大丽轮枝菌致萎毒力指示菌的筛选及拮抗作用初探

为了筛选可指示Verticillium dahliae致萎毒素毒力大小的指示菌,并对致萎毒素抑制指示菌生长的机理进行初步探讨,采用指示菌平板打孔法,对黑曲霉(Aspergillus niger)BF-3758、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等12种具有微生物种属代表性的菌株进行筛选;采用拮抗试验、致萎试验结合显微观察的方法,初步探索了Verticillium dahliae致萎毒素对指示菌生长的抑制作用。结果表明,Verticillium dahliae粗毒素对Aspergillus niger BF-3758的生长具有较强的抑制作用,且该抑制作用和粗毒素对离体叶片的致萎作用具有一致性,并存在一定的量效关系,Aspergillusniger BF-3758菌株可以作为Verticillium dahliae致萎毒素的毒力指示菌;Verticillium dahliae粗毒素可抑制Aspergillus niger BF-3758的孢子萌发和菌丝生长,对成熟菌丝也有破坏作用。上述研究可为评价Verticillium dahliae的致病力提供一种操作简便、耗时短、费用低的生物学方法。     

棉花黄萎病拮抗细菌B.velezensis6-61拮抗蛋白发酵条件的优化

为了提高棉花黄萎病拮抗细菌B.velezensis 6-61活性物质的产量,为进一步开展6-61菌株的后续研究奠定基础,对6-61菌株产生的活性物质的性质进行了分析,并对其发酵条件进行了优化研究.采用有机溶剂萃取、硫酸铵沉淀对菌株6-61发酵液进行处理并检测抑茵活性,初步确定了该拮抗物质为蛋白质.采用单因素试验对6-6...     

一株棉花黄萎病拮抗芽孢细菌的分离鉴定及活性检测

 采用改良的琼脂平板扩散法,通过初筛和复筛,得到一株对棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）具有较强的抑菌活性的拮抗细菌Z-5菌株。通过对该菌株的形态特征观察、生理生化鉴定和16S rDNA的序列分析,确定拮抗细菌Z-5菌株为Bacillus malacitensis。盆栽实验表明Z-5菌株对大丽轮枝菌的防治效果达到76.05%,对棉花黄萎病具有明显的防治作用。     

大丽轮枝菌拮抗细菌菌株12-51的筛选鉴定与抗菌物性质分析

由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb）引起的棉花黄萎病,是一种危害严重的世界性病害。通过初筛和复筛得到了对棉花黄萎病具有较高拮抗活性的细菌菌株12-51,通过对其进行形态鉴定、生理生化特征鉴定和16S rDNA全序列分析,最终鉴定此菌株为Bacillus velezensis,16S rDNA序列相似度达99.74%。采用有机溶剂萃取和盐析法对发酵产物进行了提取,初步断定拮抗物质为蛋白类。通过对粗蛋白进行进一步研究发现,60%组分活性较高,并且对热以及酸碱敏感性较小。试验结果为棉花黄萎病的生物防治奠定了基础。     

一株大丽轮枝菌拮抗细菌7-47菌株的分离与鉴定

 从全国各地棉田采集土样,筛选对棉花黄萎病致病菌大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）具有拮抗作用的芽孢杆菌菌株。通过初筛得到具有拮抗作用的菌株68株,复筛选出1株拮抗活性较高的菌株7-47,并通过生理生化试验,形态特征的观察及16S rDNA的序列分析对其进行了鉴定,认为菌株7-47属于漠海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）。     

棉花黄萎病拮抗细菌LC-04菌株的抗菌蛋白产生条件研究

LC-04菌株是从棉花叶部组织中分离出的一株类芽孢杆菌,其发酵液上清液的硫酸铵沉淀物对大丽轮枝菌V-190菌株的生长具有明显的拮抗作用,实验证明发酵液中含有蛋白质类抗菌物质。LC-04菌株的适宜发酵条件为:在pH7的LBG培养基中于30℃,180 r.min-1摇床振荡培养48 h,用70%硫酸铵对LC-04菌株发酵液上清液进行盐析,可以沉淀最多的抗菌蛋白。     

棉花黄萎病拮抗细菌DS45-2菌株在土壤和棉花根内的定殖

通过盆栽试验,对棉花黄萎病拮抗细菌DS45-2菌株在土壤和棉花根际、根内的定殖情况进行了分析。结果表明,在自然条件下,拮抗细菌DS45-2菌株能够在土壤及棉花根际、根内定殖。拮抗菌株DS45-2施到土壤中后的45d内,其定殖数量在开始25d内显著下降,但随后下降缓慢并逐渐趋于稳定,维持在106个·g-1土左右。接菌后45d,DS45-2在棉花根内的定殖菌量达2.35×104个·g-1根,在棉花根际的定殖菌量达97.4×106个·g-1土,且重新分离出的拮抗菌株保持较高的拮抗活性。DS45-2菌株在灭菌土中的定殖数量高于自然土中的数量。随土层深度的增加,定殖菌量呈下降趋势,但变化不明显。     

大丽轮枝菌菌体对链霉菌胞外蛋白酶活性及抑菌效果的影响

 为研究拮抗链霉菌对棉花黄萎病原大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）的抑菌机理,以大丽轮枝菌菌体为唯一碳氮能源,采用液体培养法及生长速率法研究供试病原菌菌体对4株拮抗链霉菌胞外蛋白酶合成的诱导作用及抑菌活性物质产生的影响。结果表明：大丽轮枝菌菌体可以诱导供试链霉菌合成蛋白酶;诱导粗酶液对病原真菌菌丝有溶解作用;当菌体添加量为10 g·L^-1,28℃培养7 d时菌株Z13蛋白酶活性高达4.24 U;以大丽轮枝菌菌体为碳氮能源时供试链霉菌能产生活性较强的抑菌物质;当菌体添加量为20 g·L^-1,发酵液稀释5倍时菌株B49所产抑菌活性物质的最大抑菌率达95.7%。     

枯草芽孢杆菌NCD-2菌株抗菌蛋白初步分析

枯草芽孢杆菌NCD-2菌株对棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌具有较强的抗生作用。通过对NCD-2菌株培养条件的研究,结果表明在30℃、培养液初始pH为7.0和培养时间为2 d条件下,利用NB培养基培养该菌株所得培养液抑菌活性优于其他培养基,其培养液经硫酸铵沉淀所得的蛋白粗提液经RNA酶处理后的抑菌活性与对照相比差异不显著,经蛋白酶K和胰蛋白酶处理后的抑菌活性与对照相比差异显著;蛋白粗提液经60℃处理后的抑菌活性与对照相比差异不显著,经80,100,120℃处理后抑菌活性与对照相比差异显著,但经120℃处理30 min后仍有一部分抑菌活性,研究结果说明该菌株产生的抗菌物质存在性质上的差异。     

大丽轮枝菌混合侵染棉花的研究

利用绒毛型变异体 (B型 )的形态特征 ,采用不同形态类型的菌株混合接种、再分离后分别进行致病力和营养体亲和性测定的方法 ,证明不同致病力的大丽轮枝菌菌株可以共同侵染同一株植物 ,在菌株间不同浓度混合比例的接种中 ,混合侵染率约占总侵染率的 1 /1 5至 1 /3。是一种研究不同致病力的菌株在寄主体内互作动态和分布情况的简便方法。由此提出在黄萎病研究中为防止不同致病力菌株对研究结果的干扰 ,应以使用单孢菌株为宜 ;由于形态变异体容易识别 ,在研究棉花黄萎病的交叉保护现象中可加以利用     

棉花黄萎病拮抗细菌2-70（Bacillus subtilis）菌株定殖能力的研究

试验通过灭菌土和非灭菌土两种土样,试验前分别对这两种土样进行三种不同的处理,即：用拮抗菌芽孢液浸种,土壤全部混菌,部分混菌进行盆栽试验。主要通过盆栽试验,考察棉花黄萎病拮抗细菌2—70在土壤中的定植情况及在棉花根内和根际的定植情况。结果表明,在实验室条件下,拮抗细菌2．70能够在灭菌土和非灭菌土中定殖,且定殖数量达10^6cfu／g土左右,经过五个月后仍能保持较高的抑菌活性,并且菌株在灭菌土中的定殖数量高于非灭菌土中的数量。通过对棉苗根内细菌的回收,证实拮抗细菌2．70能在棉花根内定殖,数量达到10^3cfu／g。     

棉花黄萎菌拮抗菌BDT-25的鉴定及抗菌蛋白产生条件研究

拮抗细菌BDT_25是从根际土壤中分离到的一株对棉花黄萎病菌具有强烈抑制作用的芽孢杆菌。经生理生化特征的鉴定,证明BDT_25菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。此外,该菌株还对棉花枯萎病菌、棉花立枯病菌等10种其他病原真菌的生长具有显著的抑制作用,为一株广谱拮抗细菌菌株。通过对BDT_25菌株培养条件的研究发现,采用NB液体培养基,28℃,170 r/min培养48 h所得发酵液对棉花黄萎病菌的抑制作用最强。其发酵液经硫酸铵沉淀粗提到对棉花黄萎病菌具有抑制作用的提取物,进一步实验表明,该拮抗物质对热和多种蛋白酶敏感,证实其为抗菌蛋白。     

Physical and Chemical Properties and Antifungal Mechanism of Antifungal Protein Produced by Antagonistic Strain Bacillus subtilis ZL2-70 against Verticillium dahilae

The aim of this study was to investigate inhibition spectrum, characteristics and antifungal mechanism of antagonistic protein of B. subtilis ZL2-70 which possesses strong antagonistic abilities to Verticillium dahilae Kleb., and to offer a theoretical basis for biological control of cotton Verticillium wilt and development of transgenic resistant varieties. The inhibition spectrum of antifungal protein was studied and effects of heat, pH, proteinase, EDTA, inorganic ion on inhibiting activity were also investigated. Furthermore, cellulase and chitinase of the crude antifungal protein were determined and the inhibition to mycelium and spores was studied by different methods. Results indicated that, antagonistic protein of B. subtilis ZL2-70 against Verticillium dahilae has broad inhibition spectrum, which had strong inhibition activity to 21 different plant pathogens. It was relatively stable, could tolerate high temperature, EDTA and proteinases and keep activity in the range of pH 5-10, but it was sensitive to Fe3+. The preliminary study on inhibition mechanism demonstrated that the antifungal protein could break down the mycelium and leak the protoplasm, turn the mycelium cells into bigger sacs and inhibit germination of conidia and the inhibition activity was consistent with cellulase and chitinase activity of antifungal protein. Therefore, the inhibition mechanism is deduced as mycelial growth and spore germination are inhibited by cell enzyme activity of the antagonistic protein.     

响应面法对解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)12-7产抗菌蛋白条件的优化

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)12-7是从发病棉田土壤中分离得到的1株生防细菌,其对棉花黄萎病致病菌大丽轮枝菌Verticillium dahliae Kleb.V190具有明显的拮抗作用,已证明其抗菌物质为蛋白质。采用响应面法对该生防菌株的产抗菌蛋白条件进行优化,以期为棉花黄萎病生物农药的研制开发以及抗菌蛋白的后续研究奠定基础。以发酵液上清液对大丽轮枝菌的抑菌圈面积为考察指标,首先采用单因子试验考察培养时间、温度、初始pH、碳源、氮源、无机盐等因素对菌株12-7发酵产抗菌蛋白的影响;再根据响应面分析法的基本原理和方法,对发酵条件进行优化。得出该菌株产抗菌蛋白的最优发酵培养基和培养条件为:1.5%(质量分数)蔗糖、1.5%(质量分数)大豆蛋白胨、0.3%(质量分数)NaCl、0.1%(质量分数)K2HPO4、初始p H7.3的培养基,31℃发酵培养60 h。优化后抑菌圈面积从试验设计初期的171.95 mm2提高至320.3 mm2,且经过验证试验证实预测值与实际值之间具有较好的拟合度。     

生防细菌枯草芽孢杆菌A97对小鼠的急性毒理作用研究

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)A97是一株具有广谱抗真菌活性的生防细菌,对常见果蔬采后病害有显著防治效果。通过小鼠急性经口毒性和细菌移位试验,评价B.subtilis A97及其代谢产物对哺乳动物的生物安全性,为该菌株在果蔬采后病害防治中的安全应用提供依据。采用最大剂量耐受法连续14 d每天对小鼠灌喂菌体浓度为1.0×109 CFU/m L的B.subtilis A97发酵液0.4 m L(对照组灌喂无菌生理盐水),观察和测定小鼠的一般体征、脏器指数、血相和肝脏生化等指标,并检测小鼠血液和组织中是否发生细菌移位。结果表明,B.subtilis A97发酵液对小鼠的半数致死剂量大于20 000 mg/kg BW,各处理组小鼠未出现明显中毒症状及死亡现象。处理组小鼠一般体征、脏器指数、血清和肝脏生化指标与对照组相比差异不显著,且小鼠血液和其他组织样本中均未检测到由B.subtilis A97引起的细菌移位。由此推断B.subtilis A97及其代谢产物对哺乳动物安全无毒副作用,可在农业生产中使用。     

棉花黄萎病拮抗细菌12-47发酵条件的优化

本实验采用单因素实验的方法在摇床培养的基础上对影响棉花黄萎病拮抗细菌12-47菌株产生拮抗物质的营养因素进行了考察,其中包括发酵培养基的C源、N源、无机盐等。在此基础上通过正交试验对各因素的浓度和组合进行了优化;通过L16（43）正交实验对培养最佳培养基起始pH值、摇瓶装液量、接种量、发酵时间等条件进行了摸索。最终确定优化后的培养基为：玉米粉3%、大豆蛋白胨5%、Mn2+ 0.1%、K+ 0.05%、起始pH8.0、装液量100mL/250mL三角瓶、接种量8%、发酵时间48h。用优化后的培养基进行发酵,发酵液抑菌活性比优化前提高了269%。