红鳍东方鲀SREBP-1基因的电子克隆及生物信息学分析

利用斑马鱼的SREBP-1 的氨基酸序列NP_001098599.1 为探针,对红鳍东方鲀基因组数据库进行BLAST 分析,获得红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）的固醇调节元件结合蛋白-1 （Sterol regulatory element bindingprotein-1,SREBP-1）的cDNA 序列及相应的氨基酸序列。采用生物信息学方法对其基本理化性质、蛋白质结构及功能结构域进行分析。结果发现红鳍东方鲀SREBP-1 基因的开放阅读框全长3 330 bp,共编码1 109 个氨基酸;红鳍东方鲀SREBP-1 的氨基酸序列与黄斑蓝子鱼、大西洋鲑、斑马鱼、人、牛及原鸡的同源性分别为81%、73%、72%、55%、55%、54%和54%;系统进化分析结果表明,红鳍东方鲀SREBP-1 与黄斑蓝子鱼的进化关系最为密切,亲缘关系最近;红鳍东方鲀SREBP-1 蛋白中α-螺旋较多,该蛋白质氨基端包含1 个bHLH-zip 的结构。     

红鳍东方鲀SREBP-1基因的电子克隆及生物信息学分析

利用斑马鱼的SREBP-1的氨基酸序列NP_001098599.1为探针,对红鳍东方鲀基因组数据库进行BLAST分析,获得红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)的固醇调节元件结合蛋白-1 (Sterol regulatory element binding protein-1,SREBP-1)的cDNA序列及相应的氨基酸序列.采用生物信息学方法对其基本理化性质、蛋白质结构及功能结构域进行分析.结果发现红鳍东方纯SREBP-1基因的开放阅读框全长3 330 bp,共编码1 109个氨基酸;红鳍东方鲀SREBP-1的氨基酸序列与黄斑蓝子鱼、大西洋鲑、斑马鱼、人、牛及原鸡的同源性分别为81％、73％、72％、55％ 、55％、54％和54％;系统进化分析结果表明,红鳍东方纯SREBP-1与黄斑蓝子鱼的进化关系最为密切,亲缘关系最近;红鳍东方鲀SREBP-1蛋白中α-螺旋较多,该蛋白质氨基端包含1个bHLH-zip的结构.     

红鳍东方鲀感染哈氏弧菌前后组织中socs3 基因的表达差异分析

为研究红鳍东方鲀Takifugur ubripes免疫系统相关细胞因子信号传导抑制因子-3(Suppressor of cytokine signaling,SOCS3)的表达情况,采用相对实时荧光定量PCR方法比较了体质量为(290.34±5.13)g的健康红鳍东方鲀脑、脾脏、肠、鳃、肌肉和肝脏6个不同组织中socs3基因表达量,以及感染哈氏弧菌Vibrio harveyi后肝脏、脾脏和肠组织socs3基因表达量的变化。结果表明:socs3基因在健康红鳍东方鲀肝脏组织、肌肉组织中均有显著表达(P0.05),在鳃、脑、脾脏、肠组织中表达不显著(P0.05);感染哈氏弧菌的红鳍东方鲀,在感染后的24、48 h时,肝脏组织socs3的表达量显著高于0 h(P0.05),分别约为初始时的10倍和8倍,其他组织变化不明显(P0.05);利用NCBI的ORF Finder程序鉴定所得红鳍东方鲀SOCS3(NP_001072096.1)序列的潜在开放阅读框(ORF),通过模块化结构研究工具来鉴定保守结构域和信号肽,表明socs3的cDNA序列全长1533 bp,其中5′端非编码区为215 bp,开放阅读框(ORF)长度为606 bp,3′端非编码区为713 bp,共编码201个氨基酸;利用MEGA 6.0软件进行氨基酸序列比对并构建系统发育树,结果显示,硬骨鱼类单独聚为一支,与哺乳动物、两栖动物及鸟类分开,硬骨鱼类中的SOC3b单独聚为一支,红鳍东方鲀与其同科的黑青斑河豚Tetraodon nigroviridis的SOC3聚在一起,并与三刺鱼Gasterosteus aculeatus属于同一分支。本研究结果可为红鳍东方鲀免疫应答的研究提供数据支持。     

红鳍东方鲀感染哈氏弧菌前后组织中socs3基因的表达差异分析

为研究红鳍东方鲀Takifugur ubripes免疫系统相关细胞因子信号传导抑制因子-3(Suppressor of cytokine signaling,SOCS3)的表达情况,采用相对实时荧光定量PCR方法比较了体质量为(290.34±5.13)g的健康红鳍东方鲀脑、脾脏、肠、鳃、肌肉和肝脏6个不同组织中socs3基因表达量,以及感染哈氏弧菌Vibrio harveyi后肝脏、脾脏和肠组织socs3基因表达量的变化。结果表明:socs3基因在健康红鳍东方鲀肝脏组织、肌肉组织中均有显著表达(P<0.05),在鳃、脑、脾脏、肠组织中表达不显著(P>0.05);感染哈氏弧菌的红鳍东方鲀,在感染后的24、48 h时,肝脏组织socs3的表达量显著高于0 h(P<0.05),分别约为初始时的10倍和8倍,其他组织变化不明显(P>0.05);利用NCBI的ORF Finder程序鉴定所得红鳍东方鲀SOCS3(NP_001072096.1)序列的潜在开放阅读框(ORF),通过模块化结构研究工具来鉴定保守结构域和信号肽,表明socs3的cDNA序列全长1533 bp,其中5′端非编码区为215 bp,开放阅读框(ORF)长度为606 bp,3′端非编码区为713 bp,共编码201个氨基酸;利用MEGA 6.0软件进行氨基酸序列比对并构建系统发育树,结果显示,硬骨鱼类单独聚为一支,与哺乳动物、两栖动物及鸟类分开,硬骨鱼类中的SOC3b单独聚为一支,红鳍东方鲀与其同科的黑青斑河豚Tetraodon nigroviridis的SOC3聚在一起,并与三刺鱼Gasterosteus aculeatus属于同一分支。本研究结果可为红鳍东方鲀免疫应答的研究提供数据支持。     

红鳍东方鲀gsdf基因的克隆及表达模式分析

为研究红鳍东方鲀Takifugu rubripes的性别决定因子(gonadal soma derived factor,GSDF),利用c DNA末端快速扩增技术(RACE)首次克隆了红鳍东方鲀gsdf基因(Trgsdf)的c DNA全长序列(Gen Bank登陆号:KR914667)。结果表明:Trgsdf c DNA序列全长为1734 bp,其中5'端非编码区144 bp,开放阅读框648 bp,3'端非编码区942 bp,共编码215个氨基酸;预测的氨基酸序列中存在1个长度为19个氨基酸的信号肽和相同长度的跨膜区,1个N-糖基化位点NST,1个TGF-β家族成员特有的保守结构域;BLAST同源性分析结果显示,红鳍东方鲀GSDF氨基酸序列与其他鱼类的相似性为26%~58%;系统发育分析结果显示,鱼类GSDF单独聚为一支,与TGF-β超家族内的其他成员分开,红鳍东方鲀与青鳉Oryzias latipes GSDF的亲缘关系最近,先聚为一支,后与三斑海猪鱼Halichoeres trimaculatus聚在一起,与矛尾鱼Latimeria menadoensis的GSDF亲缘关系最远;应用RT-PCR技术检测Trgsdf mRNA在雌性和雄性红鳍东方鲀成鱼不同组织中的表达,结果显示,Trgsdf mRNA在卵巢和精巢中高表达,在皮肤和肌肉组织中微量表达,在其他组织中无表达;采用相对实时荧光定量PCR方法比较了成鱼卵巢和精巢中Trgsdf mRNA的表达量,结果显示,Trgsdf mRNA在精巢中的表达量显著高于卵巢(P0.05),约为卵巢表达量的6倍。研究表明,gsdf基因可能在红鳍东方鲀的性腺尤其是精巢的分化和发育过程中起着重要的作用。     

暗纹东方鲀sox9基因的克隆和组织表达分析

为初步探究暗纹东方鲀sox9基因在性腺发育和性别分化过程中的作用,通过设计兼并引物、RACE及荧光定量PCR技术,成功克隆出暗纹东方鲀sox9基因的cDNA全长序列,并分析其相应的生物信息学特征及其在雌雄个体的组织表达水平。结果表明:sox9a基因cDNA全长为1 248 bp(NCBI登录号:MH218818),包括684 bp的ORF,编码227个氨基酸,297 bp的5′UTR和267 bp的3′UTR。sox9b基因全长为1 941 bp(NCBI登录号:MH218819),包括1 470 bp的ORF,编码489个氨基酸,306 bp的5′UTR和165 bp的3′UTR。同源性和系统发育分析结果表明暗纹东方鲀sox9基因与红鳍东方鲀同源性最高,亲缘关系最近。氨基酸多重序列比对结果显示两个Sox9氨基酸序列的HMG box结构域在哺乳动物和鱼类中均高度保守。荧光定量PCR分析显示两个sox9基因普遍存在于雌鱼和雄鱼的各个组织中,且均在雌鱼下丘脑中表达量最高,在精巢中有少量表达,卵巢中几乎不表达。总体来说,除少数组织外,两个sox9基因在雌鱼组织中的表达量普遍高于雄鱼。本研究为了解暗纹东方鲀sox9的遗传特性及相关的生理功能,探索性别分化与性腺发育的分子调控机制提供理论依据。     

卵形鲳鲹组织蛋白酶L基因的克隆及其表达分析

[目的]明确卵形鲳鲹组织蛋白酶L基因(TroCatL)的遗传进化规律及其组织表达水平,为研究CatL生物学功能及其对病原的抗病机理提供理论依据.[方法]应用RT-PCR和RACE技术克隆TroCatL基因全长cDNA,采用生物信息学方法对其序列特征进行分析;并以实时荧光定量PCR(qPCR)检测TroCatL基因在健康组织中的表达情况及其表达与溶藻弧菌感染的关联性.[结果]TroCatL基因全长cDNA为1492 bp(GenBank登录号MH036350),包括开放阅读框(ORF)1011 bp、5'端非翻译区(5'-UTR)120 bp和3'端非翻译区(3'-UTR)361 bp. TroCatL基因编码336个氨基酸残基,其理论等电点(pI)5.7,预测分子质量37.93 kD,且存在CatL特有的保守结构域(ERFNIN、GNFD和GCXGG基序)及由139Cys、279His和303Asn组成的半胱氨酸蛋白酶保守活性位点.TroCatL氨基酸序列与其他鱼类CatL氨基酸序列的同源性高达83.9%~95.2%,尤其与鲈形目鰤鱼的亲缘关系最近. TroCatL基因mRNA在健康卵形鲳鲹组织中均有表达,以在肝脏中的表达最高,在脑组织中的表达最低.经溶藻弧菌感染后,TroCatL基因mRNA在肝脏、脾脏和血液中的表达水平均上调,肝脏和脾脏中的TroCatL基因mRNA在攻毒后24 h达峰值,血液中的TroCatL基因mRNA在感染后12 h达最高值.[结论]TroCatL蛋白结构域及其催化活性位点在遗传进化过程中较保守,通过参与机体的免疫应答反应,在卵形鲳鲹抵御细菌或病毒侵染的过程中扮演重要角色.     

红鳍东方鲀IL-2基因克隆及序列分析

鱼白细胞介素-2是近年来新发现的一类细胞因子.根据Bird等发表的河豚IL-2基因序列设计一对特异性引物,通过RT-PCR方法扩增和克隆了红鳍东方鲀(Fugu rubripes)白介素-2的核苷酸序列.该cDNA序列由490nt组成,编码由149个氨基酸组成的前体蛋白.序列分析表明,红鳍东方鲀IL-2核苷酸序列和氨基酸序列与目前已知的其它物种IL-2的核苷酸及氨基酸的同源性分别位于34% ～44%和24% ～43%之间,N端存在长22个氨基酸的信号肽,含有形成2个链内二硫键的4个半胱氨酸.遗传进化分析表明,红鳍东方鲀IL-2在遗传进化上具有其独立性.     

红鳍东方鲀IL-2基因克隆及序列分析

鱼白细胞介素-2是近年来新发现的一类细胞因子.根据Bird等发表的河豚IL-2基因序列设计一对特异性引物,通过RT-PCR方法扩增和克隆了红鳍东方鲀(Fugu rubripes)白介素-2的核苷酸序列.该cDNA序列由490nt组成,编码由149个氨基酸组成的前体蛋白.序列分析表明,红鳍东方鲀IL-2核苷酸序列和氨基酸序列与目前已知的其它物种IL-2的核苷酸及氨基酸的同源性分别位于34% ～44%和24% ～43%之间,N端存在长22个氨基酸的信号肽,含有形成2个链内二硫键的4个半胱氨酸.遗传进化分析表明,红鳍东方鲀IL-2在遗传进化上具有其独立性.     

红鳍东方鲀PPARγ真核基因表达载体构建及亚细胞定位研究

[目的]旨在克隆红鳍东方鲀PPARγ基因的cDNA,并通过构建真核表达载体pCMV-3Tag-4A-PPARγ,分析myc-PPARγ融合蛋白在大鼠L6细胞的表达及亚细胞定位。[方法]利用RT-PCR技术克隆红鳍东方鲀PPARγ基因的cDNA,构建pCMV-3Tag-4A-PPARγ重组质粒,转染至大鼠L6细胞,共聚焦显微镜下观察myc-PPARγ的亚细胞定位。[结果]红鳍东方鲀PPARγ基因cDNA ORF全长1557 bp,共编码518个氨基酸,pCMV-3Tag-4A-PPARγ融合蛋白在大鼠L6细胞核中表达,为深入探讨鱼类PPARγ生物学功能奠定了基础。     

多年生黑麦草质膜型水通道蛋白基因LpAQP的克隆及功能分析

【目的】研究黑麦草在逆境胁迫下水分代谢的基因调控,克隆黑麦草质膜型水通道蛋白基因的全长cDNA序列,并对其表达模式进行研究。【方法】利用RACE技术从黑麦草（品种“顶峰”）中获得LpAQP全长cDNA序列;运用生物信息学软件分析其编码蛋白;构建LpAQP与GFP融合的瞬时表达载体,采用基因枪法转入洋葱表皮细胞,观察其细胞定位;通过real time-PCR分析LpAQP的表达模式,并用Southern杂交分析其拷贝数。【结果】克隆获得LpAQP的cDNA序列,GenBank登录号为JX569791,其开放阅读框（ORF）为867 bp,编码288个氨基酸,蛋白质分子量为30.7 kD。该基因含有2个NPA单元,6个跨膜区,LpAQP含有与MIP家族完全一致的蛋白质保守区,其氨基酸序列与其它禾本科PIP类质膜型水通道蛋白同源性较高。物种间聚类分析表明LpAQP与大麦、小麦质膜型水通道蛋白同源性较高。LpAQP可能定位于细胞质膜上。通过Southern杂交分析,发现LpAQP在黑麦草基因组中以单拷贝存在。real time-PCR分析表明LpAQP在黑麦草茎部表达高于叶和根,持续干旱胁迫会导致LpAQP表达量先上调后下降。【结论】克隆获得黑麦草质膜型水通道蛋白基因LpAQP,其以单拷贝形式存在,在黑麦草根、茎、叶中均有表达,尤其是茎中表达最高。其表达受干旱胁迫影响。     

小麦蒜氨酸酶基因TaAly1的克隆及表达特征分析

【目的】克隆小麦蒜氨酸酶基因CDs区,并对其进行序列特征分析和实时定量表达检测。【方法】采用电子延伸结合RT-PCR方法,从小麦叶片分离出蒜氨酸酶基因,网络资源分析其序列特征,实时定量PCR技术检测其在不同条件下的表达情况。【结果】克隆到1个小麦蒜氨酸酶基因TaAly1,其开放阅读框全长1 023 bp,编码340个氨基酸,与水稻和玉米蒜氨酸酶基因的同源性为70%,其基因组DNA序列含有3个内含子;TaAly1在小麦幼苗根部几乎不表达,在叶部表达量最高,其次是茎部;植物激素GA、MeJA、SA处理及条锈菌接种和干旱、低温处理,均能诱导该基因的表达量迅速增加。【结论】成功克隆了小麦TaAly1基因的CDs区,该基因可能通过依赖GA、MeJA和SA的信号通路参与小麦与条锈病的互作。     

哈茨木霉几丁质合酶基因ThChsC的克隆及序列分析

 【目的】克隆哈茨木霉几丁质合酶基因全序列,并对序列进行生物信息学分析。【方法】利用多聚酶链式反应（PCR）和染色体步移技术（genome walking）克隆几丁质合酶基因全序列;应用生物信息学软件对获得的基因序列及编码的蛋白序列进行分析;通过同源建模,对蛋白质的三维结构进行预测。【结果】从哈茨木霉（Trichoderma harzianum Th-33）中扩增得到几丁质合酶基因ThChsC（GenBank登录号HQ419000）,编码区（CDS）长为2 835 bp,由4个外显子和3个内含子组成,开放阅读框（ORF）长2 688 bp,编码895个氨基酸。序列比对和同源性分析显示,该基因与串珠状赤霉（Gibberella moniliformis,ACY08039.1）和禾生刺盘孢菌（Colletotrichum graminicola,AAL23718.1）几丁质合酶基因相似性最高,分别为80%和81%;相应的氨基酸序列同源性均为80%,系统进化分析表明,ThChsC属于III型几丁质合酶亚家族。几丁质合酶ThChsC含有1个Chitin_synth_1结构域,1个Chitin_synth_1N结构域,1个Chitin_synth_2结构域,3个跨膜结构域,不含信号肽,为膜结合蛋白。对预测的三维结构分析表明,ThChsC含有糖基转移酶的保守DHD结构域。【结论】从哈茨木霉Th-33中克隆得到几丁质合酶基因ThChsC,对该基因的深入研究有助于探索哈茨木霉几丁质合成的机制。     

条锈菌诱导的小麦病程相关蛋白TaPR10基因的克隆及特征分析

 【目的】克隆条锈菌诱导的小麦病程相关蛋白PR10基因,研究其在小麦成株抗条锈病防御反应中的作用。【方法】采用电子克隆、RT-PCR技术,从条锈菌侵染的小麦兴资9104中,分离病程相关蛋白10基因;采用生物信息学技术预测分析该基因的DNA序列结构及其编码蛋白的保守域及基本特性;利用实时荧光定量RT-PCR技术,分析该基因在小麦成株期和苗期受条锈菌CYR32侵染后的表达情况。【结果】分离到病程相关蛋白10基因,命名为TaPR10,ORF长483 bp,编码由160个氨基酸组成的蛋白质TaPR10;TaPR10不含跨膜区、无信号肽、定位在胞内,除具有典型的病程相关蛋白Bet_v_I家族保守结构域外,还有其它4类功能保守域;与小麦、高粱、玉米和水稻等4种植物PR10蛋白的氨基酸序列相似性在80%左右;TaPR10 DNA序列内部存在188至271位84 bp的内含子序列,其拼接位点序列具有GT-AG双核苷酸序列;TaPR10基因表达分析的结果表明,TaPR10基因在成株期和苗期反应中表达量均上调,成株期表达高于苗期。【结论】首次分离到一个条锈菌CYR32诱导的小麦TaPR10基因,该基因可能参与了小麦成株抗条锈病防御反应。     

家蚕GSK3α氨基酸序列分析及其mRNA转录水平研究

【目的】对家蚕(Bombyx mori)糖原合成酶激酶3α(GSK3α)蛋白的氨基酸序列进行分析,并检测家蚕不同发育时期及蜕皮激素、饥饿处理下,GSK3α基因mRNA转录水平的变化。【方法】以家蚕为供试材料,采用RTPCR和荧光定量PCR方法,研究家蚕GSK3α在不同发育期的表达和转录情况,及激素和饥饿处理对其转录的影响。【结果】家蚕GSK3α基因由2个外显子和1个内含子构成,其中内含子长度为1 411 bp,预测家蚕GSK3α蛋白质分子质量为33.78 ku,等电点为7.61。氨基酸系统进化树和序列多重联配分析结果表明,家蚕GSK3α与所选几种昆虫GSK3α的序列一致性较高(79%～91%)。家蚕GSK3α mRNA在幼虫取食期转录水平较高,在蜕皮期转录水平较低。在注射后6 h内,蜕皮激素对家蚕GSK3α基因mRNA的转录无诱导作用,但在注射12～24 h有较强的诱导作用,而且在注射12 h时诱导活性达到最高,之后逐渐降低。饥饿处理对家蚕GSK3α mRNA的转录水平影响较小。【结论】家蚕GSK3α在昆虫的进化过程中是比较保守的,其表达受到蜕皮激素的调控,饥饿处理对其转录水平影响较小。     

龙眼胚性愈伤组织ACC氧化酶基因的克隆及其在龙眼体胚发生过程中的表达分析

【目的】分离克隆龙眼(Dimocarpus longan Lour.)胚性愈伤组织乙烯合成关键酶ACO(1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase)基因,并分析该基因在龙眼体细胞胚胎(以下简称龙眼体胚)发生过程中的表达情况。【方法】采用RT-PCR结合RACE法,获得龙眼胚性愈伤组织ACO基因的cDNA全长序列和DNA序列,运用生物信息学方法对序列进行分析,并通过实时荧光定量PCR(q-PCR)法研究该基因在龙眼体胚发生过程中的表达【。结果】克隆得到龙眼胚性愈伤组织ACO基因1315bp的cDNA全长序列(GenBank登录号为FJ534854),该cDNA的开放阅读框推定的氨基酸序列(含315个氨基酸)与其它植物ACO具有86%-47%同源性,包含了5'非编码区为86bp,3'非编码区为281bp,3'poly(A)尾长13bp;该基因的DNA序列(GenBank登录号为GU123929)长为1660bp,包含3个内含子,内含子的剪切位点均符合真核生物"GT-AG"规则;该基因在龙眼体胚各阶段均有表达,整个变化趋势呈字母"M"状。【结论】确定所获得的序列是龙眼胚性愈伤组织ACO基因的cDNA序列和DNA全长序列;该基因在不完全胚性紧实结构和心形胚的表达量为两个峰值。     

双齿围沙蚕CYP4基因的克隆及序列分析

根据已知的绿沙蚕Nereisvirens细胞色素氧化酶CYP342A1保守区设计引物,采用RACE技术首次从双齿围沙蚕Perinereisaibuhitensis体壁肌肉中克隆出细胞色素氧化酶CYP4基因全长序列。分析结果表明,该序列全长为1857bp,5’端非翻译区为186bp,3’端非翻译区为225bp,阅读框为1446bp,编码为481个氨基酸。第422～431氨基酸序列符合P450所具有的结构保守共有序列FxxGxxxCxG,第319～322氨基酸序列为K螺旋特征基序ExxR区,第282～294氨基酸序列含有CYP4家族特征序列EVDTFMFEGHDTr。经Blast与GenBank中已知物种的氨基酸序列进行同源性比对,CYP4与多毛类绿沙蚕Nereisvirens CYP4BB1、CYP342A1（AY453408）氨基酸同源性为73％、36％,与多毛类小头虫CapiteUacapitataCYP4ATI（AY574044）同源性为39％。据此推断,双齿围沙蚕CYP4基因属于CYP4B亚家族。     

黄瓜脂氧合酶基因CsLOX2的克隆及表达分析

【目的】以华北型黄瓜种质26号为材料克隆黄瓜脂氧合酶基因CsLOX2的cDNA全长并分析其序列特征,在此基础上研究该基因在果实发育进程中的表达模式、酶活性变化及相应的C6醛类物质含量,为研究脂氧合酶基因在黄瓜果实醛类香气物质形成中的作用机制奠定基础。【方法】以华北型黄瓜种质26号为材料,通过RT-PCR和RACE技术克隆黄瓜的脂氧合酶基因CsLOX2的cDNA全长并分析其生物信息学特征,对CsLOX2在果实发育进程中的表达模式进行Real-time PCR检测,通过气质联用（GC-MS）技术测定相应的C6醛类香气物质的含量并利用分光光度法测定LOX酶活性。【结果】华北型黄瓜种质26号的CsLOX2基因cDNA全长2 878 bp,ORF区为2 640 bp,编码879个氨基酸,推导的蛋白质分子量为99.39 kD,等电点为6.28。通过氨基酸序列比对发现,该基因编码的氨基酸序列具有脂氧合酶家族的3个重要特征区域及植物LOX中皆具有的6个高度保守的组氨酸,该序列与其它物种的脂氧合酶氨基酸序列具有较高的同源性。根据其N端序列特征推测CsLOX2属于I类LOX,具有13-LOX活性。Real time-PCR分析结果表明,该基因在花后3 d表达量最高,此后下降,至花后15 d最低;脂氧合酶的活性自开花当天逐渐上升,至花后12 d达到最高,此后下降;C6醛类香气含量在果实发育始期较高,随果实发育进程逐渐下降,至花后12 d最低。【结论】利用RACE技术克隆了华北型黄瓜种质26号脂氧合酶基因CsLOX2的cDNA全长,序列分析表明该基因具有植物LOXs的特征结构域。CsLOX2基因表达高峰先于脂氧合酶活性高峰的出现,C6醛类香气含量在果实发育始期较高,随果实发育进程逐渐下降。该研究结果将为进一步探讨脂氧合酶基因在黄瓜果实醛类香气物质形成中的作用机制奠定基础。     

核桃NBS类抗病基因类似物的序列特征及其与炭疽病的抗性

【目的】利用同源序列法分离核桃的NBS（Nucleotide binding site）类抗病基因类似物,为核桃抗炭疽病分子辅助育种及抗病基因的克隆提供基础。【方法】以35个核桃优系为试材,利用接种法鉴定供试材料对炭疽病的抗性;根据已知植物抗病基因的保守结构域P-loop和GLPL设计简并引物,以核桃优系的基因组DNA为模板,通过PCR扩增NBS类抗病基因同源序列片段,并分析所得NBS类抗病基因类似物与核桃优系炭疽病抗性的关系;利用BLASTN/X程序对所得NBS序列在GenBank数据库中进行同源性搜索;利用MEGA 5.2及DNAman 7.0等软件对其进行序列相似性分析和系统进化研究。【结果】35个供试核桃优系中,有20个优系为抗炭疽病类型（R）,其相对抗性指数在0.63-0.82;有5个优系为中抗类型（M）,相对抗性指数在0.27-0.56;有10个为感病类型（S）,相对抗性指数在0.00-0.21。PCR结果显示,从20个抗炭疽病优系的基因组扩增得到20条NBS类抗病基因类似序列;而在其它15个优系（5个中抗优系和10个感病优系）中未扩增到条带,表明核桃NBS序列与炭疽病抗性相关联。BLASTN显示,所得NBS序列在核苷酸水平与GenBank中已知的核桃NBS序列(jrRGAPGs)存在89%-100%同源性,与其它物种NBS序列的同源性在69%以上;BLASTX显示,所得NBS序列与已知核桃NBS抗病蛋白同源性为77%-99%,与其它物种的NBS抗病蛋白同源性在49%-66%。氨基酸序列多重比对分析表明,所得核桃NBS序列均包含有抗病基因所具有的典型功能域,如P-loop、kinase-2、kinase-3和GLPL等,在典型功能域的核苷酸多态性（Pi）明显低于非保守区,有较高保守性。系统发育分析表明,在核苷酸水平上可将所得核桃优系的NBS序列区分为7类,在氨基酸水平上可分TIR和non-TIR两大类7个亚类;所得核桃NBS序列非同义替换率(dN)和同义替换率(dS)的比值dN/dS在0.00-0.95,为纯化选择。氨基酸序列相似性表明核桃优系不同NBS亚类间的相似度为28.3%-63.5%,与已知抗病基因相应区域的氨基酸相似性为22.0%-48.5%。【结论】核桃NBS类抗病基因类似物与炭疽病抗性相关联,NBS序列与其他物种抗病基因有较高同源性,包含抗病基因保守的功能域,在进化上为纯化选择。