Analysis of EST-SSRs in silver birch (<Emphasis Type="Italic">Betula pendula</Emphasis> Roth.)

Simple sequence repeats (SSRs) defined as sequence repeat units between 1 and 6 bp occur abundantly in both coding and non-coding regions in eukaryotic genomes and these repeats can affect gene expression. In this study, ESTs (expressed sequence tags) of Betula pendula (silver birch) were analyzed for in silico mining of EST-SSRs, protein annotation, open reading frames (ORFs), designing primers, and identifying codon repetitions. In B. pendula, the frequency of ESTs containing SSRs was 7.8 % with an average of 1SSR/4. 78 kb of EST sequences. A total of 188 SSRs was identified by using MISA software and di-nucleotide SSR motifs (65.9 %) were found to be the most abundant type of repeat motif followed by tri- (27.1 %), tetra- (4.8 %), and penta- (2.2 %) motifs. Based on ORF analysis, 175 of 178 sequences were predicted as ORFs and the most frequent SSRs were detected in 5′ UTR (58.43 %), followed by in ORF (31.46 %) and in 3′ UTR (8.43 %). 102 of 178 ESTs were annotated as ribosomal protein, transport protein, membrane protein, carrier protein, binding protein, and transferase protein. For a total of 102 SSRs (57.3 %) with significant matches, a set of 102 primers (100 %) with forward and reverse strands was designed by using Primer3 software. Serine (Ser, 19.6 %) was predominant in putative encoded amino acids and most of amino acids showed nonpolar (35.3 %) nature. Our data provide resources for B. pendula and can be useful for in silico comparative analyses of Betulaceae species, including SSR mining.     

Analysis of SSR loci and development of SSR primers in Eucalyptus

In this study,28,691 genome sequences and16,566 expressed sequence tags(ESTs) of Eucalyptus were derived from the Gen Bank database.A total of 2292 SSR loci were sought out from 1785 effective sequences.Through analyses of SSR loci information,the SSR motif length was negatively correlated with the abundance of the SSRs.In the EST sequences of Eucalyptus,triplet repeat motifs were the most abundant,and dinucleotide repeats motifs had the highest frequencies.Subsequently,395 pairs of primers were designed based on the SSR loci.Using optimized SSR-PCR conditions,340 pairs of primers were successfully screened,with a success rate of 86.1%.By construction of a maximum likelihood phylogenetic tree of six eucalypt species,represented by five species of the genus Eucalyptus and one of the genus Corymbia,the genetic relationships of Eucalyptus urophylla and E.camaldulensis suggested by this tree was found to differ from that suggested by traditional morphological taxonomy.The results provide insights for evaluating geneticdiversity of Eucalyptus and analysis of Eucalyptus phylogenetics using SSR markers.     

基于牡丹EST信息的滇牡丹SSR标记开发

对NCBI(美国国立生物技术信息中心)中牡丹的ESTs(expressed sequence tags)的序列进行分析,结果表明:在所分析的2 204条序列中,仅324条分布有SSRs(simple sequence repeats),占全部ESTs序列的14.70%;SSR的出现频率为15.20%,共计335个,其中,二核苷酸重复比例84.18%,三核苷酸重复比例为15.22%,四和六核苷酸重复比例为0.30%。在此基础上,利用软件(serafer 1.3)设计了51对备选SSR引物,以6个滇牡丹不同花色类群DNA为模板对引物进行筛选,其中,10对引物有扩增产物;用这些引物进一步在10个类群50个DNA模板进行多态性测试,结果显示:上述10对SSR引物均有多态性,且同一类群内不同模板DNA间也存在多态性。本研究结果证明:基于牡丹EST信息建立SSR标记是一种有效而可行的方法,有助于滇牡丹遗传多样性分析及基因组学方面的研究。     

白桦EST-SSR信息分析与标记的开发

对NCBI(美国国立生物技术信息中心)中2 5 48条欧洲白桦ESTs的序列进行分析,结果表明:其中260条ESTs中含有306个SSRs,为全部 ESTs序列的10.2%,SSR频率为12.01%.其中,二核苷酸重复比例为81.37%,三核苷酸重复比例为16.67%,四核苷酸重复比例为1.96%.不同软件设计引物的效率不同,Pri mer3设计出176对SSR引物,在白桦中扩增成功的引物比例为59.09%,而具有多态性的引物比例仅为25.96%;SSR Primer设计出100对引物,在白桦中扩增成功的引物比例为37%,而具有多态性的引物比例为48.65%.     

日本落叶松EST-SSR标记开发及二代优树遗传多样性分析

利用SSR标记研究选自第1代育种试验林、拟纳入二代育种群体的264株日本落叶松二代优树的遗传变异情况。利用1620条落叶松EST序列进行EST-SSR标记的开发,共发现58条序列中含有67个SSR位点,占全部EST序列的3.58%。获得7个多态性EST-SSR标记,其中5个在朝鲜落叶松、长白落叶松、兴安落叶松和华北落叶松中均可扩增出预期目标片段,且具有多态性,表明这些标记在落叶松属内的通用性良好。利用6个EST-SSR标记和4个gSSR标记对日本落叶松二代优树群体开展遗传多样性分析,每个位点的平均等位基因数为4.6个,有效等位基因平均数为3.1个。群体观察和期望杂合度均值分别为0.5902和0.5702;Nei's基因多样度和Shannon多样性指数分别为0.5691和1.0966;全部单株间遗传相似系数0.1725～0.9667。说明该二代优树群体的遗传多样性较高,具有构建二代育种群体的潜力。     

Analysis of SSR loci and development of SSR primers in <Emphasis Type="Italic">Eucalyptus</Emphasis>

In this study, 28,691 genome sequences and 16,566 expressed sequence tags (ESTs) of Eucalyptus were derived from the GenBank database. A total of 2292 SSR loci were sought out from 1785 effective sequences. Through analyses of SSR loci information, the SSR motif length was negatively correlated with the abundance of the SSRs. In the EST sequences of Eucalyptus, triplet repeat motifs were the most abundant, and dinucleotide repeats motifs had the highest frequencies. Subsequently, 395 pairs of primers were designed based on the SSR loci. Using optimized SSR-PCR conditions, 340 pairs of primers were successfully screened, with a success rate of 86.1%. By construction of a maximum likelihood phylogenetic tree of six eucalypt species, represented by five species of the genus Eucalyptus and one of the genus Corymbia, the genetic relationships of Eucalyptus urophylla and E. camaldulensis suggested by this tree was found to differ from that suggested by traditional morphological taxonomy. The results provide insights for evaluating genetic diversity of Eucalyptus and analysis of Eucalyptus phylogenetics using SSR markers.     

杜鹃花表达序列标签资源中的微卫星信息分析

从NCBI数据库下载杜鹃花表达序列标签序列1323条,去冗余后得到912条EST。采用Tandemrepeatfinder软件分析,最终在61条EST序列中找到65个SSR位点,出现频率为7．1272％。二碱基重复是杜鹃花EST内SSR的主要重复类型,占66．1538％;单碱基和三碱基重复次之,分别占据15．3846％和9．2308％。四碱基、五碱基、六碱基类型的SSR相对比较少。多达90．7692％的SSR位点为完美型微卫星重复。这些富含SSR位点的EST序列将为开发微卫星特异性引物,并用于杜鹃花群体生物多样性和遗传结构分析提供理论依据。     

基于桤木属转录组测序的SSR分子标记的开发

[目的]基于转录组数据开发适用于桤木属树种的SSR标记,揭示其在转录组序列中的分布类型及特征,为桤木属树种分子标记辅助育种提供有利工具。[方法]利用Micro SAtellite(MISA)软件对所有转录组序列进行SSRs搜索,并对SSR位点的数量、分布特征进行统计分析。设计100对SSR引物,采用琼脂糖凝胶电泳和毛细管电泳分离检测方法对3种不同倍性桤木属植物(12份材料)进行遗传多样性检测,确定引物多态性及通用性。[结果]85 769条Unigenes序列中发现8 678个SSR位点,分布在8 298条Unigenes中发生频率为9.67%,转录组序列中平均每14.04 kb长度就有一个SSR位点分布。其中,二核苷酸重复类型数量最多,占65.87%。根据转录组Unigenes序列,利用Primer 3软件共设计出4 531对符合要求的引物,挑选出的100对SSR引物中,获得18对多态性高、稳定性好的SSR引物。[结论]本研究可扩增出多态性位点的引物重复单元以二、三核苷酸重复为主。基于桤木属转录组序列的SSR标记开发是可行的,开发的引物为桤木属遗传多样性分析、分子育种、遗传图谱构建和功能基因的挖掘提供了丰富的候选分子标记。     

油桐尺蛾核型多角体病毒广西株全基因组序列

油桐尺蛾核型多角体病毒广西株基因组序列由Sanger测序的方法得到。拼接后获得了121 268 bp序列,GC含量为36.76%。以长度不小于50 aa的序列认定为功能基因,共预测到131个开放阅读框,通过Blast比对,其中87个能注释到功能基因。对基因组序列进重复序列分析,共发现SSR位点174个,同源重复序列1个。在SSR位点中,包含6种长度的重复基序,且以富含AT的重复基序为主。同源重复序列两端为一59 bp片段或其一部分组成的重复序列,两端分别重复12次和7次,中间则为一段与重复片段无关的236 bp片段。与武汉株相比,广西株病毒在37个核心基因中有4个存在蛋白序列长度上的差异,而在其他非核心基因中有6个基因仅存在于一个病毒株中,另有13个基因存在蛋白序列长度上的差异。     

滇东南濒危植物长梗杜鹃转录组微卫星特征分析

[目的]全面了解滇东南特有濒危植物长梗杜鹃转录组SSR位点的分布及序列特征,为长梗杜鹃的保护和合理开发利用提供遗传学资料,为同属植物及近缘种SSR标记的开发及遗传研究提供便利。[方法]利用Illumina Hiseq 4000高通量测序平台对长梗杜鹃叶片进行转录组测序,再通过MISA软件对测序所得Unigenes进行SSR位点的发掘和分析。[结果]发现含SSR的序列17 354条,共得到23 192个SSR,出现频率为31.30%,平均每3 kb出现1个SSR。二碱基和三碱基重复为长梗杜鹃SSR主要重复单元类型,分别占SSR总数的69.25%和15.07%,187种重复基元中,所占比例最高的是(AG/CT)n(62.01%),其次是(A/T)n(12.34%)、(AC/GT)n(4.52%)和(AAG/CTT)n(4.23%)。在SSR和CDS的交集基因中,共发现15 908个SSR位点,其中2 792个位于编码区,出现频率为0.076 SSR/kb,而非编码区为0.344 SSR/kb,在基因编码区中出现频率最高的是三碱基重复(1 356,48.57%)。在不同长度重复单元中,二碱基重复SSR长度变异程度最高,其次是单碱基重复。长梗杜鹃SSR的频率和长度呈显著负相关(P0.01),相关系数为-0.566。[结论]长梗杜鹃转录组SSR位点的出现频率高、分布密度大、基元类型丰富、重复次数较高、长片段较多,具有较高的多态性潜能,用于遗传分析的潜力很大,能满足该物种的保护遗传学研究。     

基于芭蕉属EST序列的地涌金莲SSR引物开发

对31 308条来自NCBI的芭蕉属(Musa)EST序列进行拼接得到全长为13.51 Mb的21 129条无冗余EST序列(含3 818条contigs及17 311条singletons),其中,4 944条(23.40%)EST序列含有5 416条SSRs,SSR的出现频率为25.63%,平均分布距离2.49 Kb,有234条(1.11%)含有1个以上的SSR。在所检测的SSR中,二、三、四核苷酸重复是主导重复类型,分别占EST-SSR总数的21.80%(1 181条)、52.55%(2 846条)和14.55% (788条)。AG/CT、AAG/CTT与AGG/CCT和AAAG/CTTT与AAAT/ATTT分别是二、三、四核苷酸的优势重复基元。随机设计了238对EST-SSR引物在24个地涌金莲个体中进行筛选,116对有扩增产物,其中,78对EST-SSR引物扩增出清晰稳定的目的片段,49对引物表现出多态性。本研究检测的15对引物扩增等位基因数范围是2~7个,平均3.067个;表观杂合度(Ho)范围是0.042 0.750,平均0.250;期望杂合度(He)范围是0.232~0.823,平均0.522。     

杜仲基因组微卫星特征及SSR标记开发

为全面解读杜仲的遗传背景,本研究在基因组测序(数据未公布)的基础上,通过MISA软件搜索杜仲基因组(26 947/854 758 160 bp)中的完整型(1～7核苷酸重复)及复合型SSR序列,共查找出25 694个Scaffolds含有488592个SSR位点,占总Scaffolds的95.3％.从SSR位点分布密度上讲,平均每1 749 bp出现1个微卫星,其中单核苷酸重复单元的SSR含量最多,约占总数的54.34％,其次为二核苷酸(20.47％),而复合模式、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸和七核苷酸重复分别占20.29％、23.89％、0.77％、0.13％、0.10％和0.01％,并发现SSR中均以含A、T的重复类型占主导地位.根据SSR位点设计并合成引物290对,162对SSR引物扩增出清晰的目的条带,其中16对引物多态性高、稳定性好,在8份杜仲资源中共检测到84个等位基因,平均每个SSR位点检测到5.25个等位基因.本研究对于进一步利用SSR分子标记分析杜仲遗传多样性、遗传图谱构建、杜仲雌雄株早期鉴定等具有较高的应用价值.     

基于马尾松干旱转录组的抗旱功能SSR位点分析

[目的]了解马尾松干旱胁迫转录组序列的功能分布和SSR位点分布特征,并探索与干旱关联的SSR位点。[方法]对马尾松幼苗进行持续干旱胁迫,选取干旱10、15、25 d及正常供水对照的马尾松针叶样品,通过总RNA提取、Illumina测序、raw reads去冗、Trinity拼接获得unigenes。利用Blast比对,对Unigene序列进行GO、KOG、KEGG功能注释及分类;利用Misa软件进行SSR位点批量搜寻,primer 3. 0软件进行规模化SSR引物设计;利用GOSeq(1. 10. 0)、KOBAS(v2. 0. 12)软件对差异表达的含SSR位点Unigene进行GO、KEGG显著性富集分析。[结果]马尾松转录组194 821个Unigene中,101 806个Unigene获得注释,包含64 943个GO功能注释、35 880个KOG功能注释及30 882个KEGG注释。搜寻到6 728个SSR位点,分布于6 367个Unigene中,SSR出现频率为3. 45%;重复类型以单、三、二核苷酸为主,分别占总SSR的35. 82%、33. 03%和25. 22%;重复基序以A/T、AT/AT、AG/CT、AGC/CTG、AAG/CTT为主;基序长度以10 20 bp的短序列SSR为主;基序重复次数以5～10次重复占优势;批量设计13 338对SSR引物。422个含SSR位点Unigene具有差异表达; KEGG富集分析发现,有11个含SSR位点的差异Unigene参与了光合作用、植物激素信号传导及类胡萝卜素合成等3个与干旱响应相关的代谢途径。[结论]从较高质量的马尾松转录组中获得101 806个具有注释的Unigene;从6 367个Unigene中挖掘出6 728个SSR位点; 422个含SSR位点的差异表达Unigene中筛选出11个与干旱关联的SSR功能位点,为抗旱功能基因定位及马尾松抗旱分子机制研究奠定基础。     

锥栗基因组SSR开发及农家品种的遗传多样性分析

本文对锥栗SSR富集文库进行Illumina MiSeq高通量测序,利用生物信息学对得到的序列进行SSR特征分析,开发锥栗基因组SSR并对农家品种进行了遗传多样性分析。在2051475条序列中,总共搜索到2117345个SSR,以复合形式存在的SSR数量为640155个。二核苷酸为重复单元的SSR数量最多,占总数的73.22%,之后依次为三核苷酸(12.61%)、单核苷酸(12.56%)、四核苷酸(1.33%),单碱基重复、二碱基重复和三碱基重复的优势重复单元分别为:A/T、AC/GT、AAG/CTT。对SSR的长度多态性进行了评价。以8个农家品种为材料,在100对基因组SSR引物中筛选出多态性和特异性较好的引物10对。对25个锥栗农家品种进行了遗传多样性分析观测等位基因和期望杂合度分别为6.3和0.705,有效等位基因数为3.628,Shannon信息指数为1.441,表明锥栗农家品种具有较高的遗传多样性水平。     

杨树抗逆转录因子基因内SSR标记的开发

利用直接测序法开发小叶杨抗逆转录因子基因内一套新的核基因组SSR标记。通过对3个抗逆转录因子共21个成员在36个小叶杨基因型个体中的序列比较分析后共检测到31个SSR多态性位点,SSR出现的频率为1/1916bp。在小叶杨自然群体中,SSR多态性位点的碱基重复呈现出2～5碱基形式,基元重复次数变异范围为3～20次,其中以二碱基重复的位点较多,占总数的51.6%。在此基础上,依据SSR位点两侧的保守序列,设计31对SSR位点PCR扩增引物对。利用设计的引物检测所开发的SSR位点在杨属内22个基因型个体中PCR扩增的有效性及SSR位点的保守性。PCR扩增结果显示,93.5%的SSR位点能够在杨属内至少4个派内有效扩增,每对引物组合可检测到SSR多样性位点数3～12个,平均6个。基于抗逆转录因子基因内开发的SSR标记位点为分子标记辅助小叶杨抗逆性状育种提供工具。     

欧洲黑杨育种基因资源SSR多态性比较研究

本研究利用13对SSR引物对120份(105份国外引进、15份我国新疆)欧洲黑杨基因资源进行了遗传多态性分析,共检测出171个等位基因,每个多态性位点检测到7～19个等位基因,平均为13.2,多态信息指数为0.396～0.909,平均为0.808;遗传距离为0～0.456 4.欧洲黑杨基因种源具有丰富的遗传多样性.通过UPGMA等类分析,将120份材料划分为8类,地理分布较近的材料基本聚在一起,表明遗传距离与地理距离相关性强.     

日本落叶松EST-SSR标记挖掘及特征分析

基于日本落叶松转录组测序(RNA-seq)结果,利用SSRIT工具查找SSR位点,检测到1 788个EST-SSR位点,平均长度是17.5 bp。进一步统计分析发现在落叶松中重复类型SSR位点出现次数最多的是六、三核苷酸,其余依次是五、二、四核苷酸重复类型;同时检测到656种重复基元类型,种类丰富。用Primer Premier 5.0设计500对引物,随机合成102对,以红豆杉科、柏科、松科材料为模板进行检测,结果显示在红豆杉科和柏科里的扩增率分别为95%、50%;在松科不同属的通用性为落叶松属99.01%、黄杉属67.4%、雪松属63.8%、冷杉属67.4%、云杉属70.2%和松属75.7%。利用101对SSR引物对7种不同落叶松品种亲缘关系进行了分析,获得79个多态性位点,在遗传相似系数0.69处将其区分为4个类群。     

Identification of SSR loci in <Emphasis Type="Italic">Betula luminifera</Emphasis> using birch EST data

Expressed sequence tags(ESTs) are generated from single-pass sequencing of randomly picked cDNA clones and can be used for development of simple sequence repeat(SSR) markers or microsatellites.However,EST databases have been developed for only a small number of species.This paper provides a case study of the utility of freely available birch EST resources for the development of markers necessary for the genetic analysis of Betula luminifera.Based on birch EST data,primers for 80 EST-SSR candidate loci were ...     

蕨类植物芒萁幼孢子体转录组高通量测序及特征分析

[目的]采用高通量测序技术Illumina Mi Seq250获得蕨类植物芒萁的孢子体转录组数据,以期为芒萁的生长、发育、代谢调控、微进化机制分析等提供重要的分子信息。[方法]应用生物信息学方法对测序获得的大量单基因簇(Unigene)进行基因功能注释、代谢途径及微卫星分析等。[结果]本研究共获得18 463 296条序列读取片段(reads),总碱基数为4.62Gbp序列信息,经序列组装最终得到63 169个Unigene,平均单条Unigene长度为863 bp,N50为1 587 bp,其中分布在200 500 bp长度区间Unigene占总数的55.4%。数据库中的序列同源性比较表明,26 826个Unigene与其他物种的已知基因具有不同程度的同源性。芒萁转录组中的Unigene根据GO功能大致可分为细胞组成、分子功能和生物学过程3大类47个分支,其中有大量的Unigene与细胞进程、绑定活性、代谢过程和催化活性相关。将Unigene与COG数据库进行比对,根据其功能大致可分为26类。以KEGG数据库作为参考,依据代谢途径可将Unigene定位到257个代谢途径分支。此外,利用MISA软件检索2 6碱基微卫星,共找到13 286个SSR。在不同长度微卫星中,三核苷重复数量最多,占总数的40.41%。在各重复基序类型中出现频率最高的为AG/CT(14.45%)与AAG/CTT(12.39%)。利用重复基序开发的多态性SSR标记,可应用于芒萁不同个体的基因型分型鉴定。[结论]本研究获得了较高质量的芒萁转录组数据库,揭示了芒萁孢子体生长发育过程中表达基因的功能总体特征,可为芒萁进一步的功能基因挖掘和分子标记规模化开发奠定基础。     

杨树EST-SSR标记的开发

利用来自美洲黑杨及欧美杨的20 023条EST序列,进行EST-SSR标记开发研究.首先对这些EST序列进行序列拼接,然后在非重复序列中发现由二核苷酸至五核苷酸组成的SSR重复序列.共在10 816个非重复序列中发现1 604个序列含有SSR,占总非重复序列的14.8%.在发现的1 918个SSR重复序列中,二核苷酸重复是最丰富的重复类型,占总类型的62.3%.设计合成48对SSR引物,利用6个不同的杨树品种对其进行验证.结果约90%的引物获得扩增产物,58%的引物在6个不同杨树品种中产生多态性分离.另外,还对重复序列的数量及重复类型进行了讨论.