ph1b、ph2a、ph2b基因在小麦与卵穗山羊草、小伞山羊草、离果山羊草F1杂种中的作用

迄今为止,仅Sharma等1986年研究报道了phlb基因诱导小麦与离果山羊草F₁杂种染色体配对作用,但没有在离果山羊草及其它山羊草中发现染色体配对促进基因或抑制基因,尚无phlb基因诱导小麦与卵穗山羊草F₁及ph2a、ph2b基因诱导小麦与这3个山羊草F₁染色体配对作用的报道。Farooq等1990年报道易变山羊草不同品系影响F₁染色体配对。     

小麦品种“陕253”低分子量谷蛋白亚基基因的克隆及原核表达

利用LMW-GS特异引物,从强筋小麦品种陕253中克隆了1个1 498 bp的片段(GenBank登录号为FJ172533),该片段包含全长为912 bp的低分子量谷蛋白亚基的完整编码序列.经比较推导氨基酸序列的同源性,发现该基因属于Glu-D3位点编码低分子量谷蛋白亚基的基因,编码产物N-端具有LMW-m型低分子量谷蛋白亚基的典型特征,系统演化分析也支持这一结果.构建了该基因的表达载体pET32a-GluD3-S253,在宿主菌E. coll Rosetta-gami B(DE3)中经IPTG诱导表达融合蛋白.SDS-PAGE和Western blot检测表达产物,证实融合蛋白表达成功.     

白羊草BiCDPK基因保守区的克隆及序列分析

为了研究CDPK基因的结构和功能,利用RT-PCR方法从白羊草中克隆得到BiCDPK基因,并对其进行生物信息学分析。结果表明：该BiCDPK基因cDNA长1048 bp,包含387 bp的开放阅读框,编码128个氨基酸。蛋白表现为弱酸性,且稳定、亲水,二级结构中以无规则卷曲和α-螺旋为主。亚细胞定位于细胞质中,无跨膜结构域,无信号肽。蛋白序列中存在1个丝氨酸磷酸化位点和3个苏氨酸磷酸化位点。进化分析结果表明,克隆的BiCDPK基因与玉米、小麦和水稻具有较高同源性,相似度分别是97%、86%、86%。为进一步研究BiCDPK基因的功能奠定了基础。     

转小麦铁蛋白基因酵母的抗氧化活性

铁蛋白是广泛存在于动、植物和微生物中的储铁关键蛋白,具有调节铁代谢平衡、消除亚铁离子引起的氧化毒性等作用。本研究克隆了小麦铁蛋白基因,构建其真核表达载体,经筛选、检测得到具有形成活性小麦铁蛋白多聚体能力的转基因酵母。转基因酵母与转空载体的对照酵母相比不仅可有效清除过氧化氢(H₂O₂),而且还具清除羟自由基(^.OH)和超氧阴离子(O₂^?)的能力;×OH、O₂^?和H₂O₂对转基因酵母的半致死浓度(LD₅₀)分别为0.40、1.00和36.91 mmol L^-1,比对照酵母分别提高了37.93%、47.06%和77.03%。不同浓度转基因酵母对×OH、O₂^?和H₂O₂清除能力的回归方程分别为一元三次多项式、对数方程和负指数方程。说明小麦铁蛋白基因的真核表达产物可以有效清除3种活性氧,而且具有较为复杂的互不相同的作用机制。     

青稞脂质转运蛋白基因blt4.9的克隆及其对非生物胁迫的响应

为了解脂质转运蛋白基因在青稞中的功能, 以青稞品种昆仑12为材料, 利用同源克隆得到青稞blt4.9基因序列(GenBank登录号为KU170187), 该基因的cDNA序列全长720 bp, 开放阅读框长348 bp, 编码115个氨基酸残基, 相对分子质量为11.2 kD, 理论等电点9.04, 不稳定系数为28.41, 是一个稳定的蛋白质。blt4.9编码的蛋白绝大多数属于疏水区, 没有较大的亲水区。序列比对显示, 该基因与大麦blt4.9基因编码蛋白的同源性最高(98.3%)。Real-time PCR分析结果显示, blt4.9基因在20%~30% PEG-6000、4℃以及50 mmol L^-1 ABA处理后表达量显著增加, 且在抗逆性强的青稞品种(旱地紫)中的表达量高于在抗逆性弱的品种(大麻)中, 推测该基因与青稞的抗逆性有关。该研究结果为利用青稞脂质转运蛋白基因改良青稞抗逆性奠定了基础。     

苎麻ACC氧化酶基因(BnA CO2)的克隆、时空表达及原核表达分析

ACC氧化酶(ACC oxidase, ACO)是乙烯合成途径中的一个关键酶。本研究通过RT-PCR结合RACE技术克隆得到一个ACO基因,命名为Bn ACO2,该基因cDNA序列全长为1 377 bp,开放阅读框为957 bp,编码318个氨基酸多肽,预测其分子量和等电点(pI)分别为36.145 kD和5.60。生物信息学分析表明,BnACO2编码蛋白没有信号肽和跨膜结构域,亚细胞定位于细胞质。与川桑等物种ACC氧化酶基因核苷酸序列同源性在83%以上,氨基酸序列同源性在87%以上。通过系统发育树发现该基因和山黄麻、大麻ACO基因亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析表明,苎麻Bn ACO2基因在苎麻各部位均有表达,特别是在雌花花芽中表达显著。最后成功构建原核表达载体p QE-Bn ACO2,诱导表达出的目的蛋白分子量大小约为36.15 kD,与预测的蛋白大小一致。这为进一步研究BnACO2基因的功能提供了科学依据。     

茶树赤霉素受体基因CsGID1a的克隆与表达分析

GID1作为赤霉素信号转导的受体,在赤霉素作用中具有重要作用。采用同源克隆方法,利用RT-PCR和RACE技术在茶树中克隆到赤霉素受体基因GID1的cDNA全长,命名为CsGID1a (GenBank登录号为JX235369)。该基因全长1411 bp,开放阅读框1 023 bp,编码341个氨基酸。生物信息学分析显示,CsGID1a编码的蛋白分子量为38.53 kD,理论等电点为5.62;无信号肽位点,是非分泌性蛋白,具有1个跨膜区,基因被定位于细胞核内;CsGID1a氨基酸序列具有激素敏感性脂肪酶(HSL)家族蛋白的HGG、GXSXG功能域以及羧酸酯酶典型的三级结构;与其他物种的GID1相似性均在60％以上,与葡萄的相似性最大达87％、进化关系最近。荧光定量PCR结果显示,高浓度(1.0×10^–5 mol L^–1)GA₃能够下调CsGID1a的表达,5 h内的表达呈下降趋势;随着越冬茶芽萌动进程,CsGID1a表达量逐渐降低,特别在3月初萌发以后变化较大,推测赤霉素及其受体基因可能与茶树越冬芽解休眠相关。     

致病疫霉木瓜蛋白酶亚家族基因C1A-PH-SCH1的克隆与表达分析

为进一步明确引起马铃薯晚疫病的致病因子,通过克隆马铃薯晚疫病致病疫霉菌分泌蛋白中的半胱氨酸蛋白酶家族基因,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌BL21中诱导表达。本试验采用TA克隆法,提取来自云南马铃薯产区的致病疫霉菌XH05-5-4的总RNA,反转录cDNA,PCR扩增后将该基因片段连接到载体,转化大肠杆菌BL21并诱导表达。克隆获得半胱氨酸蛋白酶家族基因全长为1176 bp,包含1个最大的开放阅读框1077 bp,编码387个氨基酸。推测蛋白相对分子量41.671 kD,理论等电点4.88;经IPTG诱导和SDS-PAGE检测,所构建的原核表达载体表达的蛋白与预期蛋白相符合。生物活性测定表明：马铃薯叶片出现坏死,类似于晚疫病症状。利用TA克隆技术从致病疫霉菌XH05-5-4中克隆得到了1个半胱氨酸蛋白酶家族基因（登录号：KP938956命名：C1A-PH-SCH1）,通过同源性比对发现C1A-PH-SCH1为木瓜蛋白酶亚家族基因,成功构建了原核表达载体,并使其在大肠杆菌中得到了表达,对生物活性测定结果显示出现了类似于晚疫病症状的水渍坏死斑症状,推测C1A-PH-SCH1参与马铃薯晚疫病的发病过程。     

棉花肉桂醇脱氢酶基因的克隆与分析

肉桂醇脱氢酶(CAD)是木质素生物合成过程中的一个关键酶类。根据棉花纤维特异表达cDNA文库分析得到的肉桂醇脱氢酶基因EST序列设计引物,采用RT-PCR技术从棉花中克隆了一个CAD基因,命名为GhCAD5(GenBank登录号为FJ848868)。研究结果表明:GhCAD5全长1488bp,具有一个1068bp的开放阅读框,5′非编码区为140bp,3′非编码区为280bp,编码355个氨基酸,预测分子量约为38.403kDa,等电点为7.67。氨基酸同源性分析发现,GhCAD5与拟南芥AtCAD1和水稻OsCAD4的同源性较高。利用PCR方法克隆了GhCAD5基因的基因组序列,长度为1695bp,包含6个外显子和5个内含子。将GhCAD5的ORF连接于原核表达载体pET-28a中,经IPTG诱导,获得了相应蛋白的表达。棉花GhCAD5基因的克隆为进一步研究其生物学功能和应用奠定了基础。     

玉米丝氨酸羧肽酶基因(ZmSCP)的克隆及表达分析

丝氨酸羧肽酶(serine carboxypeptidases, SCP)基因在植物生长发育及抗病性方面起着重要作用。本研究在立枯丝核菌胁迫24 h后, 以RT-PCR技术和RACE技术克隆玉米丝氨酸羧肽酶基因全长cDNA序列, 命名为ZmSCP。结果显示, 该基因全长为1874 bp (GenBank登录号为JF682634), 开放阅读框为999 bp, 编码332个氨基酸, 相对分子量为36.505 kD, 等电点为4.75。ZmSCP基因编码蛋白与其他高等植物中该蛋白具有一定的同源性, 同源性比例范围为42%~81%。进化树分析表明ZmSCP基因与水稻、高粱亲缘关系较近, 属于同一进化分支。ZmSCP基因编码蛋白序列保守结构域分析显示该基因编码产物具有S10结构域, 属于S10超家族。半定量RT-PCR与实时荧光定量PCR结果表明, ZmSCP基因在立枯丝核菌、ABA、JA、低温、高盐胁迫条件下, 总体均呈诱导表达的趋势。其中, 在立枯丝核菌AG1-IA诱导下, ZmSCP基因表达呈两步诱导趋势, 第1次诱导出现在接菌后24 h, 然后下降, 第2次诱导出现在接菌后60 h。在ABA、JA、低温和盐胁迫下, ZmSCP基因表达均呈现上调趋势, 表达高峰均出现在胁迫后48 h。     

小麦品种陕253 γ-醇溶蛋白基因的克隆、原核表达与功能鉴定

利用设计合成的特异γ-醇溶蛋白基因引物,采用PCR方法从小麦品种陕253克隆获得一个γ-醇溶蛋白基因(GenBank登录号GQ857626)。序列分析表明,该基因编码产物的II区由于碱基转换产生一个额外的半胱氨酸残基。构建了GQ857626的原核表达载体并转入表达菌株E. coli Rosetta gami B(DE3),IPTG诱导其成功表达。使用HisTrap HP组氨酸标记亲和层析柱纯化该基因的表达产物,并使用4 g粉质仪分析其功能。结果显示,将此纯化蛋白通过氧化还原反应整合到基础面粉后,面团的形成时间缩短,稳定时间减少,弱化度增加,导致主要的粉质指数明显下降,说明该亚基对面团流变学性质整体表现不利。     

甜菜亚硝酸还原酶基因(NiR)的克隆与表达分析

以甜菜品种甜研7号叶片的cDNA为模板,采用RT-PCR和3′/5′RACE技术,获得了编码亚硝酸还原酶基因(NiR)的cDNA全序列2 014 bp, 包含有1 830 bp的开放阅读框,编码599个氨基酸。所推导的氨基酸序列与菠菜及拟南芥NiR编码的氨基酸序列均具93%的同源性。生物信息学分析表明,甜菜NiR具有完整的NiR蛋白结构,含血红素蛋白β-化合物区域和4Fe-4S区域, 并利用分析软件预测其三维结构。实时荧光定量结果显示,在以0、10、20、30、40、50、80和160 mmol L^–1 NO₃^–-N处理72 h的试验中,50 mmol L^–1处理可使甜菜NiR的表达量达到最大;以0、2、4、8、16、32、64和128 mmol L^–1 NH₄⁺-N处理48 h的试验表明,8 mmol L^–1和64 mmol L^–1处理条件下甜菜NiR表达量相对较高。硝态氮和铵态氮不同配比处理48 h的试验中,NO₃^–-N和NH₄⁺-N比例为80:20可使甜菜NiR的表达量达到最大;在氮素诱导的基础上,蛋白抑制剂放线菌酮处理9 h,随着处理浓度的增大,NiR的表达量逐渐下降;不同浓度NO₂^–处理的试验中,40 mmol L^–1处理下NiR的表达量最大。     

CO2浓度升高和施氮对冬小麦花前贮存碳氮转运的影响

为探讨大气CO₂浓度升高对冬小麦花前贮存碳氮转运的影响及氮素营养的调节作用,以小偃22和小偃6号为材料,于2007—2009连续2个生长季,利用开顶式气室进行盆栽试验,对背景CO₂浓度(375 μL L^-1)和高CO₂浓度(2007—2008年度680 μL L^-1, 2008—2009年度750 μL L^-1)条件下不同施氮处理的干物质和氮素在籽粒、花前地上部中的累积以及花后营养器官的转运进行了评价。2007—2008年度设4个施氮水平,分别是0、0.1、0.2和0.3 g kg^-1土; 2008—2009年度设3个施氮水平,分别是0、0.15和0.30 g kg^-1土。结果表明,施氮和CO₂浓度升高促进了干物质和氮素在籽粒和花前营养器官的积累,增加了花前营养器官和地上部贮存干物质和氮素向籽粒的转运量,适量施氮提高了CO₂浓度升高对花前营养器官干物质和氮素累积以及花后向籽粒转运的正向效应。与背景CO₂浓度相比,高CO₂浓度提高了花前营养器官和地上部干物质对籽粒产量的贡献率和转运率,但CO₂浓度升高对花前氮素的贡献率和转运率的影响因年份和品种而异。CO₂浓度升高后,2007—2008年度各营养器官和地上部,以及2008—2009年度茎鞘和穗的氮素贡献率和转运率均增加,但2008—2009年度2个品种叶片和地上部氮素贡献率在施氮时均显著降低,小偃22叶片和地上部氮素转运率在各施氮水平下以及小偃6号地上部氮素转运率在0.13 g kg^-1土施氮水平下均明显增加。适量施氮也在大多数情况下增强了CO₂浓度升高对营养器官干物质和氮素的贡献率和转运率的正向效应。说明CO₂浓度升高后小麦产量和氮素积累增加与其促进花前干物质和氮素积累及花后向籽粒的转运密切相关。     

蛋白激发子Hrip1基因在拟南芥中表达可提高植株的耐盐耐旱能力

Hrip1是从极细链格孢(Alternaria tenuissima)代谢物中分离的一种蛋白激发子。将蛋白激发子基因Hrip1转化到拟南芥,对5个T₁代转基因拟南芥株系进行分子检测, 证明Hrip1基因能够在拟南芥中转录和表达。转基因植株对盐和干旱胁迫的抗性显著增强, 75 mmol L⁻¹ NaCl和50 mmol L⁻¹甘露醇渗透胁迫2 d, 转基因植株种子平均相对发芽率为32.1%和77.9%, 分别比野生型的增加3.72倍和5.61倍; 150 mmol L⁻¹ NaCl和50 mmol L⁻¹甘露醇处理拟南芥幼苗7 d后, 转基因植株平均相对根长为81.79%和93.25%, 分别是野生型的1.53倍和1.34倍。3周龄的转基因植株在250 mmol L⁻¹ NaCl条件下胁迫20 d, 平均存活率为67%, 显著高于野生型(42%)(P<0.05); 干旱胁迫25 d后, 复水5 d转基因植株平均存活率为72%, 而野生型仅为44%。检测结果显示转基因植株叶片的抗氧化酶活性明显高于野生型, 用200 mmol L⁻¹ NaCl和200 mmol L⁻¹甘露醇处理24 h后, POD活性分别比野生型植株提高1.56倍和1.85倍, CAT活性分别比野生型植株提高1.64和1.86倍。说明蛋白激发子Hrip1基因在拟南芥中的表达能够改善和提高植株的耐盐抗旱能力。     

干旱胁迫下一氧化氮对小麦离体根尖离子吸收的影响

为阐明干旱胁迫下一氧化氮(NO)对植物的保护机制,利用干旱敏感性不同的3个小麦(Triticum aestivum L.)品种的离体根尖,比较了NO对干旱胁迫的响应及其对离子吸收的影响。在干旱胁迫下, 耐旱品种陇春8139根尖中大量产生NO, K⁺和Ca²⁺被大量吸收, 而Cl^-1被排出体外, 质膜H⁺-ATPase活性升高; 而干旱敏感品种甘麦8和定西24的根尖中NO、离子含量和质膜H⁺-ATPase活性的变化呈相反趋势。NO供体硝普纳(SNP)处理使3个品种根尖中的K⁺和Ca²⁺含量增加,Cl^-1含量下降,并能提高质膜H⁺-ATPase活力;NOS抑制剂N^ω-nitro-L-arginine(LNNA)和NO清除剂2-phenyl-4,4,5,5-tetramethyl-imidazoline-1-oxyl- 3-oxide(PTIO)能够逆转这一效果。Na⁺含量在所有处理下都没有明显变化。试验结果证明,NO能够通过调节质膜H⁺-ATPase活力影响植物对离子的选择吸收,从而提高耐旱性。     

新疆小麦Psy-A1、Ppo-A1、Ppo-D1、TaLox-B1等位变异对面粉色泽的影响

利用已开发的面粉色泽相关性状基因的分子标记,检测了182份新疆小麦品种(系)的Psy-A1、Ppo-A1、Ppo-D1、Ta Lox-B1等位变异,并结合表型鉴定结果,分析不同等位变异对面粉色泽的影响。结果表明,单基因等位变异对面粉色泽的影响不同,其中4个基因等位变异L*值的差异均不显著;对a*值的效应,Psy-A1a高于Psy-A1b(P0.01),Ppo-A1b高于Ppo-A1a(P0.05),Ta Lox-B1a高于Ta Lox-B1b(P0.05);Psy-A1a基因型的b*值高于Psy-A1b基因型(P0.01);Psy-A1a基因型的Wht值低于Psy-A1b基因型(P0.01)。说明Psy-A1是影响面粉色泽(红度、黄度和白度)的重要基因,而Ppo-A1和Ta Lox-B1基因的等位变异只对面粉红度有显著影响。4个检测基因共有12种等位变异组合,对a*、b*和Wht值有显著效应(P0.01),但对L*值影响不显著(P0.05);Psy-A1b/Ppo-A1a/Ppo-D1b/Ta Lox-B1b组合具有最高的Wht值和最低的a*、b*值,Psy-A1a/Ppo-A1a/Ppo-D1b/Ta Lox-B1a组合具有最低的Wht值和最高的a*、b*值。182份品种的Wht值平均为86.86,其中审定品种平均为86.87,冬小麦品种为86.42,春小麦品种为87.32。青春5号具有优良的基因型和较高的面粉白度,应加强利用。总体来看,改良新疆小麦面粉的白度,应重点加强对Psy-A1基因的选择,提高Psy-A1b比例。     

干旱胁迫下一氧化氮对小麦离体根尖离子吸收的影响

为阐明干旱胁迫下一氧化氮(NO)对植物的保护机制,利用干旱敏感性不同的3个小麦(Triticum aestivum L.)品种的离体根尖,比较了NO对干旱胁迫的响应及其对离子吸收的影响。在干旱胁迫下, 耐旱品种陇春8139根尖中大量产生NO, K⁺和Ca²⁺被大量吸收, 而Cl^-1被排出体外, 质膜H⁺-ATPase活性升高; 而干旱敏感品种甘麦8和定西24的根尖中NO、离子含量和质膜H⁺-ATPase活性的变化呈相反趋势。NO供体硝普纳(SNP)处理使3个品种根尖中的K⁺和Ca²⁺含量增加,Cl^-1含量下降,并能提高质膜H⁺-ATPase活力;NOS抑制剂N^ω-nitro-L-arginine(LNNA)和NO清除剂2-phenyl-4,4,5,5-tetramethyl-imidazoline-1-oxyl- 3-oxide(PTIO)能够逆转这一效果。Na⁺含量在所有处理下都没有明显变化。试验结果证明,NO能够通过调节质膜H⁺-ATPase活力影响植物对离子的选择吸收,从而提高耐旱性。     

Characterization of DFR allelic variations and their associations with pre-harvest sprouting resistance in a set of red-grained Chinese wheat germplasm

Pre-harvest sprouting (PHS) of wheat greatly reduces the quality and economic value of grain, and PHS resistance is one of the most important traits in wheat breeding. Red-grained wheat varieties are generally more resistant to PHS than white-grained ones; however, some are still susceptible. The red pigment of red-grained wheat is synthesized through the flavonoid biosynthetic pathway, in which the dihydroflavonol-4-reductase gene (DFR) is one of the genes involved in anthocyanin synthesis. In this study, a set of 120 red-grained Chinese wheat cultivars and lines with distinct PHS resistance were used to characterize TaDFR genotype variations and their association with PHS resistance. Whereas no variation or functional variation of TaDFR genes was detected on chromosomes 3A and 3D, a novel TaDFR allele, designated TaDFR-Bb, was explored on chromosome 3B. Compared with TaDFR-Ba, an 8 bp insertion (CTCTAGGA) was identified in the promoter region of TaDFR-B in most of the PHS resistant red-grained wheat varieties and advanced lines. Based on this, a CAPS marker was designed and validated with a set of Chinese red-grained wheat cultivars and lines with distinct PHS resistance. In most cases, TaDFR-Bb was associated with higher PHS resistance. An association study indicated that wheat varieties with the 8 bp insertion (average seed germination index 23.6 %) were significantly more resistant (P < 0.01) to PHS than those without the insertion (average seed germination index 69.5 %). Further study on gene expression demonstrated that the insertion led to increased TaDFR-B expression in cultivars with PHS resistance. Transient expression of TaDFR-B in coleoptiles of wheat cv. Chinese Spring revealed that increasing TaDFR gene expression did not induce the synthesis of anthocyanins.     

一个受黄萎病菌诱导的海岛棉功能基因GbVWR的克隆与表达

黄萎病是一种土传真菌维管束病害,严重影响棉花产量和品质。挖掘抗黄萎病相关基因对于棉花抗黄萎病遗传改良具有重要意义。本研究通过筛选黄萎病菌胁迫下的海岛棉全长cDNA文库和陆地棉SSH文库,获得一个与黄萎病菌胁迫相关的基因,命名为GbVWR。生物信息学特征和基因表达分析表明,GbVWR基因全长520 bp,开放读码框198 bp,编码65个氨基酸残基组成的蛋白,理论等电点为5.32,包含一个信号肽和一个跨膜区,是一种分泌蛋白。GbVWR基因可以诱导表达7 kD的蛋白。在GbVWR基因起始密码子上游1500 bp的核苷酸序列区间预测到真菌激发子响应、激素响应、伤口响应及黄酮生物合成基因调节等应答元件。GbVWR基因在海岛棉根中表达最高,茎中其次,叶中最低。受黄萎病菌诱导后,GbVWR基因在接菌后2 h可对黄萎病菌作出应答反应。此外SA、ET和GA均可显著诱导GbVWR基因的表达。初步推断GbVWR是海岛棉抵御黄萎病菌过程中一个新的功能基因,通过参与多种激素信号途径发挥功能