牛支原体的环介导等温扩增快速检测技术研究

牛支原体(Mycoplasma bovis是感染牛的一种重要的致病性病原体.本研究利用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术建立了牛支原体的快速检测方法.该方法以牛支原体保守性基因uvrC为靶序列设计了5条特异引物,在58℃等温条件下,60 min即可完成反应.LAMP方法能检测出20 pg牛支原体DNA,较PCR方法高100倍,用牛鼻支原体(M.bovirhinis)、无乳支原体(M.agalactiae)、精氨酸支原体(M.ariginini)、牛副流感病毒(BPIV)、牛腺病毒(BADV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)作特异性检测,两种方法均有很高的特异性.本研究还将荧光显色剂钙黄绿素(calcein)和Mn2+用于LAMP反应结果的可视化检测.临床鼻拭子样品煮沸后,可直接进行等温扩增,省去了DNA提取步骤.在对167个临床鼻拭子样本的检测中,LAMP方法检测结果阳性率(26.95％)高于PCR方法检测出阳性率(19.16％),这证明本研究所建立的方法,与PCR法比较更适于临床样品的检测.研究结果表明,LAMP方法具有操作简便、快速、高效、敏感、特异、经济等特点,适于基层实验室监测的广泛使用.     

环介导等温扩增技术快速诊断猪肺炎支原体

利用环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）方法建立了猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoinae）的快速检测方法。该方法以猪肺炎支原体保守性基因16SrRNA为靶序列设计了6条特异引物,在63℃等温条件下,30min即可完成反应。结果显示,LAMP技术优于PCR技术。在敏感性实验中,LAMP方法的能检测出10个包含靶基因片段的重组质粒,敏感性高于PCR方法10倍;特异性实验中,LAMP方法和PCR方法均显示出了高度的特异性;在对127个临床鼻拭子样本的检测中,LAMP方法检测结果是所有样本都为阳性,而PCR检测出了116份阳性。证明本研究所建立的方法,对临床样本的检测的敏感度高于常规的PCR法。LAMP方法具有操作简便、快速、高效、敏感、特异、经济的特点,在研究机构以及基层实验室、现场监测的广泛使用具有一定的潜力。     

山茶根结线虫的LAMP-LFD快速检测方法

为了提高检测效率,本研究利用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)扩增核酸,用横向流动试纸条(lateral flow dipstick,LFD)检测产物,建立了一种山茶根结线虫(Meloidogyne camelliae)的LAMP-LFD快速检测新技术.以山茶根结线虫核糖体DNA内转录间隔区(ribosomal DNA-intemal transcribed spacer,rDNA-ITS)为检测靶标,设计3对特异性引物进行生物素标记的实时荧光LAMP反应,优化后的LAMP扩增条件为63℃反应15 min.比较LFD、实时荧光曲线以及琼脂糖凝胶电泳等3种产物检测方法,结果表明,LAMP产物与异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的探针ITS-HP杂交5 min后即可在LFD上显色,从LAMP反应开始到LFD结果判断仅需25min,比常规PCR技术缩短约2h.LAMP-LFD技术能特异性地检测山茶根结线虫,对其基因组DNA的检测灵敏度为4 pg/μL,低于常规PCR方法100倍;对其单条2龄幼虫(J2)检测灵敏度为1/1 000条线虫.本研究建立的快速、灵敏、特异性LAMP-LFD检测技术可应用于山茶根结线虫的口岸检验.     

金属络合剂酸性络蓝K在TNOS-LAMP可视化检测体系中的应用

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种快速、灵敏度高和特异性强的等温核酸扩增技术,已被广泛用于各领域.与此同时,高灵敏度也使得扩增时极易出现交叉污染,而利用闭管检测技术能有效降低其污染机率.本研究引入了一种新型的金属指示剂-酸性络蓝K (acid chrome blueK,ACBK),建立了闭管LAMP扩增和检测结果可视化检测技术.首先,本研究分别在LAMP 扩增的起始体系中,先后分别测试ACBK与缓冲液、dNTPs、引物和Mg2+等组分反应,确定了含有ACBK的LAMP体系中的颜色变化由Mg2+决定,化学方法也进一步验证了这一结论.随后,对LAMP检测体系中的ACBK指示剂的浓度及Mg2+的浓度进行了选择和优化,最终选定25 μL扩增体系中ACBK的检测浓度为:2 μL 0.04％ ACBK,Mg2+浓度为:6 mmol/L.以胭脂碱合成酶基因终止子(terminator of nopaline synthase gene,TNOS)为靶基因,建立了TNOS-ACBK-LAMP检测体系.建立的体系的检测灵敏度针对转基因水稻的检测限为100拷贝,在分别含有50 ng的水稻(Oryza sativa)、大豆(Glycine max)、油菜(Brassica napus)和玉米(Zea mays)基因组中能检测出0.1％的转基因含量.同时,利用不同转化事件及不同作物的转基因材料验证了其检测特异性,结果表明,构建的TNOS-ACBK-LAMP的检测系统具有很强的检测特异性.最终,将该检测体系成功用于对实际玉米样品转基因成分的检测,检测结果既可以裸眼直接判断也可以借助紫外可见光谱分析.该方法的建立为可以加快转基因成分检测的速度,同时也为等温扩增方法的判断提供了新的思路.     

荔枝霜疫霉巢式PCR和LAMP检测方法的建立

由荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii)引起的荔枝霜疫霉病是荔枝(Litchi chinensis)生产上的重要病害,建立霜疫霉快速准确检测方法,对于该病的早期诊断和及时防控至关重要.本研究以荔枝霜疫霉三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白基因(GTP-binding protein gene,Ypt1)为靶序列,设计特异性引物,建立了巢式PCR和环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)两种检测方法,并进行特异性和灵敏度验证.特异性检测表明,只有不同来源的21个荔枝霜疫霉菌株经PCR扩增获得249 bp的特异性条带,同时,在钙黄绿素指示剂的作用下,LAMP检测显示绿色,且扩增产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳出现特有的梯形条带,而其他13种不同卵菌近缘种及8种常见病原真菌42个菌株均未观察到这些现象.灵敏度检测显示,将特异引物PvYF1/PvYR1与疫霉属Yptl通用引物Yph1F/Yph2R进行巢式PCR扩增后,其检测灵敏度在DNA水平上可达100fg/25 μL,较常规PCR提高1 000倍,而LAMP方法检测灵敏度是巢式PCR的10倍.本研究分别采用常规PCR、巢式PCR和LAMP方法对采集自福建省荔枝霜疫霉病典型症状及可疑症状的荔枝叶片或果实进行检测,并用传统分离方法进行验证.结果表明,在漳州采集的30份样品中,常规PCR、巢式PCR和LAMP方法的阳性检出率分别为17/22(77.3％)、20/22(90.9％)和21/22(95.5％);在莆田采集的25份样品中,常规PCR、巢式PCR和LAMP方法的阳性检出率分别为15/17(88.2％)、16/17(94.1％)、17/17(100％).可见LAMP方法明显提高了检测效率,并且具有检测程序便捷,所需设备简单和肉眼能判断结果的优势,适合基层部门及田间荔枝霜疫霉快速检测.     

环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测转基因玉米LY038

为了施行对转基因作物的监管,许多国家和机构制定了转基因标识制度的相关条例,因此建立针对转基因产品的检测方法是十分必要的.本研究运用环介导等温扩增技术(LAMP)建立了对转基因玉米(Zea mays L.) LY038外源基因的快速检测技术,该方法依据cordapA基因的序列设计了4条特异性引物,结果表明,引物特异性良好,该检测体系在63℃恒定温度下,反应50 min,可检测到0.01％的样本,是常规PCR方法的5倍.该检测方法具有高度的特异性、灵敏性和稳定性,该方法不需要特殊仪器、快速简便,在基层和现场检测中有很好的应用前景.     

环介导等温扩增联合横向流动试纸条可视化检测海豚链球菌方法的建立

海豚链球菌(Streptococcus iniae)是一种革兰氏阳性球菌,呈β溶血,可感染多种淡水和海洋鱼类。本研究利用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)进行核酸扩增,通过横向流动试纸条方法 (lateral flow dipstick,LFD)实现检测,建立了一种可应用于海豚链球菌快速检测的LAMP-LFD技术。该技术以海豚链球菌促旋酶B亚单位(gyrase subunit B,gyr B)基因为检测靶标,设计3对引物进行由生物素标记的LAMP扩增反应,产物经异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的探针杂交后,在LFD上完成检测。经优化的核酸扩增最适条件为65℃反应30 min,在此条件下,阳性扩增起始时间与模板浓度之间呈典型的线性相关性。从核酸扩增反应开始到LFD显色,整个检测时程只需40 min左右,比常规PCR技术缩短约2 h。LAMP-LFD能特异性地检出海豚链球菌,针对病原纯培养物的检测灵敏度为8.70×101cfu/m L,是LAMP检测的10倍、常规PCR检测的100倍。以灵敏度浓度(8.70×101cfu/m L)的海豚链球菌基因组DNA为模板进行的LAMP-LFD结果显示该方法具有良好的重复性。针对人工污染花鲈(Lateolabrax japonicus)肝组织的检测灵敏度为4.35×103cfu/m L,同样为常规PCR检测方法的100倍。利用本方法可成功从患病花鲈的组织样品中检测出海豚链球菌,检测结果与常规的细菌分离鉴定方法结果一致。因此,利用LAMP-LFD能特异、准确、高效地检测出海豚链球菌,而且操作简单、费用低、耗时短,有望成为海豚链球菌的常规检测方法。     

猪胸膜肺炎放线杆菌环介导等温扩增检测方法的建立与应用

本文建立了敏感、特异的胸膜肺炎放线杆菌环介导等温扩增检测方法。以1型胸膜肺炎放线杆菌ApxIV基因片段为靶序列设计了一组引物,并建立了LAMP反应体系,在63℃等温条件下反应45min,最低能检测到102个拷贝的目的基因,敏感性是PCR方法的10倍。通过对1～10型胸膜肺炎放线杆菌、多杀巴氏杆菌、链球菌、支原体等18种病原微生物的检测,证明该法具有很强的种特异性。另外,通过对8头实验感染猪和127份临床发病猪的鼻拭子的检测发现,该法对鼻拭子中胸膜肺炎放线杆菌的检出率为100%,优于PCR方法。     

环介导恒温扩增技术快速检测对虾白斑综合征病毒方法的建立

DNA环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是一种特异、灵敏、快速的新型基因检测技术,其检测结果可以通过琼脂糖凝胶电泳观察,也可以通过加入核酸染料SYBR GreenⅠ进行肉眼观察。本研究根据对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)的结构蛋白VP26基因序列,设计一套引物,成功建立了针对WSSV的LAMP检测方法。应用该方法,在65℃温育1h的条件下快速扩增病毒基因组DNA,琼脂糖凝胶电泳得到特异性梯度条带;在反应体系中添加SYBR GreenⅠ染料后,可通过肉眼观察有无荧光直接判定结果。该研究建立的LAMP法能特异性检出WSSV,其检测下限比PCR法低一个数量级,相当于0.563pg/μL的质粒(pMD19-T-VP26)浓度。表明所建立的WSSV LAMP检测法特异性好、灵敏度高、操作简单方便,有望作为WSSV快速诊断的常规方法。     

环介导等温扩增技术快速检测大西洋鲑的研究

为探究环等温扩增技术(LAMP)在鲑科鱼类物种鉴定方面的应用,以大西洋鲑为研究对象,针对其线粒体CR区段设计特异性的LAMP引物,并通过单因素试验和正交试验研究反应体系中d NTP Mix、Mg~(2+)、甜菜碱终浓度对LAMP扩增结果的影响。结果表明,大西洋鲑LAMP扩增的最优条件为:引物SS-CR-F3/SS-CR-B3各0.2 m M,SS-CR-FIP/SS-CR-BIP各1.6 m M,dNTP Mix 1.4 m M,Mg~(2+)6 m M,甜菜碱0.8M,Bst DNA聚合酶8 U,扩增温度为65℃,反应时间60 min。在此条件下LAMP扩增产物电泳检测特异性强、稳定性好,对大西洋鲑DNA的检出限达0.01 ng·μL~(-1),并可对混合样本进行检测。本研究结果为大西洋鲑快速物种鉴定提供了一种重要技术手段,该技术可应用于鲑科鱼类物种鉴别的日常检验检疫和市场监管工作中。     

Specific detection of Type 1 and Type 2 isolates of Pyrenochaeta lycopersici by loop-mediated isothermal amplification reaction

Pyrenochaeta lycopersici is the causal agent of corky root, an important soilborne disease of tomato (Lycopersicon esculentum) and other solanaceous crops. P. lycopersici isolates are classified into Types 1 and 2 on the basis of several physiological and molecular features. In this study, we aimed to establish a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method to identify Types 1 and 2 isolates. Using specific LAMP primer sets for Types 1 and 2, both types were easily identified within 35 min. The LAMP method demonstrated equal sensitivity to the polymerase chain reaction in molecular identification of the pathogen in cultured mycelia, infested plant roots, and their surrounding soil. The LAMP technology will contribute to the detection and identification of the pathogen, crop protection, and thorough understanding about the ecology of corky root disease of tomato.     

Comparison of three DNA extraction methods for feed products and four amplification methods for the 5'-junction fragment of Roundup Ready soybean

Three methods of DNA extraction from feed products and four detection methods for the 5'-junction fragment of genetically modified (GM) Roundup Ready soybean (RRS) were compared and evaluated. The DNA extraction methods, including cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), sodium dodecyl sulfate (SDS), and guanidine hydrochloride (Kit), were assessed for their yields and purity of DNA, extraction time, and reagent cost. The DNA yields of CTAB, SDS, and Kit were 52-694, 164-1750 and 23-105 ng/mg sample, and their extraction time was 2.5-3, 2-2.5, and 1.5-2 h with reagent cost about US dollar 0.24, 0.13, and 1.9 per extraction, respectively. The SDS method was generally well suited to all kinds of feed matrices tested. The limits of detection for the four amplification protocols, including loop-mediated isothermal amplification (LAMP), hyperbranched rolling circle amplification (HRCA), conventional polymerase chain reaction (PCR), and real-time PCR, were 48.5, 4.85, 485, and 9 copies of the pTLH10 plasmid, respectively. The ranked results of the four detection methods were based on multiattribute utility theory as follows (from best to worse): HRCA, LAMP, PCR, and real-time PCR. This comparative evaluation was specifically useful for selection of a highly efficient DNA extraction or amplification method for detecting different GM ingredients.     

利用环介导等温扩增技术快速检测水产品中的副溶血弧菌

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种重要的食源性致病菌。首次将环介导等温扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP）应用于副溶血弧菌的快速检测。针对副溶血弧菌不耐热溶血毒素基因（tlh）设计四条特异性引物,建立了副溶血弧菌LAMP检测方法,1 h即可完成。对12种细菌共28株菌进行LAMP扩增,仅副溶血弧菌得到阳性结果,证明引物具有很高的特异性;副溶血弧菌基因组DNA和纯培养物的检测灵敏度分别为90 fg/LAMP反应体系和24 cfu/mL,对模拟食品样品进行直接检测,检测限为89 cfu/g;对40份水产样品进行检测,8份副溶血弧菌LAMP阳性,其中6份传统培养阳性。本研究表明,该方法检测副溶血弧菌特异性强、灵敏度高,并且操作简便、快捷、检测成本低,有望发展成为快速检测副溶血弧菌的有效手段。     

Development of the visual loop-mediated isothermal amplification assays for seven genetically modified maize events and their application in practical samples analysis

As more and more genetically modified (GM) crops are approved for commercialization and planting, the development of quick and on-spot methods for GM crops and their derivates is required. Herein, we established the polymerase chain reaction and agarose gel electrophoresis-free system for the identification of seven GM maize events (DAS-59122-7, T25, BT176, TC1507, MON810, BT11, and MON863) employing a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technique. The LAMP assay was performed using a set of four specific primers at 60-65 °C in less than 40 min, and the results were observed by direct visual observation. In these developed assays, the specificity targeted at each GM maize event based on the event-specific sequence was well confirmed, and the limits of detection were as low as four copies of maize haploid genomic DNA with an exception of 40 copies for MON810 assay. Furthermore, these developed assays were successfully used to test six practical samples with different GM maize events and contents (ranged from 0.0 to 2.0%). All of the results indicated that the established event-specific visual LAMP assays are more convenient, rapid, and low-cost for GM maize routine analysis.     

环介导等温扩增技术及其在水生动物病毒检测中的应用

水产养殖已成为国民经济重要组成部分,但经常受到水生动物病毒的困扰。相关病毒病原的检测已成为水生动物病原研究的热点之一。环介导等温扩增技术具有高特异性和灵敏度,并且扩增时间短,对仪器的要求较低,已广泛应用于水生动物病毒的检测中。本文从环介导等温扩增技术中引物的设计,扩增反应过程及反应产物的检测三个方面来阐述其基本原理,并综述了其在水生动物虹彩病毒、弹状病毒、呼肠孤病毒、疱疹病毒及对虾病毒检测中的应用,最后对其技术和应用上的发展前景进行了展望,以期为水生动物病毒检测相关研究提供参考。     

利用侧流核酸试纸条快速检测非洲猪瘟病毒

为满足基层普通实验室或养殖场等资源有限的实验室对非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的检测需求,该研究开发了一种简单、快速、低成本的检测技术,可以用肉眼观察检测结果。研究将传统聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)与胶体金试纸条技术结合,开发一种低成本的侧流核酸测定试纸条(lateral flow nucleic acid assay,LFNAA)。该体系设计了独特的尾引物,避免了传统核酸试纸条的半抗原标记及抗体的使用。经过PCR扩增后产生一端带着单链寡核苷酸尾巴的双链DNA产物,能够与胶体金标记的寡核苷酸捕获探针结合,从而在试纸条上形成可以用肉眼观察的目标产物。该LFNAA试纸条能够在猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CFSV)、猪瘟病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪圆环病毒1型(Porcine circovirus 1,PCV1)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)、猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus virus,PPV)中特异的鉴定出ASFV的存在,其灵敏度与琼脂糖凝胶电泳的分析结果一致,均能达到103 copies/μL。因此,仅需要一台普通PCR仪,即可对ASFV进行快速灵敏的鉴定(<2 h),其低成本、操作简便的特点非常适合资源有限的实验室中非专业人员的操作。此外,该技术可进一步结合等温扩增技术,能够在食品安全和医学诊断中实现更快更简便的现场检测。     

SPE-UPLC-MS/MS测定葡萄酒中的高氯酸盐

为建立前处理简单、定量准确、灵敏度高的葡萄酒中高氯酸盐的快速测定和分析方法,本研究使用酸化甲醇提取葡萄酒样品,最终选择WAX固相萃取柱前处理净化,亲水性聚丙烯滤膜(GHP)过滤,经Phenyl-Hexyl色谱柱分离,以电喷雾离子源(ESI)在多反应监测(MRM)负离子模式下测定葡萄酒中高氯酸盐。结果表明,该方法的检测时间为12 min,检出限和定量限分别为0.15 μg·L^-1和0.5 μg·L^-1,在1、2、5、10和20 μg·L^-1水平的加标回收率介于94.5%~105%之间,相对标准偏差(RSD)小于3.17%。该方法的建立可为葡萄酒生产企业和相关监管部门提供一定的技术支撑。