甘蓝S-位点受体激酶（SRK）激酶结构域编码区分子特性及其与类硫氧还蛋白（THL1）相互作用检测

以甘蓝(Brassica oleracea L)E1为材料,采用PCR和RT-PCR技术,扩增S-位点受体激酶(SRK)激酶结构域(SRKE1)基因组DNA和cDNA序列,得到片段长度分别为1711和1 241 bp.序列分析表明,该基因组DNA序列由5个内含子和6个外显子组成,编码407个氨基酸;将sRKE1编码序列克隆到原核表达质粒pET43.1和真核表达质粒pPIC9K中,分别在表达宿主菌大肠杆菌(Eschedchia coli)BL21和毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中进行表达.利用表达的类硫氧还蛋白(THL1)与SRKE1孵育,结果显示SRKE1可与THL1结合并形成稳定的复合体.     

甘蓝两种单倍型S-位点受体激酶胞外结构域(eSRK)和S-位点半胱氨酸富集蛋白(SCR)基因的克隆及其相互作用特异性检测

S-位点受体激酶(SRK)和S-位点半胱氨酸富集蛋白(SCR)是自交不亲和反应中雌、雄性决定因子,两者是受体与配体关系,相互作用具有单倍型特异性。为建立适于SRK与SCR单倍型特异性识别及作用机理研究的技术体系,本研究以甘蓝(Brassica oleracea L.)高代自交系E、F为材料,首先,采用亲和指数法测定两种材料的亲和性,结果表明,E、F为强自交不亲和系,两者间异交亲和;其次,从E、F材料gDNA中扩增eSRKE、eSRKF、SCRE和SCRF基因编码序列,同源比对表明,E为S28单倍型、F为S7单倍型;再次,利用酵母双杂交Gold系统检测eSRKE、eSRKF和SCRE、SCRF间的相互作用,结果显示,eSRKE与SCRE、eSRKF与SCRF之间作用,eSRKE与SCRF、eSRKF与SCRE之间不能作用,这与利用亲和指数法检测的结果完全一致。研究结果建立了为进一步探索SCR与SRK的识别与作用机理的技术体系。     

甘蓝S位点受体激酶基因（SRK）编码区的甲基化分析

克隆了位于自交不亲和型甘蓝(Brassica oleracea)S位点受体激酶基因(SRK)上第一编码区中包含两个CCGG位点的目的片段,通过甲基化敏感限制性内切酶-PCR法,利用对甲基化敏感性不同的Msp Ⅰ和HpaⅡ分别对柱头乳突和花药基因组DNA及其PCR产物进行交叉组合式的酶切与电泳,首次对SRK基因编码区的特定DNA区段进行了甲基化分析.使用相同的SRK基因特异性引物时,柱头乳突和花药基因组DNA作为模板均可以扩增出清晰目标谱带,且目标谱带经Msp Ⅰ/Hpa Ⅱ完全酶切后可产生预期的谱带类型;而经Msp Ⅰ/Hpa Ⅱ完全酶切后的此二基因组DNA再作为模板进行PCR,均无特异性的目标谱带扩出.这些结果初步表明,自交不亲和型甘蓝花粉的SRK基因可能不存在甲基化封闭.     

大白菜-结球甘蓝易位系AT4系列抽薹相关基因表达差异的cDNA-AFLP分析

抽薹开花时间是大白菜(Brassica rapa ssp.pekinensis)的重要性状,未熟抽薹直接影响大白菜的产量和品质.本研究以添加结球甘蓝(Brassica oleracea var.capitata)4号染色体片段的大白菜-结球甘蓝易位系AT4系列为材料,结合抽薹性鉴定,获得了45株耐抽薹和15株易抽薹植株;利用cDNA-扩增片段长度多态性(cDNA-amplified fragment length polymorphism,cDNA-AFLP)技术,对不同春化处理的耐抽薹和易抽薹植株叶片差异表达片段进行分离,获得了126条与抽薹性相关的差异表达条带,这些差异包括条带的有无和表达量的差异;通过差异条带回收、克隆和测序,获得了74条差异表达序列.同源性比对结果表明,61条差异表达序列具有同源序列,其中41条差异表达序列功能预测涉及代谢、能量、细胞物质运输、信号转导、表达调控、DNA修饰、细胞周期等,20条差异表达序列功能未知;13条在NCBI中找不到同源序列,可能是一些新基因.本研究获得了耐抽薹大白菜-结球甘蓝易位系,为耐抽薹大白菜新品种的培育提供新材料;同时获得了耐抽薹和易抽薹材料间的差异表达序列,为获得影响大白菜抽薹性的关键基因,揭示大白菜抽薹开花机制提供支撑.