水稻条纹病毒编码蛋白在灰飞虱体内的检测及其与CP体外结合研究

 【目的】检测灰飞虱体内由水稻条纹病毒（RSV）编码的外壳蛋白（CP）、病害特异性蛋白（SP）,以及非结构蛋白NS2、NS3和NSvc4等5种蛋白以及病毒粒子CP与SP、NS2、NS3、NSvc4的体外结合,为进一步研究水稻条纹病毒与其介体昆虫互作提供有用信息。【方法】提取高带毒灰飞虱（Q家系）总蛋白,用免疫方法检测昆虫体内CP、SP、NS2、NS3和NSvc4等5种重要蛋白的表达以及病毒粒子CP与SP、NS2、NS3、NSvc4的体外结合情况。【结果】结果表明在带毒灰飞虱体内以上5种蛋白都能检测到,而且CP含量最高,NSvc4、SP、NS3、NS2含量依次降低;用体外原核表达后纯化的蛋白进行了RSV粒子CP与SP、NS2、NS3、NSvc4的体外结合实验,实验结果表明病毒粒子CP与SP、NSvc4之间存在体外结合关系。【结论】检测结果为灰飞虱作为RSV的昆虫寄主并且可以在其体内增殖的结论提供了支持,表达差异表明病毒编码蛋白在介体灰飞虱体内可能存在着一定的协调关系;病毒粒子与SP的结合为前人关于CP与SP可能共同作用于叶绿体进而影响症状的严重度的报道又提供了一个新的证据,病毒粒子与NSvc4之间存在体外结合关系,也为NSvc4可能作为运动蛋白通过与CP的互作以及诱导病毒在胞间运动需要CP的辅助提供了佐证。     

东港市水稻条纹叶枯病发生规律及综合防治措施初探

水稻条纹叶枯病是由条纹叶枯病毒（Rice Stripe Virus简称RSV）而引起。RSV是一种单链RNA病毒,其主要寄主和传毒介质是灰飞虱,其次还有白背飞虱和白带飞虱等,即条纹叶枯病由灰飞虱传播的病毒所致的病毒病。灰飞虱寄主有水稻、小麦、大麦、谷、玉米等37种禾本科植物,灰飞虱对RSV病毒传播方式是循回增殖型传播。一旦染毒可持续传播,并由雌虫经卵传给下一代。     

利用酵母双杂交技术筛选介体灰飞虱中与水稻条纹病毒病害特异蛋白互作的蛋白质

【目的】筛选介体灰飞虱（Laodelphax striatellus,SBPH）中与水稻条纹病毒（RSV）病害特异蛋白（disease-specific protein,SP）可能发生相互作用的蛋白质,为明确介体灰飞虱传播RSV的分子机制及SP在传毒过程中的作用打下基础。【方法】提取高质量灰飞虱总RNA并通过TaKaRa D9086 OligtexTM-dT30 mRNA Purification Kit对mRNA进行纯化。利用SMART技术合成双链cDNA,利用Axygen的PCR纯化回收试剂盒将ds cDNA回收纯化,纯化后的ds cDNA再经SfiⅠ限制性内切酶处理纯化后与文库载体pPR3-N相连接以构建高质量灰飞虱cDNA文库,通过电转化的方法对灰飞虱cDNA文库进行扩增并进行cDNA文库质量和滴度检测。设计带有SfiⅠ酶切位点的引物以扩增得到目的基因即RSV SP。将带有酶切位点的SP基因序列连接到载体pDHB1上构成诱饵载体pDHB1-SP。将诱饵载体pDHB1-SP转化酵母菌NMY51中并提取总蛋白,通过Western Blot方法检测诱饵载体上的目的基因SP是否表达,并通过功能验证试验验证诱饵载体是否适合本研究采用的分裂泛素酵母双杂交系统。确定构建的诱饵载体适合本系统后,用诱饵载体与文库质粒pPR3-N共转化到酵母菌NMY51中以优化cDNA文库筛选条件并明确3-AT浓度。对灰飞虱cDNA文库进行筛选并对筛选结果进行分析,对筛选出来的蛋白进行体内试验以进一步验证是否发生互作。【结果】提取到高质量的灰飞虱总RNA,通过SMART技术合成的ds cDNA大小介于0.1-4.5 kb。构建的灰飞虱cDNA文库的库容量超过1.2×106 cfu,文库滴度为1.12×108 cfu/mL,扩增文库插入片段平均长度大于1.5 kb。载体酶切验证表明诱饵载体pDHB1-SP成功构建;Western Blot结果表明诱饵载体pDHB1-SP能够在NMY51中正常表达;功能验证表明诱饵载体pDHB1-SP适合该系统。在3-AT浓度为20 mmol?L-1的筛选条件下从构建的高质量的灰飞虱cDNA文库中筛选得到534个克隆,经测序、Blast比对最终得到76个可能与RSV的SP发生互作的灰飞虱蛋白质。根据SP在灰飞虱体内的亚细胞定位结果以及通过gene ontology(GO)对蛋白质的功能分析,挑选出20个蛋白质进行共转和β-galactosidase检测,结果表明这20个蛋白质均与RSV SP互作。【结论】通过构建高质量灰飞虱cDNA文库及酵母双杂交技术,筛选出了与RSV SP互作的蛋白质,为明确介体灰飞虱传播RSV的分子机制,及RSV的SP在传毒过程中的功能打下了基础。     

灰飞虱体内水稻条纹病毒基因的RNA干扰效应

【目的】探讨利用RNA干扰技术切断灰飞虱体内水稻条纹病毒（Rice stripe virus,RSV）繁殖的可行性,研究RSV病毒不同基因间的互作关系。【方法】利用喂食的方法测定体外合成的dsRNA对灰飞虱体内RSV基因表达的抑制作用。根据RSV基因序列设计并合成3种dsRNA（dsRdRp、dsNSvc4和dsCP）,分别喂食携带RSV病毒的2龄灰飞虱,96 h后利用荧光定量PCR技术同时检测灰飞虱体内RSV病毒不同基因RdRp、NSvc4和CP的表达量。【结果】经过特异性dsRNA喂食处理的灰飞虱体内RSV病毒靶基因NSvc4、CP的表达量大幅下调,下调幅度分别为93.2%和94.9%;靶基因RdRp表达量下调幅度为45.6%。dsRNA喂食处理对其它非靶标RSV基因的表达均具有一定的下调作用,表明RSV病毒不同基因RdRp、NSvc4和CP间可能存在互作关系。【结论】本研究为利用转dsRNA工程微生物或转基因水稻进行RSV病毒的防治提供了重要依据。     

水稻条纹病毒外壳蛋白自身互作的活性区段研究

水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)的外壳蛋白(coat protein,CP)参与病毒转录、复制等多个生物学过程。病毒蛋白之间的互作对病毒侵染活性非常重要,在明确RSV外壳蛋白CP能够自身互作的基础上,通过构建CP蛋白N端、M区段和C端(CP-N、CP-M和CP-C)的酵母表达载体,利用酵母双杂交系统确定外壳蛋白CP自身互作的活性区段。结果表明,N端和C端第1~81个氨基酸是参与水稻条纹病毒CP蛋白自身互作的活性区段。这一研究结果不仅有助于加深理解RSV CP蛋白在病毒基因组稳定、复制过程中的作用,也有助于加深了解RSV、寄主和传播介体之间关系。     

单头灰飞虱体内两种水稻病毒的双重一步法RT PCR检测

灰飞虱传播的水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)和水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus, RBSDV)是危害我国水稻生产最主要的2种病毒,建立灰飞虱体内RSV和RBSDV快速、可靠的检测方法是水稻生产中的重要问题。本研究根据RSV RNA3和RBSDV S10序列分别设计了2个病毒的特异性引物,通过退火温度和PCR循环数等条件的优化,建立了灰飞虱体内RSV和RBSDV快速鉴定的双重一步法RT PCR体系。对一步法和两步法RT PCR检测结果进行比较,表明2种方法均能准确有效鉴定灰飞虱体内的2种病毒,且两步法的检测效果略好于一步法。而灵敏度实验表明一步法RT PCR可以从0005 ng·μL-1的灰飞虱RNA初始模板中准确检测到病毒,完全满足单头灰飞虱体内病毒检测的需要。应用本研究建立的双重一步法RT PCR体系对200头获毒灰飞虱样品中的RSV和RBSDV进行了检测,结果进一步证实了此方法的稳定性和可靠性。     

水稻条纹叶枯病的研究 Ⅲ.病害的病原性质

水稻条纹叶枯病系由水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)所致.病毒由灰飞虱(Laodelphax striatellus)以持久性方式并经卵传播,介体灰飞虱有明显的间歇传毒现象.提纯病毒制剂具有典型的核蛋白紫外吸收曲线,最大吸收260nm,最小吸收245nm,A260/280=1.54.病毒粒体长丝状,粒体直径约8nm,与日本的水稻条纹病毒抗血清呈阳性反应.将提纯病毒制剂免疫家兔制备抗血清,其效价可达1∶2048.采用该抗血清,通过免疫扩散和ELISA间接法反应,可很灵敏地检测病叶中的RSV.     

RSV和HiPV在灰飞虱中传播方式的比较与分析

水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)是由介体灰飞虱(Laodelphax striatellus)传播的重要水稻病毒,严重危害我国水稻生产。Himetobi P病毒(Hi PV)是广泛存在于灰飞虱体内的一类昆虫类微小核糖核酸病毒,灰飞虱感染Hi PV后无明显的致病表现。对Hi PV不同分离物及Cripavirus属多个病毒的序列同源性分析表明,Hi PV不同分离物之间相似度非常高,但和同属其他病毒的核苷酸及氨基酸序列均存在明显差异。对两种病毒在水稻中的复制情况进行检测,结果表明,RSV可在水稻中复制,Hi PV可在水稻中稳定存在一段时间(7 d),但无法在水稻中复制。进一步的试验表明,灰飞虱的分泌物中存在Hi PV,但无法检测到RSV。     

我国水稻条纹病毒致病性的分化与差异分析

以云南灰飞虱(Laodelphaxstriatellus)为介体昆虫,以4个水稻品种为寄主,通过人工接种对采自云南、江苏、河南、山东、安徽等省的水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)23个分离物进行传毒试验.致病性评价结果表明,23个分离物可划分为5个等级,即强致病型、次强致病型、中致病型、弱致病型、极弱致病型.致病性分化表现在地理差异、毒株差异及水稻品种差异三方面.不同分离物在寄主发病率、发病时间、症状表现以及对灰飞虱传毒效率等方面都存在差异.     

灰飞虱体内Wolbachia的感染与其携带水稻条纹病毒的相关性分析

使用斑点免疫结合试验(DIBA)和PCR法分别对灰飞虱体内水稻条纹病毒(rice stripe virus,RSV)和沃尔巴克氏体(Wolbachia)的感染特点进行研究。结果发现:灰飞虱体内广泛存在Wolbachia感染,但是灰飞虱体内Wolbachia的感染与其体内携带RSV的特点不存在明显的相关性,同时二者在经卵传播过程中也没有明显的相关性。这暗示了RSV和Wolbachia在灰飞虱体内虽然都可以垂直传播给下一代,但是二者在传播方式上或者在传播过程中可能是两个相对独立、相互间没有明显影响的过程。     

灰飞虱传水稻病毒病控害减灾技术的研究

近10多年来,水稻条纹叶枯病、黑条矮缩病相继在江苏盐城流行,为此,我们较全面、系统、深入调查研究了水稻条纹叶枯病、黑条矮缩病的灾变规律和防控技术。摸清了灰飞虱发生、传毒和病毒病的流行致灾规律,明确了一些水稻品种的抗耐病性,以及防虫网阻隔、适当迟播、耕翻灭茬等农业、物理措施在控制灰飞虱发生和传毒的作用,筛选出一批化学农药品种,为有效防治灰飞虱、预防病毒病提供了高效、低毒的对路药剂。集成一套适合本地现行种植方式,易于操作,可持续的灰飞虱传水稻病毒控害减灾技术,供各地借鉴参考。     

水稻条纹病毒楚雄分离物一个重组RNA序列分析

为检测水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)基因组存在的重组RNA,采用RT-PCR方法扩增并克隆云南楚雄分离物(YCX07)的RNA重组片段YCX07R.克隆重组片段并测定序列.序列分析表明,YCX07R由RSVRNA2的3''端序列与RNA3的3''端序列重组而成,具有RSV基因组结构特征,采取双义编码策略,即在正、负链的5''端分别存在一个阅读框,编码两个重组蛋白YCX07R-5P、YCX07R-3P.分析推测重组更可能通过类似于脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)的引物互补延伸机制发生.     

麦田灰飞虱种群空间分布型及抽样技术探讨

灰飞虱不仅直接为害水稻、大小麦,还是水稻条纹叶枯病、黑条矮缩病的主要媒介。了解灰飞虱在越冬作物大小麦田的分布特证和合适的抽样技术,可以为春季防治灰飞虱从而控制水稻病毒病的发生流行发挥重要作用。为此笔者进行了麦田灰飞虱种群分布调查,并采用扩散型指标法和Iwao回归法测定了浙江北部大小麦田灰飞虱的空间分布型。结果表明:麦田灰飞虱成虫、若虫和成若虫田间分布趋于聚集分布,其聚集原因主要是由灰飞虱生物学特性和环境因素引起的。根据空间分布型的参数,建立了理论抽样数模型为n_1=(1172.84/X) 37.46,n_2=(293.21/x) 9.36,n_3=(130.3/x) 4.16,适用于不同虫口密度下的田间抽样。在每样方虫口密度5、10和15头以上时,分别取样70、40和20个样方。研究结果为准确抽样调查和防治提供了科学依据。     

水稻条纹叶枯病病毒RT-PCR快速检测研究

水稻条纹叶枯病是由灰飞虱传播的病毒性病害,近年来对长江下游地区的水稻生产带来严重危害。根据水稻条纹叶枯病病毒基因组序列的信息,在其外壳蛋白基因和毒蛋白基因的两侧设计2对引物,对感染病毒的植物和正常未感染植株进行扩增,可以在感病植株中分别扩增出水稻条纹叶枯病病毒基因组特有的2个条带,而在正常植株中未能扩增相关的条带。这就建立了水稻条纹叶枯病病毒检测体系,还对建立条纹叶枯病病毒检测体系在该病预测预报中的作用进行了讨论。     

水稻锯齿叶矮缩病毒的检测及介体传毒特性

分别建立了水稻锯齿叶矮缩病毒(RRSV)病株的dsRNA基因组检测法和单头介体褐飞虱带毒的RT-PCR法,并结合生物学接种试验,对介体传毒特性进行了初步分析.结果显示:dsRNA基因组鉴定法可以从0.5 g病株样品中快速检测到RRSV,RT-PCR法可以灵敏地应用于褐飞虱带毒、传毒情况的检测;饲毒后褐飞虱成虫、若虫的带毒率分别为75.0%、68.2%,传毒率分别为50.0%、32.5%,说明褐飞虱种群传播RRSV的能力很强,是高度亲和的群体.     

Advances in the studies of Rice stripe virus

Rice stripe virus (RSV), the type member of the genus Tenuivirus, is one of the most economically important pathogens of rice and is repeatedly epidemic in China, Japan and Korea. The latest achievements of the studies on the biological functions of virus-encoded proteins, pathogenicity differentiation and genetic diversity of virus, virus-plant host interactions and management of virus were reviewed. The current problems encountered during studies and some approaches for further research were discussed.     

水稻条纹病毒安徽分离物NS3基因的克隆 及其RNA沉默抑制子功能的初步鉴定

采集安徽马鞍山水稻条纹叶枯病感病稻株,TRIzol法提取样本总RNA,设计特异性引物进行RT-PCR扩增,获得水稻条纹病毒（RSV）安徽分离物的RNA3部分片段,克隆并测序。序列分析表明,该片段全长874 nts,含有完整的NS3基因,NS3基因序列长度为636 nts,编码211个氨基酸。序列比对发现,RSV安徽分离物NS3基因与来源于华东各省市RSV分离物NS3基因间的序列相似性高达97.6%～99.4%,而与RSV云南分离物NS3基因间的序列相似性相对较低,为93.4%～95.4%。构建RSV NS3基因系统关系树,发现RSV安徽分离物NS3基因与来源于华东各省市8个RSV分离物NS3基因聚成一个单独的分支,说明华东各省市各个RSV分离物亲缘关系最近。将RSV安徽分离物NS3基因插入植物表达载体pBIN438,构建重组植物表达载体pBIN-NS3并转化农杆菌。将含pBIN-NS3的农杆菌和含pBIN-GFP的农杆菌共浸润16c本氏烟叶片,6天后紫外灯下观察发现,共浸润区表现出强烈的绿色荧光,说明16c本氏烟GFP基因局部沉默被抑制,可以初步证明RSV安徽分离物编码的NS3蛋白是一个RNA沉默抑制子。     

水稻矮缩病的分子生物学研究进展

水稻矮缩病(rice dwarf disease)的病原物为水稻矮缩病毒(Rice dwarf virus,RDV)。RDV由介体黑尾叶蝉以持久增殖型方式传播。该病害1883年在日本被发现,现主要流行于日本、朝鲜、中国等东南亚水稻产区,给水稻等粮食安全带来巨大威胁。本文就该病害的流行分布、病原和介体传毒特性、病毒编码的基因功能、病毒与寄主或介体互作、研究展望等方面作简要的介绍。