ToMV番茄坏死株系农杆菌侵染性克隆构建及其表达

番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)是烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的典型成员,该病毒侵染严重影响农作物的产量和质量。ToMV-N5株系能引起番茄(Lycopersicon esculentum)主栽品种(合作903)系统性坏死,建立该株系的侵染性克隆体系是研究其致病机理的必要条件。本研究将ToMV-N5株系的基因组克隆至含35S启动子瞬时表达载体pCB301中,农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)浸润接种本氏烟(Nicotiana benthamiana)和番茄结果表明,农杆菌侵染性克隆pCB301-ToMV-N5引起本氏烟和番茄系统性坏死症状,与其病毒粒子摩擦接种所引起的症状相一致。以绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein,GFP)代替ToMV-N5的外壳蛋白基因(coat protein,CP)获得表达载体pCB301-ToMV-N5CP45GFP,病毒接种结果表明,ToMV-N5能高效表达GFP,在病毒浸润接种浓度(OD600)为0.002时,GFP也能够有效表达。pCB301-ToMV-N5CP45GFP缺失了CP基因使得病毒不能系统性侵染,将烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)U5株系包含CP大小为647 nt(nt 5 498~6 145)片段克隆到pCB301-ToMV-N5CP45GFP中,获得pCB301-ToMV-N5CP45GFP-CPU5,浸润接种本氏烟结果表明,病毒能长距离移动,在寄主非接种部位表达GFP;浸润及摩擦接种番茄结果表明,只能在显微镜下观察到微弱GFP,且局限于接种部位。本研究成功获得了ToMV-N5株系的农杆菌侵染性克隆及其表达载体,为研究该病毒侵染的分子机理提供了基础资料。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）BJ—4株全基因组序列测定与分析

在国内首次完成了猪繁殖与呼吸综合征病毒分离毒株的全基因组序列测定。用RT－PCR方法分段扩增出PRRSV北京地区分离株BJ－4株的21条cDNA片段，分别克隆于pGEM-T-easy质粒载体并进行测序，按顺序将这些序列进行拼接得到PRRSV BJ－4株全基因组cDNA序列。测序结果表明PRRSV BJ－4株基因组全长15504b，包含8个开放阅读框，5′端有190nt先导序列；3′端有256ntUTR，其中包括95ntPoly(A)尾。PRRSV BJ－4株与美洲型毒株VR－2332和Nebreska的核苷酸同源率分别为99．5％和98．4％，而与欧洲型代表株LV株的核苷酸同源率为62．5％，与另一国内分离株CH－1a株编码构蛋白基因的核苷酸同源率为93．3％。     

水稻黑条矮缩病毒基因组片段3全长cDNA的克隆及其序列分析

报道了水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarfvirus,RBSDV）基因组片段3（S3）的全序列。该基因组片段由3572个碱基对组成，其正链RNA的两末端具有与已报道的RBSCV S7－S10基因组片相同的保守序列5′－AAGUUUUU－－AGCNNNNGUC－3′，并在紧邻保守序列处有一片段特异性的8个碱基的反间重复序列。正链RNA只含一个长的开放阅读框，编码一个由1146个氨基酸组成的蛋白，推测其分子量为131.8kD。     

侵染云南白肋烟的中国番茄黄化曲叶病毒及伴随卫星DNA分子的基因组特征*

从中国云南省大理地区表现曲叶症状的白肋烟(Nicotina tabacum White Burley)上分离到病毒分离物Y43,该病毒可经烟粉虱(Bemisia tabaci)及嫁接传播。用15种粉虱传双生病毒的单抗对病样进行TAS-ELISA检测,结果表明,该病毒属菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)病毒。对DNA-A1.7kb基因组序列测定和分析表明,Y43与中国广西报道的中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato ycllow lcafcurl China virus,TYLCCNV)同源性达89％,其中外壳蛋白(CP)氨基酸同源性达96％,因此Y43应为TYLCCNV的一个新分离物。进一步研究发现,Y43还伴随着一个长l349nt的卫星DNA分子(DNAβ)。Y43 DNAβ与AYVV DNAβ、BYVMV DNAβ和CLCuV DNAβ的同源性较低,而与中国分离的烟草曲叶病毒Y5 DNAβ和Y8 DNAβ的亲缘关系较近。DNAβ可能编码7个分子量超过3．5kD的ORF,其中Cl推测为有功能的ORF。     

甜菜黑色焦枯病毒核酸特性,RNA2的cDNA克隆和部分序列分析

以感染甜菜黑色焦枯型病毒新疆及宁夏分离物的苋色藜为材料提纯病毒，提取其ＲＮＡ，经琼脂糖凝胶电泳后分别回收不同的ＲＮＡ组分，以不同组合接种苋色藜，证实新疆分离物ＲＮＡ１能单独侵染并复制，但ＲＮＡ２组分必须依赖ＲＮＡ１才能完成其侵染和复制过程。同时发现，宁夏分离物ＲＮＡ可以代替新疆分离物ＲＮＡ１支持ＲＮＡ２的复制。通过核酸酶保护试验和对ＢＢＳＶ新疆及宁夏分离物ｃＤＮＡ标记探针与两者的ＲＮＡ进行的Ｎｏｒ     

对虾白斑综合征病毒基因组片段的测序、亚克隆与表达

取对虾（Penaeid shrimp)白斑综合征病毒（WSSV）基因组DNA随机文库中1个约8kb的克隆片段进行测序，DNA序列用DNAstar软件进行分析，共发现43个100bp以上阅读框（ORF），其中1条链31个，互补链12个，用BLAST软件将43个ORF及其推导的氨基酸序列分别与GenBank中核酸蛋白数据序列进行相似性比较，结果无显著同源性。从白斑综合征病毒基因组的测序片段中，发现一个810bp阅读框，其编码氨基酸序列与海栖热袍菌（Thermotoga maritima) 外膜蛋白有24％的同源性，设计一对引物，扩增出该阅读框，用T载体克隆并按正确阅读框连接到E.coli表达载体pGEX-6p－1上。重组菌经IPTG诱导后，菌体SDS－PAGE显示有1条大小为56kD的融合表达蛋白产生。     

水稻草矮病毒基因组vRNA3 NS3基因的克隆、序列分析及原核表达

摘要: 根据RGSV(rice grassy stunt virus )-IR分离物的RNA3序列设计引物，采用RT-PCR技术扩增出RGSV-SX分离物的NS3基因，并进行序列测定及原核表达。结果表明，NS3基因由588个核苷酸组成，编码22.9 kD蛋白。构建了可在E. coli DH5α中表达的质粒pGTNS3，经IPTG诱导，SDS-PAGE分离纯化得到分子量为49.0 kD的GST-NS3融合蛋白，并制备抗血清。应用Western blot 分析寄主水稻(Oryza sativa)和介体昆虫体内NS3基因表达产物，仅在感病水稻植株中检测到NS3蛋白，而在提纯病毒、介体昆虫体内则未检测到。     

口蹄疫病毒3AB基因的克隆与原核表达

根据口蹄疫流行毒株设计一对包含3AB部分基因编码区的特异性引物,扩增出3AB基因550 bp的特异带,并将纯化的扩增产物克隆到pM D 18-T载体上。再用设计的酶切位点将3AB基因分别连接到两种原核表达载体上,构建了重组质粒pETCK S-3AB及pET 28a-3AB,转入BL 21菌中进行原核表达。SDS-PAGE电泳表明,3AB基因在两种表达系统中均高效表达。对表达的蛋白通过包涵体及切胶纯化的方法进行纯化,获得了高纯度的3AB蛋白。     

家蚕线粒体基因组全序列测定与分析

家蚕（Bombyx mori)线粒体基因组全序列为15664bp,AT含量较高，为81．3％，包括13个蛋白质编码基因，2个rRNA基因，22个tRNA基因 一段498bp的A＋T富集区域。与其它10种节肢动物线粒体基因组全序列相比，家蚕与果蝇（Drosophila melanogaster)在核苷酸组成，编码偏好性，以及氨基酸组成上较相近，只是在基因排列上，tRNA^Met的位置发生了重排，在家蚕线粒体基因组中，tRNA^Met位于A＋T富集区与tRNA^Ile之间，而在果蝇中，其位于tRNA^Tln与ND2基因之间。     

水稻瘤矮病毒基因组S8片段全序列测定及其结构分析

应用RT-PCR技术克隆了水稻瘤矮病毒（Rice gall dwarf virus,RGDV）中国广东信宜分离物（RGDV-C）的基因组S8片段，并测定了全序列。结果表明RGDV-C基因组s8片段全长1578bp（GenBank登录No．AY216767），含有一个ORF，编码一个含有426个氨基酸的外层衣壳蛋白，基因结构与泰国的RGDV分离物基本一致，核苷酸和推导的氨基酸序列同源性分别为96．0％和99．1％，与植物呼肠孤病毒属（Phytoreovirus）的三叶草伤瘤病毒（Wound tumor virus，WTV）和水稻矮缩病毒（Rice dwarf virus,RDV）各分离物的核苷酸同源性分别为56．8％和55．3％～56．0％。从s8编码的外层衣壳蛋白亲缘关系、反向重复序列、病毒粒体被严格限制于薄壁细胞以及致瘤特性来看，RGDV与WTV比RGDV与RDV具有更近的亲缘关系。     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因在大肠杆菌中的表达及其抗原性的初步鉴定

利用基因重组技术将鸡传染性支气管炎病毒（IBV）S1基因分段（A和B段）克隆到pGEX—6p-1载体中，用IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳结果显示有明显的融合蛋白表达条带。通过IBV特异性抗体的Western blot检测，两段表达产物均能与抗体发生特异性反应，证明表达产物具有部分抗原性。用Glutathione Sepharose 4B纯化出A段和B段的GST融合蛋白。将纯化得到的融合蛋白免疫家兔。连续免疫3次，将得到的抗体与200 TOCID50（气管环半数感染）/0．1mL病毒工作液在37℃温育1h进行TOC试验。经计算A段抗体的50%血清中和终点为1：18，而B段抗体的50％血清中和终点为1：53，表明这两段的表达产物具有较好的免疫原性，B段表达产物更具有良好的抗原性，适合作为免疫抗原和诊断抗原，具有一定的临床应用价值。     

番鸭源小鹅瘟病毒PT株VP基因的克隆与序列分析

为了获得番鸭(Cairina moschata)源小鹅瘟病毒(Goose parvovirus,GPV)结构蛋白VP基因的相关信息,根据国内外已发表鹅源GPV与番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)全基因序列,应用DNAStar分子生物学软件设计一对引物,应用高保真PCR技术扩增番鸭源小鹅瘟病毒PT株(GPV PT株)VP全基因序列.将扩增得到的VP全基因克隆到pMD 18-T载体上,获得的重组质粒经PCR鉴定后进行序列测定.结果表明,PT株VP全基因大小为2 199 bp,编码732个氨基酸(GenBank登录号:JF926695),与番鸭源小鹅瘟病毒GPV DY株核苷酸及其推导氨基酸同源性分别为98.8％和98.8％,高于鹅源GPV与MDPV参考毒株.在国内外首次发现番鸭源GPV VP基因VP1独特区具有MDPV核苷酸序列特征,而VP2基因具有鹅源GPV核苷酸序列特征.本研究从番鸭源GPV PT株成功克隆到结构蛋白全基因序列,为深入研究番鸭源GPV的起源及水禽细小病毒遗传衍化提供参考.     

引起免疫失败的IBV分离株的生物学特性及结构基因分析

本研究应用鸡胚尿囊腔接种的方法,从广西患传染性支气管炎的免疫失败的病鸡中分离到一株传染性支气管炎病毒（IBV）（命名GX-YL5）,通过间接血凝试验、动物回归试验和气管环交叉中和试验对该毒株进行鉴定和主要生物学特性的研究,同时利用RT-PCR技术扩增克隆该病毒的S1基因和N基因并测定其核苷酸序列。结果表明：该病毒株有间接血凝性;致病性较强;血清型不同于常用疫苗株H120、Ma5、4／91。同源性分析表明,S1基因核苷酸和氨基酸序列与参考株的同源性分别为63.5％-81.2％和50.7％-78.8％;N基因核苷酸和氨基酸序列与参考株的同源性分别为85.7％-87.2％和89.5％-91.7％;S1基因和N基因系统进化分析表明分离株与其它参考毒株的亲缘关系较远。S1基因和N基因分型与血清学试验结果相吻合。本研究结果提示了广西分离株GX-YL5可能是一个新的变异株,这可能是目前免疫失败的重要因素,同时也为研制适合本地使用的IBV疫苗提供了科学依据和物质基础。     

滴灌条件下水肥耦合对温室番茄产量效应的研究

以番茄为供试作物,在温室内采用二次D-饱和最优设计进行水肥试验,探讨了滴灌条件下水、肥交互对温室番茄产量的影响。试验结果表明:影响番茄产量的主要因素是灌水量与钾肥用量的交互作用,其次是氮肥用量;仅从产量角度评价,以中等氮肥用量、高钾肥用量和高灌水量为水肥调控的最佳组合。     

表达外源基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染性克隆的构建及病毒拯救

为建立表达标记基因的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)反向遗传操作平台,本研究在PRRSV HuN4-F112疫苗株感染性分子克隆的基础上,采用突变PCR技术将新城疫病毒(NDV)NP蛋白末端优势抗原区插入PRRSV NSP2蛋白的复制非必须区,经基因片段的克隆、拼接,构建了含有外源标记基因的感染性的PRRSV cDNA克隆psk-HuN4-F112-Δ52+NP49。用限制性内切酶SwaΙ将psk-HuN4-F112-Δ52+NP49线性化后通过细胞外转录获得病毒RNA,用脂质体法将病毒RNA转染叙利亚仓鼠肾细胞(BHK-21)包装出病毒粒子,再转接到猴胚胎肾上皮细胞(MACR-145)传代拯救病毒。对拯救的病毒进行RT-PCR扩增、酶切和序列分析鉴定。结果表明,拯救病毒含有不同于亲本病毒的分子标记(病毒基因组14667位人工产生的MluⅠ酶切位点)和插入的标记基因序列。间接免疫荧光试验表明,外源基因NP49在拯救的PRRSV中表达,且能够在PRRSV传代过程中稳定遗传。病毒生长特性比较显示,拯救病毒与亲本病毒在MARC-145细胞上具有相似的增殖特性。本研究构建了含有标记基因PRRSV的感染性克隆并获得了拯救病毒,为进一步开发新型PRRS疫苗提供了有效的反向遗传操作平台。     

兔病毒性出血症病毒JX/97株衣壳蛋白基因的序列测定与分析

对中国兔病毒性出血症病毒(Rabbithemorrhagicdiseasevirus,RHDV)JX/97株的衣壳蛋白基因进行了克隆和测序。结果表明,该蛋白的核苷酸序列长度为1739nt,推导的氨基酸序列为579aa。利用分子生物学软件分析了该病毒与国内外22!RHDV的基因序列,结果显示,RHDV不同分离株之间的序列同源性几乎都在90%以上。衣壳蛋白基因的系统发生树分析结果表明,所选的RHDV参考毒株按照一定的遗传距离,可以分为4个基因群,基因群之间的距离有加大的趋势,表明RHDV受环境的影响有向不同方向演变的趋向,即RHDV在长期适应特定环境的过程中,有可能逐渐演变成各具特色的RHDV。     

水稻白叶枯病菌GX1329基因组文库的构建及含编码TAL效应物基因的克隆的分离

由革兰氏阴性细菌水稻白叶枯病菌引起的水稻白叶枯病是亚洲、北美以及非洲部分地区最严重的水稻病害之一,水稻白叶枯病可使水稻减产高达50％以上。研究表明水稻白叶枯病菌的毒力主要依靠三型分泌系统所分泌的效应物。为了解水稻白叶枯病菌广西菌株GX1329中含有avrBs3／pthA家族基因的情况,本研究应用Alu I部分酶切其基因组DNA,构建了含有736个克隆的菌株GX1329的基因组文库。BamHI酶切分析随机挑取的15个文库克隆表明,克隆的外源DNA随机性良好,克隆的最小片段为27．7kb,最大为58．5kb,平均大小为39．9kb,文库克隆容量约为2．8×10^3Mb,该文库中包含基因组中任一个基因的概率为99．4％。利用来自水稻白叶枯病菌菲律宾菌株PX086的无毒基因avrXa10的第252位～第486位核苷酸序列作为探针,通过菌落原位杂交从GX1329基因组文库中筛选到37个含avrBs3／pthA家族基因的克隆。再通过Southern杂交分析,得到了17个独立克隆。这17个克隆中至少含有13个不同的avrBs3／pthA家族基因。这些基因在GX1329基因组中有的单独存在,有的两个或两个以上串联存在。本工作基本上明确了菌株GX1329基因组中avrBs3／pthA家族基因的数量,为进一步研究菌株GX1329中avrBs3／pthA家族基因的功能奠定了基础。     

木霉微生物肥与减量化肥配施对番茄产量、品质及土壤肥力的影响

研究利用植物促生菌提高肥料效率以部分替代化肥。采用大田试验结合连续盆栽试验的方法,以100%化肥(CF)为对照,设置如下处理:75%化肥配施普通有机肥(OF)或木霉微生物肥(BF)或木霉孢子悬液(SS)。结果表明,75%化肥配施以一定量(每株50 g)木霉微生物肥可维持田间番茄稳产,与100%化肥处理产量相当;而与普通有机肥或木霉孢子悬液灌根配施则会显著降低番茄产量,连续栽种4季后,产量下降35%以上。此外,BF处理可显著提高番茄果实的品质,与CF相比,总可溶性糖和维生素C含量分别提高35%~54%和2%~23%,而硝酸盐积累量下降32%~46%。究其原因,BF处理中木霉功能菌的有效定殖促进了番茄根际细菌、真菌、放线菌的增殖,土壤养分的有效性显著提高,表现为根际微生物数量与多项土壤肥力指标呈显著相关关系。综上,木霉微生物肥与减量化肥配施,可有效保证番茄稳产,提高番茄品质,长期施用还可提高土壤微生物数量、改善土壤肥力。