羊黑疫的诊断与防治

2008年8～11月,内蒙古通辽市科左中旗某乡的绵羊发病并急性死亡,3个月内死亡270余只。从其中12只症状典型的病死羊病料中分离到疑似诺维氏梭菌,经毒素测定和毒素中和试验、动物接种,证实其中10株分离菌为B型诺维氏梭菌,毒价测定最小致死量为400～3200,从而诊断为B型诺维氏梭菌引起的羊黑疫。     

产气荚膜梭菌ε毒素原核表达及其单克隆抗体的制备

以大肠杆菌表达的D型产气荚膜梭菌点突变的ε毒素蛋白作为免疫原,免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体,经过ELISA方法筛选,获得2株稳定分泌抗ε毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C3-D7和5H6-B8,单抗均为IgG1型。Western blot鉴定结果显示:2株单抗均能与重组ε毒素蛋白及D型产气荚膜梭菌ε毒素蛋白发生特异性结合。本试验为进一步研究产气荚膜梭菌ε毒素的生物学特性及建立产气荚膜梭菌的快速检测方法提供了基础。     

绵羊黑疫的病原诊断

2005年10月,青海省海北州某牧场的藏系绵羊发病并急性死亡,半个月内死亡200余只,从其中2只症状典型的病死羊病料中分离到疑似诺维氏梭菌,经毒素测定、毒素中和试验及动物接种,证明分离出的2株菌为B型诺维氏梭菌,毒价测定最小致死量(MLD)为2~4万MLD/ml,从而诊断为B型诺维氏梭菌引起的羊黑疫。1发病情况和临床症状该羊群于发病半个月前曾注射过羊四联(瘁疽、羔羊痢疾、快疫、肠毒血症)疫苗,此次发病波及到了7个牧户,常急性死亡,死前无明显症状,晚上入圈时尚未发现症状,早晨发现已经死亡。2剖检变化死亡羊只颈部皮下有少量黄色胶胨样液体,…     

产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体的制备

为了制备产气荚膜梭菌致病性毒力因子α毒素的单克隆抗体,试验采用PCR法获得α毒素基因,克隆入原核表达质粒p ET-30b,转化至大肠杆菌BL21感受态细胞,构建表达α毒素的重组菌BL21/p ET-30b-α;IPTG诱导重组菌表达,并进行SDS-PAGE分析,以纯化的重组α毒素蛋白为免疫原免疫Balb/c小鼠,经筛选、亚类鉴定及特异性试验检测单克隆抗体。结果表明:重组菌表达的α毒素蛋白分子质量约为43 ku;杂交瘤细胞株3C5能够稳定分泌抗α毒素单克隆抗体,单克隆抗体亚型为Ig G2a型,能够特异识别产气荚膜梭菌天然α毒素蛋白。说明制备的单克隆抗体具有良好的反应原性。     

1例B型诺维氏梭菌与肝片吸虫混合感染的诊治

根据发病情况、临床症状、剖检变化、实验室检查,确诊青海省三角城种羊场二大队环青海湖地区放牧的2 106只绵羊,发生急性死亡原因为肝片吸虫和B型诺维氏梭菌混合感染.同时采取了防治措施,分析了发病原因,提出了如何制止肝片吸虫和B型诺维氏梭菌(羊黑疫)混合感染的防治对策.     

产气荚膜梭菌β毒素单克隆抗体的研制

为了得到产气荚膜梭菌β毒素单克隆抗体,以重组产气荚膜梭菌β毒素为抗原免疫小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合并筛选出阳性单克隆杂交瘤细胞株,接种至小鼠腹腔,培养后抽取腹水并用正辛酸-硫酸铵纯化法进行纯化,从而获得抗产气荚膜梭菌β毒素单克隆抗体。该单克隆抗体经特异性试验,能与天然β毒素及重组β毒素发生特异性反应,且效价较高,为进一步建立快速有效的临床检测技术奠定了基础。     

一起羊黑疫的病原分离诊断及毒株产毒性能分析

利用厌氧菌实验室常规检测方法从一例送检病死羊肾脏培养物中分离到一株梭杆菌。通过形态学观察、动物实验、血清中和及胰酶破坏试验,确定分离病原菌为B型诺维氏梭菌。用自行设计的诺维氏梭菌α毒素特异性引物对纯培养物进行PCR扩增检测,PCR扩增得到大小为530bp的目的条带,与常规诊断结果一致;对分离的野生毒株的产毒能力进行了测定分析,野毒分离株在自制的VF厌气肝汤中的产毒能力达4000 MLD/mL,证明该菌株具备生产羊黑疫疫苗用株的潜力。     

鸭疫里默氏杆菌GroEL蛋白的原核表达和单克隆抗体制备

本试验旨在研制鸭疫里默氏杆菌GroEL蛋白的单克隆抗体。将鸭疫里默氏杆菌WJ4菌株的groEL基因进行原核表达,重组蛋白经过纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠。经过3次免疫后,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,用间接ELISA筛选阳性细胞株并进行3次亚克隆后制备小鼠腹水单克隆抗体。共获得2株稳定分泌鸭疫里默氏杆菌GroEL单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1G2B6和1G2F10。2株单克隆抗体均为IgG1亚类。腹水单克隆抗体ELISA效价达到1:102 400。Western blot检测结果表明2株单克隆抗体均能与鸭疫里默氏杆菌血清1、2和10型菌株发生特异性结合,而与禽致病性大肠杆菌、沙门氏菌和禽巴氏杆菌菌株无反应性。本研究成功制备了稳定性好、特异性强的鸭疫里默氏杆菌GroEL单克隆抗体,为进一步研制基于抗体检测鸭疫里默氏杆菌抗原的试剂盒奠定了基础。     

羊梭菌性疾病的诊治和体会

正绵羊梭菌性疾病是由梭状芽孢杆菌属中的细菌所引起的一种急性、中毒性传染病。其中包括羊快疫、羊黑疫、羊猝狙、羊肠毒血症等。这类疾病的临床症状有很多相似之处,具有突然发病,病程短而快,常不显示任何症状就突然死亡,且死亡率极高等特点。临床上把这类羊的疾病统称为羊梭菌性疾病。1病原羊梭菌主要由诺维氏梭菌(羊黑疫)、腐败梭菌(羊快疫)、产气荚膜梭菌(羊猝狙、羊肠毒血症)等感染所致,这些     

抗山羊痘病毒P32蛋白杂交瘤细胞的构建及其单克隆抗体的制备

本研究旨在以纯化的山羊痘病毒P32蛋白为免疫原,构建杂交瘤细胞株,制备P32蛋白单克隆抗体。用纯化的P32蛋白免疫BALB/C小鼠后,按常规方法进行细胞融合,构建抗山羊痘病毒P32蛋白的杂交瘤细胞,制备P32蛋白单克隆抗体,获得4株能识别重组蛋白且特异性强无交叉反应的杂交瘤细胞株,腹水抗体效价均在105以上。山羊痘病毒P32蛋白杂交瘤细胞株的构建及单克隆抗体的制备为进一步开展检测方法研究提供了材料。     

腐败梭菌α毒素蛋白单克隆抗体制备

将腐败梭菌参考株增殖、鉴定,使用饱和硫酸铵沉淀法粗提腐败梭菌天然α毒素,并通过SDS-PAGE方法对其进行检测。将扩增的α毒素目的片段和经酶切的p ET-21a（+）载体同源重组,将构建好的重组质粒转入到BL21(DE3)感受态细胞中,并筛选阳性克隆株。在优化的表达条件下,对α毒素重组蛋白进行了大规模的表达。免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用间接ELISA方法进行阳性杂交瘤细胞筛选。制备及纯化腹水,进行效价、浓度、纯度及特异性测定。结果表明,本研究成功表达了可溶性腐败梭菌α毒素蛋白,大小约为46 kDa,筛选出的单抗3 E8和单抗6B12对重组蛋白效价检测结果均为1:256 000,对天然α毒素的效价检测结果均为1:128 000;纯度均已达到85%以上;单克隆抗体的浓度分别为3E8:2.27 mg/ml,6B12:1.96 mg/ml;均能够与腐败梭菌重组α毒素、天然α毒素特异性结合,而与产气荚膜梭菌α毒素无交叉反应。结论：得到特异性强、稳定性高的单抗3E8和单抗6B12,有助于腐败梭菌病的早期诊断及研究。     

猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体制备与鉴定

为获得猪伪狂犬病毒(PRV)gE蛋白单克隆抗体,选择原核表达的重组gE蛋白免疫6周龄BALB/c雌性小鼠,将其脾细胞与SP2/0进行融合,经间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,结果获得了2株能稳定分泌抗PRV gE蛋白的杂交瘤细胞,命名为E3B8和E5C11。间接ELISA检测2株杂交瘤细胞的培养上清液抗体效价为1∶6.4×10~3,腹水的抗体效价分别达到1∶3.28×10~6和1∶6.55×10~6。2株杂交瘤细胞的染色体数分别为105和108。E3B8亚类鉴定重链为IgG1,轻链为κ链;E5C11亚类鉴定重链为IgG2b,轻链为κ链。Western blot检测显示2株单克隆抗体腹水均能与PRV重组gE蛋白发生特异性反应,间接免疫荧光试验(IFA)检测显示2株单克隆抗体均能与PRV分离毒株感染的BHK-21细胞发生特异性反应,交叉反应性检测显示2株单克隆抗体与常见病毒不发生交叉反应。表明制备的2株gE蛋白单克隆抗体效价高、特异性强,为gE蛋白结构与功能分析以及PRV免疫诊断试剂盒的开发奠定了基础。     

H5N1禽流感病毒PB1-F2特异性单克隆抗体的制备与鉴定

以重组的H5N1亚型禽流感病毒(AIV)PB1-F2的C端蛋白(cPB1-F2)为免疫原制备单克隆抗体,并鉴定其特异性。构建cPB1-F2的pGEX-6p-1原核表达载体,进行蛋白表达与纯化;采用杂交瘤技术制备筛选抗重组cPB1-F2蛋白的杂交瘤细胞株,利用间接免疫荧光和酶联免疫吸附试验筛选鉴定阳性细胞株,并对单克隆抗体特异性进行鉴定。结果显示,纯化的重组cPB1-F2蛋白具有良好的免疫原性,筛选获得了3株稳定分泌抗cPB1-F2单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为6F4、2C5和4D3,经鉴定抗体均为IgG1亚类,且3株单克隆抗体均能特异性识别重组PB1-F2蛋白。结果表明成功制备了cPB1-F2特异性单克隆抗体,为研制针对流感病毒的抗体药物奠定了基础。     

短裸甲藻毒素单克隆抗体的制备及其鉴定

采用混合酸酐法将短裸甲藻毒素(brevetoxins,BTX)分别与卵清蛋白(OVA)和牛血清蛋白(BSA)偶联制备人工抗原。以BTX-BSA作为免疫抗原免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合-ELISA筛选抗短裸甲藻毒素的单克隆抗体,并对其特异性和灵敏性进行了鉴定。结果获得了1株可分泌短裸甲藻毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株3B4,该株杂交瘤细胞腹水抗体效价达10-5,与其他类似物没有交叉反应。该抗体为建立短裸甲藻毒素免疫学检测方法奠定了基础。     

鸭疫里默氏杆菌pfs基因的克隆表达及单克隆抗体制备

将鸭疫里默氏杆菌的pfs基因进行原核表达,重组蛋白经纯化后作为抗原免疫BALB/c小鼠。经过3次免疫后,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,利用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株。通过间接ELISA法测定腹水效价、Western blot法检测其免疫反应性,并鉴定抗体的亚型。重组蛋白SDS-PAGE检测结果验证得到26 k Da Pfs蛋白,免疫小鼠后最终获得1株阳性杂交瘤细胞株,命名为2E2E6,为Ig G1亚类,间接ELISA法检测腹水效价为1:64 000。Western blot结果表明制备的单克隆抗体具有良好的免疫反应性。本研究成功制备了Pfs的单克隆抗体,为进一步研究Pfs在鸭疫里默氏杆菌中的作用提供了参考。     

小反刍兽疫病毒核蛋白单克隆抗体的制备与初步应用

针对小反刍兽疫病毒核蛋白制备特异性的单克隆抗体,并对其进行生物学特性鉴定和初步应用。以纯化的Bacmid-PPRV-N重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的致敏脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在PEG作用下融合,获得单克隆抗体,并通过染色体技术等方法研究其生物学特性,将其作为竞争单抗,Bacmid-PPRV-N重组蛋白作为检测抗原建立竞争ELISA检测方法。结果表明:经克隆和间接ELISA筛选,获得了2株能稳定分泌抗小反刍兽疫病毒N蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为5B11和3H10-3B8。生物学特性鉴定试验表明:5B11和3H10-3B8抗体类型和亚类均为IgG2b;5B11单抗腹水的效价达1∶819 200,3H10-3B8达1∶12 800;血清学试验证明2株单抗均能与Bacmid-PPRV-N重组蛋白抗原结合,具有高度的特异性;相加ELISA试验结果显示,5B11和3H10-3B8 2株单克隆抗体分别识别N蛋白上不同的抗原位点;2株杂交瘤细胞的染色体均为99～104。应用建立的c-ELISA检测方法对222份血清样品进行PPRV抗体的检测,与参考试剂盒比较得到98.20%的符合率。本研究获得了2株能稳定分泌抗PPRV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,以单抗5B11作为竞争抗体建立了PPRV的c-ELISA检测方法。     

弓形虫卵囊壁蛋白OWP1的重组表达和特异性单克隆抗体制备

为研究制备弓形虫卵囊壁蛋白和特异性单克隆抗体,以弓形虫弱毒株ME49株DNA为模板,应用PCR技术扩增卵囊壁蛋白OWP1基因,将其克隆至原核表达载体构建重组表达质粒p ET-28a-OWP1,经过IPTG诱导表达和His纯化树脂纯化重组蛋白His-OWP1。重组蛋白His-OWP1作为免疫原,免疫7周龄雌性BALB/c小鼠,重组蛋白GST-OWP1作为检测筛选抗原,应用淋巴细胞杂交瘤技术制备弓形虫卵囊壁蛋白OWP1的单克隆抗体。结果表明,获得2株稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株(4A2和2C10)。Western blot结果表明研究制备的单克隆抗体能够识别重组表达蛋白。制备获得的2株稳定性好、效价高的单克隆抗体,可为今后研究特异敏感的弓形虫病血清学检测方法提供材料。     

基于地方分离B型诺维氏梭菌的产毒试验及羊羔疫菌苗的研制

以分离自青海省海晏县病死羊脏内的一株B型诺维氏梭菌株为研究对象,通过不同培养基、不同p H及不同培养时间等进行产毒比较试验证明,该菌在含1.0%葡萄糖培养基,p H 8.0~8.4,37℃培养72h产毒达最高点,平均可达2万MLD/m L,最高可达4万MLD/m L;利用该菌株制成羊黑疫单价疫苗,并以标准菌株菌苗作为对照,完成了家兔免疫攻毒、血清抗体测定;羊免疫血清抗体测定及高免血清的制备等试验。试验结果表明,该疫苗0.1m L免疫家兔21d,可抵抗200MLD(家兔最小致死量)毒素的攻击,是现用疫苗的2倍,0.1m L家兔免疫血清可中和300MLD(小白鼠最小致死量)的毒素,是现用疫苗的3倍,羊免疫14d,血清0.1m L可中和400 MLD(小白鼠最小致死量)的毒素,180d时血清0.1m L可中和50MLD的毒素,用此疫苗免疫家兔制备的抗血清每m L可中和160000MLD毒素。该菌株在筛选的培养基上具有良好的产毒性能,制备的羊黑疫疫苗免疫效果明显优于标准菌株菌苗,可作为羊黑疫疫苗生产用菌株。     

鸡源志贺菌IpaC蛋白单抗制备及其受体的初步鉴定

为制备特异性的鸡源志贺菌IpaC蛋白单克隆抗体和鉴定其受体,以纯化的重组鸡源志贺菌IpaC蛋白制备多克隆抗体,Western blot和间接ELISA分析表明重组IpaC蛋白具有很好的免疫反应原性。将纯化的IpaC蛋白免疫BALB/c小鼠,通过淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体。经过杂交瘤细胞阳性孔的筛选、单克隆抗体效价测定、单克隆抗体亚型鉴定、单克隆抗体Western blot鉴定后,获得1株杂交瘤阳性细胞5A12B5。同时,通过鸡胚肠组织提取总蛋白,利用铺覆蛋白印迹技术,初步测定IpaC蛋白受体相对分子质量约为55 000。试验为IpaC蛋白检测和该蛋白与鸡肠上皮细胞之间的相互作用研究奠定基础,同时也为评估鸡源志贺菌在公共卫生等方面的重要性提供参考依据。     

禽流感病毒NP蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为了制备H5N6亚型禽流感病毒(AIV)的单克隆抗体(MAb),采用纯化的H5N6 AIV免疫BALB/c鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA方法进行筛选,获得2株能稳定分泌抗NP蛋白的杂交瘤细胞,分别命名为3D9和2B10。间接ELISA检测2株杂交瘤细胞培养上清液抗体效价分别为1∶1×10~3和1∶1×10~4,腹水的抗体效价分别达到1∶1×10~5和1∶1×10~6; 3D9和2B10亚类鉴定重链为IgM,轻链为κ链; Western blot分析表明,2株杂交瘤细胞上清均能与不同的AIV感染的尿囊液在56 kD处发生特异性反应,并能与原核表达的重组NP蛋白发生特异性反应;间接免疫荧光试验显示,2株单克隆抗体均能与不同的AIV感染的MDCK细胞产生特异性反应。以上结果表明,本研究针对H5N6 AIV的NP蛋白制备了2株单克隆抗体,且都具有较好的特异性、保守性和广谱性,为今后禽流感诊断方法的开发奠定了基础。