理性变质的调控机制提供理论参考.[方法]通过同源克隆从木薯叶片克隆MeHSF7基因,对其生物信息学和组织表达特性进行分析,并明确其在干旱和脱落酸(ABA)处理下及PPD过程中的表达模式.[结果]克隆获得的MeHSF7基因开放阅读框(ORF)为1206 bp,编码401个氨基酸残基,与参考序列(Manes.02G087400.1)仅存在2个碱基差异,位于第2染色体上,含有1个内含子和2个外显子.MeHSF7蛋白理论分子量46.1 kD,理论等电点(pI)5.95,为不稳定蛋白,定位于细胞核,无跨膜区域,含有HSF蛋白的保守结构域DBD(DNA结合功能域)、HR-A Core和HR-B Core,属于HSFA亚家族,与橡胶树和麻疯树HSF蛋白的氨基酸序列同源性最高,分别为79.20%和64.95%,在系统发育进化树上与橡胶树HSF蛋白聚在同一小分支,表明二者亲缘关系较近.MeHSF7基因在不同组织中的表达量均较低,但不同组织间存在明显差异,在松散性胚性愈伤组织、分化胚组织、须根和根顶端分生组织中的表达量相对较高,在叶柄中的表达水平最低.MeHSF7基因启动子区域含有ABA响应元件(ABRE)、干旱诱导元件(MBS)和光响应元件(ACE、Box 4)等.干旱处理下,MeHSF7基因表达量随处理时间的增加整体上呈升高趋势,在处理7 d后达峰值;在ABA处理下,处理5和7 d后MeHSF7基因表达量较处理0和3 d后明显上调,尤其在处理5 d后达峰值,表明MeHSF7基因表达受干旱和ABA处理的诱导.在木薯块根的PPD过程中,MeHSF7基因表达量随暗培养时间的增加而升高,处理6、12和48 h的表达量分别是处理0 h的2.1、2.2和3.2倍.[结论]MeHSF7基因可能在转录水平通过依赖于ABA信号通路的途径响应干旱胁迫及木薯块根的氧化胁迫,可作为候选基因用于研究其在木薯抗逆和采后储存中的调控功能.     

淀粉含量不同木薯品种内源IAA与淀粉合成关键酶活性

以低淀粉木薯品种华南124及高淀粉品种辐选01为材料,研究木薯各生育时期叶片、茎秆和块根的内源IAA含量,块根淀粉合成关键酶ADPGpase、SSS和SBE活性,以及块根淀粉含量的变化。结果表明:1)木薯茎叶内源IAA含量与块根ADPGpase、SSS和SBE活性呈负相关,木薯生育后期高淀粉品种茎叶内源IAA含量逐渐下降,低淀粉品种则逐渐上升;2)块根内源IAA含量与块根ADPGpase、SSS和SBE活性呈显著正相关,生育后期高淀粉品种块根内源IAA含量显著大于低淀粉品种;3)块根ADPGpase、SSS和SBE活性与块根淀粉含量呈极显著正相关,生育后期高淀粉品种块根ADPGpase、SSS和SBE活性均显著高于低淀粉品种。可见,提高块根内源IAA含量有利于增加木薯块根淀粉合成关键酶活性,从而有效促进木薯块根淀粉的积累。     

木薯叶片可溶性糖含量与块根淀粉积累的关系

试验以辐选01,华南5号(SC5),新选048,新选056,南洋红(SC201),华南205(SC205),GR891,华南124(SC124)为材料,分别在块根形成期、块根膨大期和工艺成熟期测定叶片可溶性糖含量和块根淀粉含量,探讨木薯叶片可溶性含量与块根淀粉积累的关系。结果表明,从块根形成期到工艺成熟期,叶片可溶性总糖含量与块根淀粉积累都逐渐增加,叶片可溶性总糖含量与块根淀粉积累呈正相关,从块根膨大期到工艺成熟期,叶片还原糖含量逐浙增加,与块根淀粉积累呈正相关,而叶片蔗糖含量逐浙降低。与块根淀粉积累呈负相关。8个品种都有同样的趋势。     

木薯淀粉分支酶基因MeSBE2.2的克隆和表达分析

为了明确淀粉分支酶(SBE)在木薯淀粉合成中的功能,利用RT-PCR方法克隆得到了MeSBE2.2序列,并通过实时定量PCR(Q-PCR)分析其转录特点。结果表明,MeSBE2.2全长2 053bp,编码616个氨基酸,其编码蛋白质序列与蓖麻SBEII氨基酸序列的同源性最高,为91%。研究其转录特点发现:MeSBE2.2在块根和叶片中的表达模式有品种间差异性;器官特异性表达分析结果表明,MeSBE2.2主要在木薯块根中柱中表达;于3个不同生长时期的表达分析发现,MeSBE2.2在块根中表达平稳,在叶片中其表达量随植株生长呈显著下降趋势。本研究结果为进一步研究SBE家族在木薯块根淀粉合成中的功能提供了重要依据。     

苹果bZIP转录因子家族生物信息学分析及其在休眠芽中的表达

【目的】鉴定苹果（Malus×domestica Borkh.）基因组上的bZIP基因（MdbZIP）,为研究苹果bZIP转录因子提供相关信息以及在芽休眠过程中的调控作用提供理论参考。【方法】通过Pfam下载bZIP隐马尔科夫模型bZIP_1（PF00170）与bZIP_2（PF07716）,利用HMMER 3.0鉴定苹果bZIP基因。使用Clustal Omega、MEGA6.0、MapInspect、DNAMAN 6.0和MEME4.10.2等软件对其蛋白序列进行生物信息学分析。采用Microarray分析与qRT-PCR技术检测苹果bZIP基因在不同处理下及其在高需冷量品种与低需冷量品种中的表达情况。【结果】鉴定得到120个苹果bZIP基因,与拟南芥的系统进化树分析将苹果bZIP分为10个亚家族（A-I和S）。染色体定位分析显示,109个苹果bZIP不均匀分布于17条染色体上,其中,11个基因无匹配的染色体定位。8号染色体上分布最多（13个）,1号染色体分布最少（1个）,一些染色体区域基因密度较高。基因结构分析表明,MdbZIP基因家族外显子数量0-23个,其中23个基因无内含子,分布于F亚家族（4）与S亚家族（19）,基因结构进化高度保守。保守元件分析表明,MdbZIP基因家族包含30个保守元件：元件1为bZIP保守结构域;在D亚家族发现的元件10与G亚家族发现的14为已知元件,另外多数元件功能未知。通过Microarray分析显示,多个MdbZIP均可能与芽休眠的解除相关。qRT-PCR结果显示在不同品种中A亚家族8个MdbZIP均呈现出ABA诱导表达,而D亚家族中随着冷处理时间延长,在需冷量不同的品种中出现多种表达模式。【结论】苹果bZIP基因家族结构高度保守,在ABA与冷处理下呈现不同表达模式,可能参与调控苹果芽休眠进程。     

不同木薯品种叶片碳氮代谢与块根淀粉积累特性研究

以木薯高淀粉品种GR891、南植199(nanzhil99)和低淀粉品种南洋红(SC201)为材料,分别在块根形成期、块根膨大期和工艺成熟期测定叶片碳氮代谢有关指标和块根淀粉含量,探讨木薯叶片碳氮代谢与块根淀粉积累的关系.结果表明,块根淀粉含量与叶片谷氨酰胺合成酶(GS)活性、叶片蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性、叶片磷酸合成酶(SS)活性、叶片可溶性糖含量呈正相关关系且与叶片磷酸合成酶(SS)活性达到显著水平,与叶片硝酸还原酶(NR)活性呈负相关但不显著.块根淀粉含量与叶片蔗糖含量、叶片可溶性蛋白含量、叶片氨基酸含量呈极显著负相关关系.但高淀粉木薯品种在生育后期代谢活性下降缓慢,显示出源端较强的同化物持续供应能力,各品种表现出相同的规律.     

野生和栽培木薯叶片的营养及饲料价值研究

[目的]研究不同木薯种质叶片的营养成分差异,为木薯叶作为饲料资源开发利用提供参考.[方法]测定8个木薯种质(3个野生种和5个栽培种)功能叶片的粗脂肪、粗蛋白、可溶性糖、淀粉、类胡萝卜素和氢氰酸(HCN)含量,并利用Western blotting测定功能叶片相关蛋白酶(UGPase、AGPase、GBSSI和Linamarase)的表达水平.[结果]8个木薯种质中,野生种Manihotcecropiaefolia Phhl功能叶片的淀粉、可溶性糖和类胡萝卜含量最高,分别为2.5 g/100 gDW、30.0 g/100 gDW和91.9 mg/100 gFW,蛋白质和HCN含量中等;栽培种SC9功能叶片蛋白质和可溶性糖含量中等,HCN含量最低,仅167 mg/kgFW.Western blotting分析结果表明,M.cecropiaefoliaPhhl叶片糖和淀粉代谢通路的关键酶UGPase、AGPase和GBSSI表达水平最高,SC9 HCN代谢通路的关键酶Linamarase表达水平最低,各蛋白质表达水平与相关生理指标变化趋势一致.通过主成分分析结果可看出,叶片淀粉和可溶性糖含量较高的木薯种质,粗脂肪含量较低;可溶性糖、粗蛋白和类胡萝卜素含量较高的木薯种质,HCN含量较低.[结论]野生木薯M.cecropiaefolia Phhl完全展开功能叶片的综合营养价值较高,可考虑作为畜禽和蚕用饲料资源开发利用;栽培种木薯SC9新鲜叶片HCN含量较低,也可优先作为蚕用饲料.     

桃PpNCED家族成员鉴定与表达特性分析

为探明不同NCED基因家族成员在桃果实成熟软化期间的表达特性,在桃基因组中鉴定出7个NCED成员。利用qRT-PCR的方法,检测出NCED成员的表达存在组织特异性。在不同耐贮性桃品种中, PpNCED2、 PpNCED3、 PpNCED4、 PpNCED5均表现出随着果实的膨大和成熟呈上调表达趋势,且在果实成熟期达到表达高峰。此外,外源ABA处理后,在贮藏早期显著促进PpNCED家族成员的表达,而在贮藏中后期显著抑制其表达。以上试验结果表明, PpNCED2、 PpNCED3、 PpNCED4、 PpNCED5可能参与桃果实成熟软化的调控,但因不同桃品种存在差异。     

Annotation and validation of genes involved in photosynthesis and starch synthesis from a Manihot full-length cDNA library

A full-length cDNA library from leaf and root tissues of cassava (Manihot esculenta) Arg7 and one accession of its wild ancestor W14 (M. esculenta ssp. flabellifolia) has been constructed. The library is comprised of four sub-libraries, containing 32640 recombinant clones, 6028 cDNA clones from their 5′ ends, and 128 clones from the 3′ ends were sequenced. In total, 5013 high-quality expressed sequence tags (ESTs) and 1259 unigenes were obtained. Of these, 746 unigenes were identified by their sequence homologies to ESTs from model plants, and 323 unigenes were mapped onto 114 different KEGG pathways. From these, 24 differentially expressed genes involved in starch metabolism and photosynthesis were identified and five of them were selected to compare their expression level between Arg7 and W14. Notably, Arg7 has a higher net photosynthesis rate in leaves, higher ribulose-1,5-bisphosphate carboxy-lase oxygenase activities in leaves, and higher AGPase activity in roots. This resource is the first EST collection from wild cassava and should be of value for gene discovery, genome annotation and studies of Manihot evolution.     

部分蔷薇和现代月季杂交亲和性

为丰富国内自育品种并解决现代月季夏季病害严重开花不良的问题,2011-2012年对蔷薇与月季品种杂交、杂种香水月季品种间杂交及不同类型月季品种间的63个组合的杂交进行研究,分析不同组合结实情况,发现杂种香水月季品种间杂交亲本亲和性较好,而蔷薇与月季品种的杂交亲和性较差。同时通过对38个组合的坐果情况跟踪观察,得出杂交果落果规律,月季杂交的落果时期主要出现在授粉后1月内及授粉3个月后。从亲和性分析这些组合的落果情况,同一类型品种间杂交果实严重落果期集中于果实成熟后期(授粉3个月后),而另外2类组合严重落果期在前(授粉1个月内)、后期(授粉3个月后)均有分布,与结实情况表现的亲和性一致。     

木薯主要农艺性状的遗传变异、相关性和主成分分析

对广西14个主要木薯品种的9个农艺性状进行了遗传变异分析、相关性分析和主成分分析。结果表明,块根长,块根鲜重、块根数的变异系数较大,分别为13.95%、11.33%、10.22%,块根干物质率和茎径的变异系数最小,分别为7.00%和6.57%;在相关性上,产量与块根数呈极显著的正相关,块根干物质率与块根淀粉含量呈极显著的正相关;主成分分析结果表明,前4个主成分对变异的贡献率达85.69%。在性状选择上,首先对变异大的性状进行选择是非常重要的。在品种选择时,应注意选择产量和淀粉含量均高的品种。     

木薯不同品种(系)生物积累量特性及其与淀粉积累关键基因表达相关性研究

以11个木薯品种(系)(SC205、SC5、SC8、Arg7、Rayong9、KU50、9I、R3、17Q、FB-1、FB-4)为材料,采用田间统计分析,实时定量PCR和皮尔森相关分析,对不同木薯品种(系)的生物积累量特性、淀粉积累关键基因的表达及两者之间的相关性进行分析。结果表明,品种(系)间在叶绿素含量、净光合速率、干物质积累率及相关途径重要基因表达水平上均存在显著差异。其中:块根产量高的品种或品系FB-1、SC5、SC8、KU50、SC205、Rayong9在块根成熟期保持较高的干物质积累量;而对于叶片叶绿素含量和净光合速率,SC205保持最高,品种(系)间存在差异(P0.05),但与产量没有明显相关性;块根膨大期叶片净光合速率最高,且与叶绿素含量呈显著正相关。基因表达与产量性状的相关分析表明,块根形成期MeAGPS1的表达量及块根形成期和膨大期MeGBSS1的表达量与块根膨大期木薯块根的干物质率呈显著正相关,块根成熟期MeSBE2.2的表达量与块根成熟期木薯块根的干物质率呈显著正相关。     

NaCl胁迫下宁夏枸杞ABA代谢相关基因差异表达分析

为解析宁夏枸杞响应NaCl胁迫的ABA代谢分子调控机制,检测NaCl胁迫下宁夏枸杞叶片脱落酸（ABA）含量变化,并利用RNA-seq和qRT-PCR技术研究NaCl胁迫下ABA代谢相关基因的差异表达规律。结果表明,不同浓度NaCl胁迫下,宁夏枸杞叶片中ABA含量随NaCl浓度的增加呈现增加趋势;通过转录组测序筛选得到21个ABA代谢相关的差异表达基因,从100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L NaCl处理下的宁夏枸杞叶片中检测到ABA代谢相关的差异表达基因分别有17、11、9个,qRT-PCR检测结果与转录组测序结果基本一致。宁夏枸杞通过相关基因的差异表达调控ABA代谢和信号通路,从而参与调控其响应NaCl胁迫。     

2种石蒜花芽分化与碳水化合物、抗氧化物酶及内源激素变化的关系

为明确石蒜属植物生长发育过程中的生理生化变化,以忽地笑(Lycoris aurea)、中国石蒜(Lycoris chinensis)的中层鳞片为供试材料,测定了碳水化合物含量、抗氧化物酶活性及内源激素含量,并利用主成分分析法评价了这2种石蒜的生长发育模型。结果表明,2种石蒜中部鳞片的可溶性糖含量、GA₃、ZR、IAA在叶枯期较高且保持上升趋势,花芽分化期降至峰谷后回升;淀粉含量、SOD、POD、CAT、PAL活性、ABA含量在叶期较低,花芽分化期增加并处于相对较高水平,花期一般下降。根据主成分分析得出：影响忽地笑生长发育较大的指标为PAL、POD、SOD和IAA;影响中国石蒜生长发育较大的指标为PAL、淀粉含量、SOD、POD和ABA。根据结果可以看出,高浓度的淀粉含量、SOD、CAT、PAL、POD及ABA,较低水平的可溶性糖含量、ZR、GA₃和IAA,有利于2种石蒜花芽分化。2种生长节律差别较大的石蒜,各生理指标的变化趋势相似,各生理指标对花的影响较大,对叶的影响相对较小。本研究为石蒜属植物的花芽分化研究奠定了基础,为石蒜属植物的杂交育种及花期调控提供理论依据。