3种白腐菌木质纤维素酶活性及酶相关基因的TRAP标记遗传多态性

【目的】木质纤维素是重要的可再生资源,白腐菌对降解木质纤维素具有特殊的优势。研究3种白腐菌的生物学特性、酶学活性以及菌种间的遗传多样性,系统分析3种白腐菌木质纤维素酶的表达与相关基因多态性的关系,为高产木质纤维素酶菌种选育提供理论基础,为白腐菌木材降解分子机制的研究提供科学依据。【方法】以云芝栓孔菌、火木层孔菌和松杉灵芝3种白腐菌为研究材料,测定在不同培养温度下固体培养基中菌落的生长速度和液体培养基中的生物量变化,利用比色法测量白腐菌5种木质纤维素酶活性,运用目标区域扩增多态性( TRAP)分子标记分析3种白腐菌的木质纤维素降解相关酶基因的多态性。【结果】在不同温度下(23,28℃),3种白腐菌在PDA固体培养基上的生长速度均为云芝栓孔菌＞火木层孔菌＞松杉灵芝,云芝栓孔菌和火木层孔菌在28℃的生长速度高于23℃,而松杉灵芝在23℃培养生长更快;液体培养基中云芝栓孔菌的生物量高于火木层孔菌和松杉灵芝。3种白腐菌木质素相关酶活性受木屑诱导显著提高,木质素酶活性最高的是漆酶,其次是木质素过氧化物酶,最低的是锰过氧化物酶;纤维素酶的表达在3种白腐菌中无显著差异,但外切纤维素酶活性明显高于内切纤维素酶活性,玉米秸秆为碳源诱导产生的纤维素酶活性明显高于木屑碳源样品。云芝栓孔菌更偏好于木质素酶的表达,而火木层孔菌和松杉灵芝则更偏好于纤维素酶的表达。TRAP分子标记扩增结果显示,木质素酶相关基因的6对引物共产生109条条带,多态性条带为79条,多态性百分比为72.47%;纤维素酶相关基因的11对引物共产生198条条带,多态性条带为140条,多态性百分率为70.70%。【结论】通过生长速度、生物量、木质纤维素酶活性的检测以及 TRAP 分子标记结果表明3种白腐菌在种间具有较高的遗传差异。3种白腐菌木质素酶活性的大小与其酶基因多态性之间没有明显的对应关系;3种白腐菌纤维素酶活性大致相同,其基因多态性也比较一致。     

偏肿革裥菌在木质环境下转录组构建与相关基因表达分析

【目的】对白腐菌偏肿革裥菌在木质和非木质环境下的转录组进行测序,为白腐菌降解木材的机制研究提供支持。【方法】采用高通量测序技术对木屑和非木屑处理条件下的菌丝样本进行转录组测序。利用eggNOG、GO、KEGG等数据库对转录本进行注释和比较分析,预测和筛选出偏肿革裥菌与木材降解有关的基因。应用荧光定量PCR(qPCR)检测mnp2等11个与木质素降解相关的差异基因在木屑处理5天条件下的表达量,结合转录组数据对这些基因的表达量变化趋势进行分析。【结果】偏肿革裥菌转录组测序共得到38.9 Gb Clean Data,各样品Clean Data平均达到6.49 Gb,各样品的Reads与参考基因组的比对效率在71.23%~74.25%之间。使用edgeR软件进行差异表达分析,得到差异表达基因898个,其中上调351个、下调547个。差异基因被注释到GO数据库的有251个,注释到KEGG数据库的有223个,注释到eggNOG数据库的有704个。eggNOG分析表明,差异基因表达多聚集在能量产生和转换、转录后修饰、蛋白质代谢、伴侣关系、次生代谢物的生物合成、碳水化合物的运输和分解代谢等功能分类下。GO分析表明,显著性富集与频率较高的生物过程是丙酮酸代谢过程、类异戊二烯生物合成过程、天冬氨酸家族氨基酸代谢过程和木质素分解过程。在KEGG通路分析中,差异基因分布到86个不同的生物途径,差异基因显著富集的代谢通路主要为:碳代谢、柠檬酸循环、芳香化合物降解、乙醛酸代谢。qPCR结果表明在木屑处理条件下基因mnp2、mnp3、lip9、lip2、laccase1和nadp的表达量明显上调;mnp10 s、mrp、cyp450-1、GroES1和GroES2的表达量明显下调,qPCR与转录组测序结果在表达量差异倍数上存在较小偏差,但整体趋势一致,可以证明转录组测序结果是正确可靠的。【结论】偏肿革裥菌降解木材与碳代谢、芳香化合物降解等通路密切相关;与木质素分解等生物过程密切相关。根据基因功能注释的结果得到11个与白腐菌降解木质素相关的重要差异表达基因。     

几株半知菌对马尾松落叶的分解——木质纤维素酶的活性动力学

应用固体发酵方法,研究Alternaria sp., Penicillium sp., Cephalosporium sp., Tricherderma sp., Pestalotiopsis sp.和Aspergillus fumigatus 6种土壤半知菌降解马尾松凋落叶片过程中产生的漆酶(Laccase)、木质素过氧化物酶 (LiP)、锰过氧化物酶 (MnP)、羧甲基纤维素酶 (CMCase) 和滤纸糖酶 (FPA)的动力学曲线,以及各种酶活性与底物降解的关系.结果表明:Pestalotiopsis sp. 能够产生相对较高的漆酶活性和引起底物的总有机物质(TOM)质量损失最大;Alternaria sp. 产生的MnP酶活性最高;Pestalotiopsis sp. 产生的CMCase和FPA酶活性也为最高.试验中6种菌前期的降解速率依赖于CMCase 和 FPA酶活性的高低,后期则由木质素酶和纤维素酶协同作用来决定.依据6种菌的酶生产动力学曲线、TOM 质量损失和降解速率,可将其划分为2种功能类型:功能群Ⅰ为纤维素分解菌,包括Alternaria sp., Penicillium sp., Cephalosporium sp.和Tricherderma sp. 4种;功能群Ⅱ为木质纤维素分解菌,包括 Pestalotiopsis sp.和Aspergillus fumigatus 2种.试验中也发现:Pestalotiopsis sp.产生漆酶的活性较高,同时是一株比较有效降解木质纤维素底物的菌种.     

褪黑素处理对高节竹笋低温贮藏过程中木质化的影响

【目的】探讨褪黑素处理条件下,高节竹笋采后低温(4℃)贮藏过程中木质素形成、抗氧化酶活性、转录因子基因表达的变化模式,为阐明褪黑素处理对竹笋采后木质化过程的影响及其调控机制提供参考。【方法】以高节竹笋为试验材料,分析低温(4℃)贮藏过程中(0、3、6、9、12天)褪黑素(1. 0 mmol·L-1)处理组和对照组竹笋硬度、黄度、亮度,木质素、纤维素含量,木质素合成相关的苯丙氨酸裂解酶(PAL)、过氧化物酶(POD)活性,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸还原酶(APX)活性以及NAC、MYB转录因子基因表达等指标。【结果】与对照相比,外源褪黑素处理减缓笋体变硬和黄化的速度以及木质素和纤维素的积累速度,显著抑制PAL和POD活性,提高了SOD、CAT和APX活性,有效延缓高节竹笋木质化的发生进程;转录因子MYB20、MYB63、MYB85、SND2和VND7的表达随竹笋采后贮藏时间的延长均受到不同程度的诱导,而MYB42、MYB43、NST1和KNAST7的表达量则有所下降。褪黑素处理一定程度上抑制了MYB20、MYB42和KNAT7的表达,促进了MYB43、MYB63、MYB85和SND2的表达。【结论】外源褪黑素处理有效延缓了高节竹笋采后低温贮藏过程中木质化的发生进程,其机制可能是褪黑素处理降低了木质素生物合成相关酶的活性,提高了抗氧化能力。此外,褪黑素也可能参与竹笋木质化的转录调控过程。     

松褐天牛幼虫肠道黏质沙雷氏菌培养条件与木质素降解功能

【目的】研究松褐天牛幼虫肠道内黏质沙雷氏菌木质素降解功能,为揭示松褐天牛与肠道细菌协作降解木质素的机制提供依据。【方法】以硫酸盐木质素液体培养基培养黏质沙雷氏菌,采用酶标仪微量测定法研究该菌对木质素的降解能力,考察其产木质素降解酶的种类及其变化,以及体外培养条件对该菌产优势降解酶———木质素过氧化物酶活性的影响。【结果】体外培养10天后黏质沙雷氏菌对硫酸盐木质素的累计降解率达94.12%,其中第4天的单日降解率最高,达15.16%。该菌在木质素培养基中可产木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶3种木质素降解酶,其中木质素过氧化物酶活性最高,然后依次是锰过氧化物酶和漆酶,前2种酶的日变化趋势与培养基中木质素的降解率相近。该菌产木质素过氧化物酶的最适培养基条件:p H5、硫酸木质素质量浓度3 g·L~(-1),有机氮源、酵母膏质量浓度5 g·L~(-1),Mg~(2+)、Ca~(2+)、Fe~(2+)、Mn~(2+)、K~+离子质量浓度分别为0.20、0.40、0.15、0.04和0 g·L~(-1)。【结论】黏质沙雷氏菌具有较强的木质素降解能力,可通过产生木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶实现其对木质素的降解功能;培养基中木质素浓度、p H值、氮源种类及其浓度、金属离子及其浓度等对其产木质素过氧化物酶的活性均有显著影响。     

杏鲍菇和乳白耙齿菌锰过氧化物酶活性规律的研究

采用LNAS培养基在4种不同培养液中,对白腐菌杏鲍菇和乳白耙齿菌在28℃下进行静止培养,得到了不同时间内的培养液,用紫外-可见分光光度计检测了在470 nm处对于2,6-DMP的氧化作用后光密度值的变化情况,作为锰过氧化物酶（MnP）产生和活性大小的依据,从而获得了杏鲍菇和乳白耙齿菌锰过氧化物酶与培养基的成分和酶作用底物的关系。结果表明,杏鲍菇和乳白耙齿菌均可产生MnP,对比4种成分不同的培养基酶活力测定结果,在培养液内添加酶的底物木屑和2,6-DMP后可提高MnP的分泌量。以前的研究认为：Mn2＋是MnP产生的必要因子。而本试验研究结果表明,Mn2＋并不是杏鲍菇和乳白耙齿菌产生MnP所必需的。论文为进一步利用这两种真菌产木质素降解酶,以及为进一步深入研究这两种真菌MnP对木质素及其它异生物质降解的作用机理提供基础的酶学研究。     

油松毛虫取食和剪叶刺激胁迫下油松的蛋白质表达差异分析

【目的】研究自然环境条件下剪叶和油松毛虫不同取食刺激程度双重诱导对油松体内蛋白质表达的影响,揭示油松诱导防御反应的蛋白质基础。【方法】在河北省平泉县的油松-山杏混交林中,选取15年生左右生长势一致的油松,进行树上套笼饲养10头、30头油松毛虫和剪叶处理,以未处理油松为对照,采用双向电泳法测定油松体内蛋白质表达差异。【结果】通过蛋白质点表达量的计算,与对照相比,油松毛虫取食及剪叶刺激后,均有特异表达蛋白点、消失蛋白点、上调蛋白点及下调蛋白点,但不同处理间蛋白点的表达差异不同。对差异蛋白点进行质谱鉴定,数据库检索结果表明,油松毛虫取食后特异表达的蛋白点是叶绿体ATP合酶CF0β亚基、抗坏血酸过氧化物酶、噻唑生物合成酶、Lhcb5蛋白、ATP合酶β亚基以及蛋白类谷胱甘肽S-转移酶,下调表达的蛋白点是蛋白酶亚基和假定蛋白CL304Contig1_01;剪叶刺激后特异表达的蛋白点是tau蛋白类谷胱甘肽S-转移酶和Rubisco加氧酶,下调表达的蛋白点是磷酸甘油酸激酶Ⅰ和核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基。进一步分析表明,取食刺激处理后,胁迫和防御相关蛋白高度表达,并且30头松毛虫取食后,与蛋白合成相关的蛋白质也特异表达;剪叶处理后,胁迫和防御相关蛋白也有特异表达,而且能量代谢相关蛋白下调。说明取食和创伤刺激可明显诱导油松防御有关蛋白的表达、光合作用的增强、蛋白质的合成和能量代谢的降低等防御反应。【结论】取食和剪叶刺激可明显诱导油松防御有关蛋白的高表达、促进光合作用的增强和蛋白质的合成,降低能量代谢等,这些变化应是构成油松防御反应的蛋白质基础。     

侧耳菌GH196木质纤维素降解酶系的研究

以一株从腐朽竹子上分离得到的侧耳菌(Pleurotus sp.)GH196为产酶菌,研究了其在静置和振荡两种液体培养方式下的木质纤维素降解酶系的产生.结果表明在含有稻草和麦麸的液体培养基中生长,可以产生木聚糖酶、纤维素酶和依赖锰过氧化物酶-漆酶型(MnPLaccas型)木质素降解酶.振荡条件可以促进菌丝生长,有利于多糖水解酶的产生,其中以木聚糖酶的合成为主;150r/min振荡培养5 d,木聚糖酶酶活达到44.7 U/mL.     

大兴安岭优势树种倒木分解的细菌群落组成及多样性差异

【目的】探究大兴安岭林地不同优势树种倒木分解过程中细菌群落组成、多样性及功能变化,探讨养分驱动下主要细菌群落分布格局的差异化响应。【方法】以一年期的白桦、樟子松、落叶松倒木为研究对象,测定其含水率（MC）、p H值、全碳（TC）、全氮（TN）、纤维素、半纤维素及木质素含量;采用Illumina MiSeq高通量测序技术分析细菌组成、相对丰度和生态功能群组;通过相关性分析探讨不同树种的细菌群落组成与倒木养分间的关联性。【结果】3种倒木分解过程中细菌种类由多到少依次为白桦、落叶松、樟子松,其中白桦独有细菌数量显著多于落叶松、樟子松。群落组成及分布研究表明,变形菌门Proteobacteria为3种倒木中细菌群落的绝对优势菌门,组内相对丰度在不同树种分解倒木中呈显著差异;Lysinimonas、Sphingomonas、Luteibacter为优势菌属,组内相对丰度在不同倒木中无显著差异。群落多样性差异分析表明,树种差异显著改变了樟子松与落叶松、樟子松与白桦细菌群落组内的Alpha多样性,在门、属水平上显著改变了组间的Beta多样性。倒木养分及与群落的相关性分析表明,TC、pH值、TN、C/...     

华山松大小蠹和共生真菌分泌酶组成分析

对华山松大小蠹消化道和共生真菌胞外蛋白和酶类组成分析的结果表明 ,华山松大小蠹消化道和共生真菌胞外均可分泌多种酶类 ,其中华山松大小蠹消化道具自身分泌纤维素酶、酯酶、蛋白酶和淀粉酶的能力 ,但不具分泌漆酶等木质素分解酶的能力 ,因此 ,其虽然可以直接利用寄主华山松韧皮部和木质部边材组织内的纤维素、淀粉、多糖、酯类和蛋白等营养物质 ,但不能分解利用木质素类营养。而共生真菌除具有胞外分泌纤维素酶、酯酶、蛋白酶和淀粉酶的能力外 ,还能够在寄主华山松组织内木质素的诱导下分泌漆酶 ,以充分利用华山松韧皮部和木质部内纤维素、木质素、淀粉和脂类物质。此外 ,华山松大小蠹消化道和共生真菌胞外分泌的纤维素酶、酯酶、淀粉酶和蛋白酶还存在结构和营养利用方面的差异。     

桉树生长和防御相关酶对摩西管柄囊霉和青枯菌的响应

【目的】研究桉树响应从枝菌根真菌和青枯菌的生长和生理特征,为应用菌根化育苗技术防控桉树青枯病提供理论支撑。【方法】以巨桉幼苗为对象,研究摩西管柄囊霉菌根化和青枯菌侵染进程对寄主生长和防御相关酶活性的影响。【结果】1）摩西管柄囊霉能与巨桉根系良好共生,菌根化桉树株高、地径、干质量、根冠比分别为非菌根化处理的2.30、4.38、2.75和1.71倍。与非菌根化处理相比,菌根化巨桉幼苗根长、根直径、根表面积、根体积、根冠比、根系和叶片中氮、磷和钾含量均显著增加（P<0.05）。2）随青枯菌侵染时间的增加,菌根化桉树叶片中的防御相关酶活性显著高于对应的非菌根化处理,过氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）、β-1,3-葡聚糖酶活性在菌根化桉树组织中先升高后降低,分别在青枯菌侵染48、24、144 hpi时达到峰值;菌根化桉树叶片中的超氧化物歧化酶（SOD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）和几丁质酶活性先升高后降低,在青枯菌侵染96 hpi后达到峰值。3）接种摩西管柄囊霉对桉树青枯病的防控效果为81.67%。【结论】接种摩西管柄囊霉显著促进桉树幼苗健壮生长,受青枯菌侵染后,菌根化桉树幼苗快速和...     

纤维素高效降解真菌的筛选及其降解森林地表可燃物的效果

【目的】筛选纤维素的降解真菌,探究其对森林地表可燃物的分解效果,以期利用纤维素高效降解真菌促进降解森林地表可燃物,从而降低森林火灾风险。【方法】采集东北林业大学帽儿山实验林场的兴安落叶松、胡桃楸、水曲柳和云杉人工林内的可燃物,采用孟加拉红培养基进行真菌的分离培养,采用刚果红染色法,根据测定菌株的纤维素分解指数筛选高活性纤维素酶菌株,对其进行形态学及分子鉴定;以阔叶、针叶与针阔混交可燃物碎块为分解基质,接入高活性纤维素酶菌株菌液,恒温培养80天,定期取样测定综纤维素含量,分析纤维素分解过程并筛选出对森林地表可燃物中纤维素降解效果最好的菌株;结合扫描电镜超微结构观察结果进行验证。选取筛选出的纤维素高效降解真菌菌株,制取菌饼并接入麦芽浸粉培养基中,恒温振荡培养5天,得到的菌悬液作为单一菌剂,2菌种菌悬液等体积混合为混合菌剂,分低、中、高剂量喷洒到不同样地中装有胡桃楸、兴安落叶松以及胡桃楸-兴安落叶松混交可燃物的凋落物袋内,每月采集凋落物袋测定综纤维素质量分数,分析不同菌剂对可燃物中综纤维素降解效果。【结果】根据孟加拉红氯霉素培养基筛选出的15株真菌在CMC-Na培养基上产生的水解圈大小,筛选出8株高活性纤维素酶菌株,菌株B2(枝细枝孢)的纤维素分解指数最大;根据地表可燃物样品中的纤维素降解结果,菌株A4(紧密帚枝霉)对3种可燃物基质中综纤维素的降解能力最强,其次是菌株A2(肉色隔孢伏革菌);根据扫描电镜观察结果,菌株A4的菌丝可以黏附在叶片表面并侵入叶片组织,通过分泌纤维素酶降解叶片中的综纤维素;不同剂量使可燃物基质综纤维素降解率由大到小呈现大剂量、中剂量、小剂量的规律,且施加菌剂的3种基质综纤维素降解率均高于对照;施加菌剂的3种可燃物基质综纤维素降解率由大到小均表现为:菌剂C(混合菌剂)菌剂B(菌株A4)菌剂A(菌株A2)。【结论】菌株A4为室内降解试验筛选出的高效纤维素降解真菌,在野外对地表可燃物中综纤维素也表现出较强降解能力,且与菌株A2构建的混合菌剂对可燃物中综纤维素降解效果更佳,可在后续研究中摸索其最佳产酶条件,以实现林区地表可燃物更大程度上的降解。     

木质素降解真菌的筛选及其对森林地表可燃物的降解效果

【目的】筛选帽儿山人工林地表可燃物中的木质素降解真菌,探究木质素降解菌对不同森林地表可燃物的分解效果,以期找到能够有效降解森林可燃物的真菌菌种,为应用生物降解方法降低森林地表可燃物载量从而降低森林火灾发生概率与森林火险指数提供理论依据和基础数据。【方法】采集东北林业大学帽儿山实验林场尖砬沟森林培育实验站的落叶松、胡桃楸、水曲柳纯林与胡桃楸-落叶松、水曲柳-落叶松混交林内的凋落叶,采用添加抗生素的麦芽浸粉(MEA)培养基进行真菌的分离培养,之后采用愈创木酚平板显色法进行初筛,根据测定菌株的显色情况及菌落圈与显色圈比值筛选高活性木质素降解酶菌株,复筛利用苯胺蓝平板脱色法对菌株木质素氧化酶系进行定性测定,对2次筛选获得的菌株进行形态学及分子鉴定,然后以胡桃楸、水曲柳、落叶松3种可燃物样品作为分解基质,接入木质素降解菌单一及混合菌液,于28℃恒温培养7 d,分别测定经培养后基质中的木质素含量,分析木质素分解规律。【结果】由MEA培养基筛选出的9株真菌有5株在PDA-愈创木酚培养基上发生了显色反应,且菌株B6和Y3的R/r <1,即该2株菌能优先降解木质素;苯胺蓝平板脱色试验结果显示菌株B6和Y3均可使培养基蓝色褪去,即均具有LiP与MnP酶活性;经形态学及分子鉴定,菌株B6为白囊耙齿菌Irpex lacteus,菌株Y3为桦褶孔菌Lenzites betulinus;地表可燃物样品降解试验结果显示,经单一菌液与两者混合菌液培养后,样品中木质素含量均有下降,且经混合菌液处理后的3种可燃物基质表现出相对较好的降解效果;3种基质降解率从高到低依次为水曲柳>胡桃楸>落叶松;菌种Y3对木质素的降解效果较菌种B6好。【结论】混合菌液对可燃物中木质素的分解能力较单一菌液强;菌株B6和Y3之间无拮抗作用,混合后产生协同效应,使木质素降解酶系活力提高,从而可提高木质素降解率;菌种Y3降解能力强于B6;可燃物样品中木质素降解效果因基质不同而存在差异,阔叶可燃物比针叶可燃物易分解。经筛选出的木质素降解菌能有效降解可燃物中的木质素,可在一定程度上减少森林地表可燃物载量,从而降低森林火灾风险。     

Paraconiothyium variable GHJ-4木质素降解酶的酶学性质

【目的】研究木质素降解子囊菌Paraconiothyrium variabile GHJ-4分泌的漆酶(laccase)、锰过氧化物酶(MnP)和木质素过氧化物酶(LiP)3种木质素降解酶的酶活性变化规律及其酶学性质,为利用该菌株进行木质素降解酶的工业化生产和应用提供依据。【方法】分别以愈创木酚、2,6-二甲基苯酚和黎芦醇为底物测定laccase,MnP和LiP的酶活性,研究3种酶的最适反应温度和pH、温度和pH稳定性及金属离子对其活性的影响。【结果】GHJ-4菌株发酵18,15和21天后,分别获得laccase,MnP和LiP最高酶活为1 390.3,30.3和52.5 U·mL~(-1)。laccase的最适反应温度为55℃左右,最适反应pH为5.5左右,在55℃以下、pH 4.0~7.0的范围内较为稳定;MnP的最适反应温度为60℃左右,最适反应pH为5.0左右,在55℃以下、pH 4.0~9.0的范围内较为稳定;LiP的最适反应温度为40℃左右,最适反应pH为3.0左右,在40℃以下、pH 2.0~4.0的范围内较为稳定。Mg~(2+),Zn~(2+),Cu~(2+),K~+对laccase起促进作用,Na~+和Zn~(2+)对LiP起促进作用,Mn~(2+)对MnP起激活作用,而Fe~(3+),Ca~(2+),Pb~(2+),Co~(2+),Al~(3+)对3种酶均起抑制作用,其中尤以5 mmol·L~(-1)Fe~(3+)对3种酶的抑制作用最强。【结论】温度、pH及金属离子对Paraconiothyrium variabile GHJ-4 3种木质素降解酶的酶学特性均有着不同程度的影响。     

油松人工林下真菌群落对凋落物分解的影响

为探究真菌群落在凋落物分解进程中的影响,以在油松人工林中分离纯化而来的3株真菌Irpex lacteus(白囊耙齿菌)、Collybia subnuda(金钱菌属)和Trametes hirsuta(毛栓菌)为供试菌株,经组合形成不同真菌群落,以油松针叶、蒙古栎阔叶凋落物及两者混合形成3种类型分解基质,通过发酵纯培养的方法,测定了底物有机质量损失及发酵过程中羧甲基纤维素酶(CMCase)活性变化,并验证了酶活性与底物降解的关系。结果表明:凋落物类型和真菌组合均显著影响凋落物分解,且两者之间存在交互作用;真菌多样性提高了凋落物的分解速率;凋落物混合产生了正面非加性效应,且这种效应主要由阔叶引起。质量损失率和纤维素酶活性呈现类似的规律,即同一凋落物类型下,组合菌群大于或等于单一菌群;同一真菌群落下,阔叶混合针叶。     

油茶丙二酰单酰CoA:ACP转酰基酶基因的克隆与原核表达

【目的】油茶种仁含油率较低且易遭逆性环境等的影响,这些都严重影响和制约了油茶产业的快速发展。丙二酰单酰Co A:ACP转酰酶是脂肪酸合成酶(FASⅡ)复合体的组成酶之一,在脂肪酸合成中起着装载作用,它的酶促反应产物丙二酰单酰ACP是脂肪酸合成关键组成部分。开展该基因的功能研究,能为油茶的分子遗传育种奠定基础。【方法】以油茶品种‘华硕’种子为材料,借助其种子转录组和表达谱数据库,通过RACE技术,克隆丙二酰单酰Co A:ACP转酰酶基因并对该基因进行生物信息学分析。利用常规的酶切连接技术构建基因的原核表达载体,并利用α酮戊二酸脱氢酶(KDH)偶联系统测定表达产物的酶活性。【结果】丙二酰单酰Co A:ACP转酰酶基因的全长c DNA 1 867 bp,含有1 131 bp的开放读码框,编码376个氨基酸,具有58个氨基酸长度的叶绿体转运肽,该基因被命名为Co MCAT(Gen Bank登录号KJ910337)。在malonyl-Co A结合位点和ACP结合位点上分别存在高度保守的基序"GQGXQ"和"GXSXG"。原核表达载体p ET30a-Co MCAT在BL21(DE3)细胞中被成功地诱导表达,目的重组蛋白分子量约为40 k Da。酶活性分析表明,重组蛋白Co MCAT的最佳催化温度为30℃,最佳p H为7.0,比酶活性约为2.384 U·μg-1。【结论】以本实验室构建的油茶转录组数据库为基础,首次克隆获得油茶MCAT基因的全长c DNA序列,构建其原核表达载体在宿主细胞BL21(DE3)中成功诱导表达目的蛋白,并对重组蛋白进行初步的酶活性分析。研究结果为今后进一步深入开展和揭示油茶MCAT基因在油脂合成的代谢过程中的作用奠定基础。     

3种绿僵菌对筛胸梳爪叩甲幼虫的毒力及保护酶活性的影响

【目的】探索绿僵菌侵染后竹林筛胸梳爪叩甲幼虫保护酶系统的应答反应,为筛选高致病力的绿僵菌菌株提供依据。【方法】生物测定平沙绿僵菌WP08菌株、金龟子绿僵菌WTKH菌株及蝗虫绿僵菌菌株3种菌株在不同浓度条件下对该幼虫的致病力,同时测定不同侵染时期幼虫超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)及过氧化氢酶(CAT)3种保护酶含量及活性变化情况。【结果】3株绿僵菌对筛胸梳爪叩甲幼虫均具有致死性,WP08菌株最优,WTKH菌株次之,蝗虫绿僵菌最低。不同菌株的致病力随着浓度的增加而提高,WP08菌株在108spore·g~(-1)干土浓度条件下的致病效果最好,16天时供试幼虫已经全部死亡,但与107spore·g~(-1)干土浓度条件下的致病效果无显著差异。幼虫的3种保护酶在抗绿僵菌侵染过程中其活性变化趋势不同,SOD活性变化无显著差异,CAT活性变化则表现为先下降后上升再下降的趋势,POD活性波动虽与CAT相似,但其后期(5~7天)差异不显著。【结论】平沙绿僵菌WP08菌株对筛胸梳爪叩甲幼虫的致病性优于其他2种菌株,可作为林间应用的首选菌株。绿僵菌可对竹林金针虫体内的3种保护酶活性产生不同程度的影响,且在本次取样时间内CAT的活性变化较明显。     

伊氏线虫真菌碳氮条件下的表型和毒力基因表达差异

【目的】研究松材线虫生防真菌伊氏线虫菌(EV)碳氮条件下表型和毒力基因表达差异,为培养高毒力菌株提供依据。【方法】分别选取碳、氮培养基培养EV,测定生长速度及产孢量。收获菌丝体并提取RNA进行建库和差异分析。结合经FDR法校正后的P值及以2为底的倍数变化的对数的绝对值(|log2Fold Change|)判断差异表达的显著性。【结果】EV在氮培养条件下生长速度更快,且基因表达的总量和特异表达的数量均高于碳培养条件下表达的数量。氮组相对碳组显著差异表达的基因共有7 138个,其中3 571个显著上调,3 567个显著下调;474个基因在氮组中特异表达,295个基因在碳组中特异表达,且氮组特异表达的基因涉及杀线虫基因的数量高于碳组。经过聚类分析,差异基因表达水平变化趋势分为4个类群,其中,在氮组表达远高于碳组表达的基因数量为165个;在碳组表达远高于氮组表达的基因数量仅有65个。枯草杆菌蛋白酶及毒素合成相关基因在氮组中显著上调表达,其中枯草杆菌蛋白酶在氮组中表达量为相对于碳组表达的2.29～363.52倍。【结论】碳、氮培养基对EV生防真菌的转录具有显著影响,氮培养条件下表达的总基因数量和特异表达的基因数量高于碳培养条件下的基因表达。具有杀灭和侵染线虫作用的枯草杆菌蛋白酶、毒素合成相关基因在氮培养下显著上调。可为高毒力EV菌株的培养、基因功能研究和菌株改良提供重要依据。     

荧光假单胞菌与红绒盖牛肝菌共接种对杨树根际土壤酶活性及微生物多样性的影响

【目的】探究荧光假单胞菌与红绒盖牛肝菌共接种条件下NL-895杨根际土壤酶活性和土壤微生物功能多样性的变化,从微生态水平揭示溶磷细菌与外生菌根真菌互作对NL-895杨的促生机制。【方法】采用盆栽试验考察荧光假单胞菌JW-JS1与红绒盖牛肝菌(Xc)共接种后NL-895杨根际土壤酶(酸性磷酸酶、脱氢酶和转化酶)的活性变化,并通过BIOLOG微孔板法分析共接种对NL-895杨根际土壤微生物群落和功能多样性的影响。【结果】从整体趋势来看,不同接种处理后NL-895杨根际土壤酶活性均有所增强,土壤酸性磷酸酶、脱氢酶和转化酶活性均大于对照,其中,共接种JW-JS1+Xc处理对土壤酸性磷酸酶和转化酶活性的促进最为明显;接种150天后,不同接种处理土壤微生物的AWCD值均高于CK(培养24～48 h除外),且随着培养时间的延长呈先上升后稳定的趋势;培养96 h后,共接种JW-JS1+Xc处理土壤微生物McIntosh优势度指数和碳源利用丰富度指数显著高于单接种Xc或JW-JS1和CK(P<0.05),而Shannon丰富度指数和Simpson优势度指数显著低于单接种Xc或JW-JS1和CK(P<0.05);不同接种处理NL-895杨根际土壤微生物对BIOLOG微孔板中6大类碳源的利用能力差异显著(P<0.05)。【结论】荧光假单胞菌JW-JS1与外生菌根真菌Xc共接种对NL-895杨根际土壤酶活性和土壤微生物功能多样性的提高具有一定的促进作用,有利于其土壤肥力的改善,进而促进NL-895杨的生长。与单接种相比,溶磷细菌与外生菌根真菌共接种可更有效地提高杨树根际土壤酶活性和土壤微生物多样性。     

杨树腐烂病菌胞外分泌复合体亚基CcExo70的功能

【目的】对杨树腐烂病菌金黄壳囊孢胞外分泌复合体亚基CcExo70进行功能分析,探究其在杨树腐烂病菌生长发育及致病过程中的生物学功能,为深入了解杨树腐烂病菌致病机制以及制定病害防控策略提供科学依据。【方法】1)利用PCR技术克隆得到CcExo70基因的DNA序列; 2)通过生物信息软件对其编码的氨基酸序列进行特征分析并构建其同源基因的系统发育树; 3)通过PEG介导的遗传转化法得到CcExo70基因的敲除突变体及回补菌株; 4)通过PDA平板生长试验和PDB摇培试验,分析敲除CcExo70基因对该病菌生长发育、菌丝形态及H2O2胁迫响应的影响;通过对1年生欧美杨健康枝条烫伤接种的方法,测定CcExo70基因对该病菌致病性的影响; 5)利用荧光增白剂(CFW)、二氨基联苯胺(DAB)和FM4-64染剂探究各菌株中几丁质沉积、活性氧积累及内吞作用情况; 6)通过蛋白质组测序分析,筛选可能受CcExo70调控分泌的外泌蛋白。【结果】1)在杨树腐烂病菌中克隆得到了一个CcExo70基因,该基因全长1 992 bp,包含1个内含子,编码636个氨基酸。2)系统发育和序列比对分析表明,CcExo70与其他病原真菌的同源基因在进化上是高度保守的。3)利用遗传转化法筛选得到2个敲除突变体(ΔCcExo70-8、ΔCcExo70-9),并获得了回补菌株(ΔCcExo70/C)。4)表型分析发现,与野生型和回补菌株相比,CcExo70敲除突变体在菌丝生长、形态发生、氧化应激反应和致病力等方面存在显著的缺陷。5) CFW染色观察显示,野生型和回补菌株菌丝尖端存在明显的几丁质沉积,而敲除突变体菌丝尖端未见明显的几丁质沉积但菌丝隔膜异常增加。此外,共聚焦显微镜观察发现,与野生型和回补菌株相比,CcExo70敲除突变体的内吞作用显著延迟。6)蛋白组测序分析发现,8个候选的外泌蛋白在CcExo70敲除突变体胞外培养滤液中的含量显著低于在野生型胞外培养滤液中的含量(降低了50%以上),其中有4个候选的外泌蛋白(CcSP2、CcSP3、CcSP6、CcSP7)在胞外培养滤液中的含量显著高于其对应菌株的胞内含量,其中包括1个候选的效应分子(CcSP2)和2个糖苷水解酶(CcSP6和CcSP7),表明这4个外泌蛋白的分泌受到了CcExo70的调控。【结论】胞外分泌复合体亚基CcExo70在杨树腐烂病菌的生长、胁迫响应、内吞作用和致病性等方面起着重要的调控作用。