诺维氏梭菌α毒素单克隆抗体的制备与鉴定

诺维氏梭菌是羊黑疫的致病菌,该菌可使1岁以上的绵羊发病,山羊也可以患此病。由诺维氏梭菌引起的羊黑疫发病急,死亡快,家畜往往还没有表现出明显症状就死亡,给畜牧业带来了巨大损失。本研究利用重组诺维氏梭菌ɑ毒素制备单克隆抗体,研究过程中成功制备了2株针对诺维氏梭菌α毒素重组蛋白的杂交瘤细胞,分别命名为1978CT716.15.65和1978CT142.38.7。对所得2株杂交瘤细胞分泌的抗体进行间接ELISA测抗体效价,最高可达到1:512 000。对所获得的2株杂交瘤细胞进行Western Blot分析发现,2种单克隆抗体均能与重组蛋白发生特异性结合。鉴于单克隆抗体具有生物活性单一、纯度相对比较高且与抗原结合特异性强等优势,可以利用单克隆抗体达到快速检测疾病及治疗疾病的目的,为构建快速检测诺维氏梭菌的检测技术和检测方法奠定了基础。     

腐败梭菌α毒素基因的克隆与序列分析

应用聚合酶链式反应(PCR)技术,从腐败梭菌强毒株C55-1中,扩增出大小为1327bp的腐败梭菌α毒素全基因(csa1327基因),并将其克隆入pMD18-T载体中.转化至受体菌DH5α后,经Amp/IPTG/X-Gal选择培养,提取质粒,PCR和EcoRⅠ/PstⅠ双酶切鉴定,筛选阳性重组克隆.核苷酸序列分析证实,csa1327基因开放阅读框架由1320bp组成,编码440个氨基酸残基.与GenBank中登录的国外Fukushima 5株、Kagoshima 1株、Mie株和44株的α毒素全基因相比,核苷酸同源率分别为100%、99.47%、99.25%和97.67%,推导氨基酸的同源率分别达100%、100%、99.7%和97.06%.表明本实验所克隆的csa1327基因即为腐败梭菌α毒素基因.     

腐败梭菌α毒素和产气荚膜梭菌ε毒素的 共表达及其免疫效力评价

为获得腐败梭菌α毒素和D型产气荚膜梭菌ε毒素的共表达产物,并鉴定其致死活性和反应原性,评价其免疫保护效力,利用PCR扩增腐败梭菌α毒素和产气荚膜梭菌ε毒素基因Gcsa和Gcpe并克隆至pETDuet-1质粒,转化E.coli BL21(DE3),自诱导培养基诱导这2段基因共表达;用SDS-PAGE和Western-blot以及小鼠毒性试验、抗毒素血清中和试验对表达产物进行鉴定;将诱导后的大肠杆菌灭活,制成铝佐剂疫苗1 m L/只皮下注射免疫家兔2次,测定免疫血清中和抗体效价,用1 MLD的腐败梭菌毒素和D型产气荚膜梭菌毒素分别攻击。结果显示,所构建的E.coli BL21(pETDuet-Gcsa-Gcpe)可以同时表达Gcsa和Gcpe,表达产物能够与腐败梭菌和D型产气荚膜抗毒素血清反应;且具有小鼠致死毒性,只有用2种抗毒素一同作用,才能将其毒性中和;制成灭活疫苗免疫家兔,免疫血清对腐败梭菌毒素的中和抗体效价为2 MLD/0.1 m L,对D型产气荚膜梭菌毒素的中和抗体效价≥50 MLD/0.1 m L;用2种毒素攻击,免疫组家兔全部保护,对照组全部死亡,达到《中华人民共和国兽药典》(2015版)效力检验标准。结果表明,所构建的表达载体可以实现α毒素和ε毒素的活性共表达,本研究为腐败梭菌和产气荚膜梭菌的多联基因工程灭活疫苗的研究提供了实验基础。     

重组腐败梭菌α毒素的生物活性及其灭活疫苗的免疫效果

为了研究重组腐败梭菌α毒素的生物活性及其灭活疫苗的免疫效果,采用PCR法扩增腐败梭菌α毒素基因,构建重组表达质粒pET28α-csa,转化E.coli BL21(DE3);对表达产物的细胞毒性、小鼠致死毒力和抗毒素中和试验等生物活性进行鉴定,并将其制成灭活疫苗免疫家兔和靶动物绵羊,通过攻毒素试验和血清中和试验与类毒素疫苗进行比较。结果显示,重组α毒素能够与腐败梭菌抗毒素血清反应,具有细胞毒性,小鼠致死毒力超过300 MLD/mL,其毒性可以被腐败梭菌抗毒素中和。制成灭活疫苗免疫家兔,随着免疫剂量的增加血清中和效价随之提高,0.25 mL/只(含重组α毒素0.11 mg)免疫即可使家兔获得100%保护,免疫效果优于类毒素疫苗;0.50 mL/只(含重组α毒素0.22 mg)免疫绵羊攻毒保护率为75%。结果表明,重组腐败梭菌α毒素具有很好的生物活性,所制成的灭活疫苗可以作为预防羊快疫的候选疫苗。     

产气荚膜梭菌ε毒素原核表达及其单克隆抗体的制备

以大肠杆菌表达的D型产气荚膜梭菌点突变的ε毒素蛋白作为免疫原,免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体,经过ELISA方法筛选,获得2株稳定分泌抗ε毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C3-D7和5H6-B8,单抗均为IgG1型。Western blot鉴定结果显示:2株单抗均能与重组ε毒素蛋白及D型产气荚膜梭菌ε毒素蛋白发生特异性结合。本试验为进一步研究产气荚膜梭菌ε毒素的生物学特性及建立产气荚膜梭菌的快速检测方法提供了基础。     

抗A型产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立与中和效应

用提取的 Ａ 型产气荚膜梭菌 α毒素包涵体免疫 Ｂ Ａ Ｌ Ｂ／ｃ 小鼠后, 取小鼠脾细胞与 Ｓ Ｐ２／０ 骨髓瘤细胞进行融合和克隆化,经间接 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 筛选,共获得 １ Ａ８、１ Ｃ３、１ Ｄ５、１ Ｄ８、１ Ｆ１、１ Ｈ１ 和 ２ Ｅ３ ７ 株稳定分泌单克隆抗体（ Ｍ ｃ Ａｂ）的杂交瘤细胞株。经鉴定,７ 株 Ｍ ｃ Ａｂ 的 Ｉｇ 亚类有 Ｉｇ Ｇ１（１ Ｄ８）、 Ｉｇ Ｇ３（１ Ａ８、１ Ｃ３ 和 ２ Ｅ３）和 Ｉｇ Ｍ（１ Ｄ５、１ Ｆ１ 和 １ Ｈ１）。细胞培养上清和腹水抗体效价分别为 １∶５１２～１∶１ ０２４ 和 １∶１０６ ～１∶１０８ 。尤为重要的是,２ Ｅ３ 杂交瘤细胞株分泌的 Ｍ ｃ Ａｂ 不仅能够中和 α毒素的磷脂酶 Ｃ活性和溶血活性,而且能够对致死性腹腔感染小鼠产生良好的被动保护作用。     

魏氏梭菌α毒素基因的克隆表达及其间接ELISA方法的建立

对GenBank上发表的魏氏梭菌α毒素基因的氨基酸序列进行了二级结构、疏水性、抗原决定簇、跨膜区以及抗原性分析,在此基础上,对α毒素基因130～966nt位的837bp长的适合原核表达的区域进行PCR扩增、克隆、核酸序列测定和生物信息学分析。同时,建立了检测魏氏梭菌α毒素抗体的间接ELISA方法。     

魏氏梭菌α毒素分子生物学研究进展

魏氏梭菌是引起各种坏死性肠炎、肠毒血症,同时也是引起创伤性气性坏疽以及人类食物中毒的主要病原菌之一,其致病因子是该菌产生的外毒素。根据主要致病的毒素α、β、ε和ι,将该菌分为A、B、C、D、E 5个毒素型。各型魏氏梭菌均产生α毒素,它是魏氏梭菌最主要的毒力因子。α毒素是依赖锌离子的磷脂酶C,具有细胞毒性、溶血活性、致死性、皮肤坏死性、血小板聚集和增加血管渗透性等特性。     

腐败梭菌无毒重组α毒素的表达与免疫保护性分析

本研究旨在获得腐败梭菌无毒重组α毒素,并评价其免疫保护性。对已知的腐败梭菌α毒素编码基因进行优化设计和人工合成,获得了缺少第212-222位共11个氨基酸编码序列的基因片段（GCSA_Δ11）。将该基因克隆至原核表达载体pET-30a（+）中进行表达与纯化。利用Western blot方法检测获得的重组α毒素（rCSA_Δ11）与腐败梭菌天然毒素抗血清的反应性,并采用小鼠检测其毒力。随后,以rCSA_Δ11制备疫苗免疫家兔,按照《中华人民共和国兽药典》（2015年版）规定的方法检测家兔血清的中和抗体效价。结果表明,rCSA_Δ11可溶表达比例可达46%,且能与腐败梭菌天然毒素抗血清反应。进一步的试验结果显示,rCSA_Δ11丧失了对小鼠的毒力,0.1 mL的一免兔血清可中和8~12个小鼠最小致死量（MLD）的腐败梭菌天然毒素;二免兔血清可中和32~45个小鼠MLD的腐败梭菌天然毒素。1个家兔MLD的腐败梭菌天然毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔得到了100%（4/4）的保护。综上表明,无毒性的rCSA_Δ11保留了良好的免疫保护性,从而为腐败梭菌病基因工程亚单位疫苗的研制提供了重要的试验数据。     

重组腐败梭菌α毒素的制备与免疫效力评价

为了对重组腐败梭菌α毒素的免疫效力进行评价,本研究以表达重组腐败梭菌α毒素的大肠杆菌BL21(pET28a-CSA)为研究对象,对影响重组腐败梭菌α毒素表达量的条件优化后,将重组腐败梭菌α毒素(分为上清分泌形式与包涵体形式)、超声波裂解和未裂解诱导后的全菌制成铝佐剂灭活疫苗皮下注射免疫家兔后,检测家兔血清中和效价,利用1 MLD腐败梭菌毒素攻击免疫家兔。结果显示,pET28a-CSA/BL21培养至OD_600nm达到0.850～0.950时以0.40 mmol/L IPTG,37℃诱导6 h获得的重组腐败梭菌α毒素相对表达量较高,并且以包涵体和可溶性2种形式表达且以包涵体居多;除包涵体疫苗组血清中和抗体效价为6 MLD/0.1 mL外,其它可溶性、裂解菌苗和未裂解处理菌苗实验组均为8 MLD/0.1 mL,高于类毒素疫苗组和《中国兽药典》规定的1 MLD/0.1 mL,攻毒后各免疫组家兔均得到100%保护,而类毒素疫苗组保护率仅40%,空白对照组全部死亡。结果表明,本研究制备的重组腐败梭菌α毒素具有很好的免疫保护效果,尤以可溶性的重组腐败梭菌α毒素免疫保护最佳。本实验为羊快疫疫苗的研制提供了实验基础。     

产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆、表达及其抗血清的制备

本试验通过设计并合成1对引物,PCR扩增B型产气荚膜梭菌C58-2株α毒素完整成熟肽序列,并将其插入到pGEM-T Easy载体中,构建克隆载体pGEM-T-α。对克隆载体pGEM-T-α进行EcoRⅠ和Hind Ⅲ的双酶切,将得到的1125 bp片段以正确的阅读框架定向克隆于pET-28a(+)中,然后将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plys宿主菌中,37 ℃、1.0 mmol/L IPTG诱导该片段获得良好表达。经SDS-PAGE分析,其表达的蛋白约为46.1 ku,与预期大小一致。Western blotting结果显示,该重组α毒素蛋白可被A型产气荚膜梭菌定型血清识别,表明该重组α毒素蛋白具备与天然毒素相似的反应原性。重组α毒素蛋白在菌液上清、超声波裂解上清和超声波裂解沉淀中均有分布,且以包涵体表达为主,表明重组α毒素蛋白可同时在胞外、周质和胞浆表达。小鼠毒力试验结果表明,重组α毒素蛋白不具有毒性。毒素—抗毒素中和试验结果表明,该抗血清具有α毒素特异性。以重组α毒素蛋白作为抗原免疫家兔制备血清,效价测定结果表明每1 mL重组α毒素蛋白抗血清可以中和100 MLD的A型毒素。     

魏氏梭菌α毒素核酸探针的制备和应用

根据GeneBank上发表的A型魏氏梭菌α毒素基因序列,设计合成了一对特异性引物,通过PCR的方法,扩增出了大小为470bp的α毒素基因的部分片段。应用地高辛标记法来标记该片段,制备了α毒素基因探针,该探针只与魏氏梭菌DNA发生阳性反应,与其它多种细菌DNA不发生反应;该探针在1：1000的工作浓度下,能检出1-5pg／uL的魏氏梭菌基因组DNA。应用该探针对33株魏氏梭菌进行核酸杂交（Dot-Blotting）检测,结果表明该探针具有良好的特异性和灵敏性,可用于对魏氏梭菌的诊断检测以及流行病学调查。     

魏氏梭菌α毒素核酸探针的制备和应用

根据GeneBank上发表的A型魏氏梭菌α毒素基因序列,设计合成了一对特异性引物,通过PCR的方法,扩增出了大小为470 bp的α毒素基因的部分片段。应用地高辛标记法来标记该片段,制备了α毒素基因探针,该探针只与魏氏梭菌DNA发生阳性反应,与其它多种细菌DNA不发生反应;该探针在1∶1000的工作浓度下,能检出1~5pg/uL的魏氏梭菌基因组DNA。应用该探针对33株魏氏梭菌进行核酸杂交(Dot-Blotting)检测,结果表明该探针具有良好的特异性和灵敏性,可用于对魏氏梭菌的诊断检测以及流行病学调查。     

产气荚膜梭菌α毒素保护性抗原基因在大肠杆菌中的高效表达

对含有产气荚膜梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）α毒素基因的重组菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＡ１）和ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ（ｐＸＥＴＡ１）,通过培养性状观察和小鼠接种试验,证明这２株重组菌株均无致病性。随后对这２株重组菌株的表达产物进行了研究,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和薄层凝胶扫描分析,ＩＰＴＧ诱导３～４ｈ后的ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＡ１）表达的α毒素占菌体总蛋白３３．２１％,ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ（ｐＸＥＴＡ１）表达的α毒素占菌体总蛋白２７．２５％,其相对分子质量约３７５００;经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析,表达产物可被α毒素抗血清识别。包涵体粗提物的免疫攻毒试验结果表明,以１倍致死量攻击的免疫小鼠可获得１００％（３６／３６）的保护,以２倍致死量攻击的免疫小鼠可获得９４．２８％（３３／３５）的保护,从而说明表达产物具有良好的免疫原性。     

抗产气荚膜梭菌ε毒素单克隆抗体的研制和部分特性鉴定

小鼠ＳＰ２／０骨髓瘤细胞和用产气荚膜梭菌ε类毒素免疫ＢＡＬＢ／Ｃ鼠的脾细胞，以ＰＥＧ为融合剂进行融合，获得分泌抗产气荚膜梭菌ε毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株１３株，经鉴定，杂交瘤所分泌的单克隆抗体在ＥＬＩＳＡ中均特异地与产气荚膜梭菌ε毒素反应，而不与α和β毒素反应，１３株单克隆抗体均为ＩｇＧ１亚类，经毒素抗毒素中和试验测定，１３株单克隆抗体中，１２株具有中和ε毒素的活性。     

产气荚膜梭菌α毒素的研究进展

作者对产气荚膜梭菌α毒素的组成、理化性质、生物学特性、检测、结构功能、作用机理、分子遗传及其与氨基酸的组成和细胞膜之间的关系等方面的研究进展作了简要综述。     

D型产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆与高效表达

为建立产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)α毒素(cpa)克隆表达方法,应用PCR方法从羊源D型产气荚膜梭菌中扩增cpa成熟肽基因序列,将其插入pET-28b载体中,构建重组表达载体pET-28b-cpa;通过PCR扩增、双酶切和测序方法对重组载体进行鉴定及序列分析,然后转入BL21(DE3)pLysS中诱导表达;用SDS-PAGE检测目的蛋白大小及分布,Western blotting方法检测其反应原性。结果表明,所扩增的cpa基因大小为1110 bp,与GenBank参考序列同源性为99%以上;SDS-PAGE分析结果表明,目的蛋白大小为41.2 ku,与预期大小一致,在超声波裂解上清和包涵体中均有分布,但主要以包涵体为主,两者分布均具有和天然毒素相似的反应原性。     

产气荚膜梭菌α毒素的研究进展

产气荚膜梭菌 (Clostridiumperfringens)的致病作用一般由它所产生的胞外酶或毒素诱导。主要有α -毒素、β -毒素、θ -毒素及其他的一些胞外酶。本文针对产气荚膜梭菌α毒素的组成、结构、理化性质、作用机理及分子遗传等方面的研究进展作了简要综述。